全 文 ：收稿日期:2007-07-16
作者简介:邵四海(1982-),男,山东郓城人,硕士研究生,研究方向:兽医微生物学
通讯作者:孔繁德(1967-),男,高级兽医师,博士;E-mail:kongfd67@163.com,0592-5675955
犬瘟热(Caninedistemper,CD)是由犬瘟热病毒(Caninedistempervirus,CDV)引起的犬科(犬、狐、貉
等)、鼬科(水貂、雪貂、黄鼬等)、灵猫科(果子狸)及一部分烷熊科动物的一种急性、亚急性、高度接触性传
染病,是当前对养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业危害最大的疫病之一[1]。CDV是负链单股不分
节的 RNA病毒,属于副粘病毒科麻疹病毒属成员[2],是由 caré于 1905年首次分离发现,近些年,CD及其
CDV的研究一直是犬、毛皮动物、野生动物传染病防治的研究热点。
该病诊断比较困难,因为经常存在混合感染(如与犬传染性肝炎等)和细菌性继发性感染而使临诊表
现复杂化。根据流行病学资料和临床症状,可以做出初步诊断,包涵体检查是诊断 CD的辅助方法,但若需
确诊,还需通过病毒的分离、病毒特异性抗原及特异性核酸检测,但是病毒的分离周期长,而且分离培养相
对比较困难。而 CDV快速检测通常用 RT-PCR,Real-timeRT-PCR(RRT-PCR)是近年来发展起来的新技术,
它的应用范围很广泛,包括 mRNA表达的研究、DNA拷贝数的检测、单核苷酸多态性(SNPs)的测定等[3],
SYBRGreenIRT-PCR又是常用的 RT-PCR方法,本实验就是试图建立快速、简便、灵敏度高、特异性好的
SYBRGreenI荧光 RT-PCR检测方法。
SYBRGreenI荧光RT-PCR检测犬瘟热方法的建立和应用
邵四海 1,2 孔繁德 2 吴德峰 1 陈琼 3 徐淑菲 2 温海 4
(1福建农林大学动物科学学院,福州 351002;2厦门出入境检验检疫局,厦门 361012;
3厦门市农产品质量安全检验测试中心,厦门 361009;4公安部南京警犬研究所,南京 210085)
摘 要: 根据GenBank发表的犬瘟热病毒(CDV)的F基因序列,经过分析在F片段的保守区域内设计引物,建立
了SYBRGreenI荧光RT-PCR检测CDV的方法,并通过对厦门市宠物医院收集的临床发病和疑似发病的犬病料(包
括眼分泌物、鼻拭子、唾液、血液、尿液等)的检测,结果表明,本研究建立的快速检测 CDV的SYBR GreenI荧光RT-
PCR方法具有特异性强、灵敏度高、操作简便等优点,值得推广应用。
关键词: SYBRGreenI RT-PCR CDV
DevelopmentandApplicationofSYBRGreenRT-PCRMethod
toDetectofCanineDistemperVirus
ShaoSihai1,2 KongFande2 WuDefeng1 ChenQiong3 XuShufei2 WenHai4
(1ColegeofAnimalScience,FujianAgricultureandForestryUniversity,Fuzhou351002;2XiamenEntry-exitInspectionand
QuarantineBureau,Xiamen361012;3XiamenAgriculturalProductQualityandSafetyTestingCenter,Xiamen361009;
4NanjingPolicedogInstituteoftheMinistryofPublicSecurity,Nanjing210085)
Abstract: AccordingtotheFgenesequencesofGenBank,primersweredesignedinconservedFgeneregionto
developSYBR GreenⅠRT-PCR MethodtodetectofCanineDistemperVirus.wehavetriedtoestablishaconvenient
methodtodetectCanineDistemperVirusandSYBR GreenIRT-PCR ofFgenewasdonewithsamplesfrom Pet
ClinicofXiaMenincludingThroat、trachealswabsandsoon.Theresultsshowedthatvirusesfrom thesickdogscould
beconfirmedbySYBRGreenⅠRT-PCRMethodexactlyanditisanconvenientmethod.
Keywords: SYBRGreenI RT-PCR CDV
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第1期
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 病料样本 来源于厦门市文记、康宝、百拓等多家宠物医院就诊的发病和疑似发病犬。
1.1.2 CDV细胞毒 由公安部南京警犬研究所提供。
1.1.3 仪器和试剂 仪器:ABI7300型荧光定量 PCR仪,台式高速冷冻离心机(BECKMAN),电泳仪,凝胶
成像系统,GeneAmp9700普通 PCR仪(ABI)等。
试剂:PowerSYBRGreenPCRMasterMix试剂盒(ABI公司),RNA提取试剂盒(OMEGA),HotStartTaq
酶(TaKaRa),100bpDNALadderMarker(TaKaRa),AMV反转录酶,dNTP混合物等由大连宝生物公司提供。
1.2 实验方法
1.2.1 引物的设计合成 根据 GenBank发表的 CDVF基因序列和相关文献报道,用 DNASTAR软件分
析其同源性,在保守序列内,用 PrimerExprss2.0设计了一对特异性高的引物,扩增产物为 105bp(表 1),
由大连宝生物公司合成。
表 1 引物概况
1.2.2 病料的采集 取病犬的血液(加抗凝剂),于后肢胫外侧皮下静脉采血,并滴加 1~2滴抗凝剂。取少
量发病动物的尿液、唾液、鼻拭子、粪便、眼分泌物、急性和亚急性 CDV感染活犬的背和颈部毛。
1.2.3 病毒 RNA提取 vero细胞培养的 CDV和送检病料的总 RNA的制备均采用 OMEGA公司的经典总
RNA提取试剂盒,具体操作步骤按照试剂盒说明书进行。
1.2.4 SybrGreenⅠ RT-PCR检测 CDV方法的建立 反转录:在 20μl体系中加入下列成分:5×Bufer4μl,
2.5mmoL/LdNTP加 4μl,反转录抑制剂 1μl,AMV(5U/μl)反转录酶 2μl,特异下游引物(20μM)1μl,模板
5μl,最后加 DEPC水至 20μl。42℃60min后,冰水中冷却 2min。
SybrGreenⅠ RT-PCR方法的建立:在 12μl反应体系中,加入 SybrGreenⅠPCR反应混合液 6μl,上下
游引物各 1μl,cDNA1μl,DEPC水 3μl。在 95℃10min,然后 95℃15s,60℃1min条件下,反应 40个循环。
反应体系引物浓度的摸索:分别将引物稀释成 20μM,10μM,5μM,2.5μM四个梯度,加 1μl到上述
PCR体系中,确定最佳引物的浓度。
引物特异性的检验:通过在扩增时增加设置溶解曲线判断所设计的引物的好坏,是否有非特异性的扩
增和引物二聚体的出现。
反应灵敏性:将 CDV反转录产物进行 10~
1000000倍的稀释,取 1μl加到上述 PCR体系中
扩增,确定反应灵敏性。
1.2.5 临床样本的检测 对临床收集的样本(包
括尿液、唾液、鼻拭子、粪便、眼分泌物、血液等),
提取 CDV核酸后用建立的检测方法多进行检测。
2 结果
2.1 引物浓度的摸索
将引物稀释成四个梯度浓度,PCR反应结果
见图 1,可以看出,在 5μM时是最佳反应浓度。
图1 引物梯度反应结果
注:1代表5μM 2代表2.5μM 3代表10μM 4代表20μM
182
2008年第1期
2.2 引物特异性的检验结果
通过图 2溶解曲线可以看到,在 PCR反应中
只扩增出单一峰,没有非特异性扩增产物和引物
二聚体的出现。
2.3 敏感性实验
将反转录产物进行 10倍系列稀释后的扩增
效果(图 3),可以看到 SYBRGreenⅠ RT-PCR灵
敏度可以到 1000000倍的灵敏度。
2.4 临床样本的检测结果
对采集的临床样本包括尿液、唾液、鼻拭子、
粪便、眼分泌物、血液等多进行扩增后电泳结果
可以看到预计的目标条带(图 4),其中在样本检
测中,发现眼睛分泌物的检出率是最高的,尿液
的检出率最低,而其它样本都能不同程度的检测
到病毒的存在。
3 分析和讨论
荧光实时定量 PCR具有检测范围宽,敏感性
高(<5拷贝),精确度高(<2%),无 PCR后处理步
骤,避免了交叉污染,产出率高,可以进行多重检
测等优点[4],使其在基础研究和分子生物学诊断
领域受到青睐,成为当今研究 mRNA表达水平最
热门的技术之一。
SYBR-GreenI是一种能插入到双链 DNA并
发出强烈荧光的化学物质,其荧光强度的增加与
双链 DNA的数量成正比。当它没有结合上双链
DNA时,只发出相对弱的荧光;然而,当它一旦插
入到双链 DNA里时,荧光信号将会强烈地增加,从而根据荧光信号的增强来计算 PCR扩增产物的增加[5]。
与 TaqMan方法相比,SYBR-GreenI的优势在于它能监测任何双链 DNA序列的扩增,不需要探针的设计,
使检测方法变得简便,同时也降低了检测的成本,与普通 PCR相比,SYBRGreen实时荧光定量 PCR不需
要 PCR后续的电泳步骤,减少了污染的可能性。然而正是由于荧光染料能和任何双链 DNA结合,因此它
也能与非特异的双链 DNA(如引物二聚体)结合,使试验容易产生假阳性信号。但通过严格控制引物质量
和设计对照能很好地解决。本实验设计的引物通过溶解曲线可以看到很好的避免了引物二聚体的产生,具
有很高的特异性,而且灵敏度高,重复性好,达到了预期的效果,可以在动物发病的早期和发病期间很准确
检测到犬瘟热病毒,为临床预防和治疗犬瘟提供更可靠的依据。
参考 文献
1 AppelMJ,GilespieJH.VirolMonogr,1972,11:1~96.
2 夏咸柱.养犬大全[M].吉林:吉林人民出版社,1993,549~553.
3 RzezutkaA,MizakB.VetMicrobiol,2002,88(1):95~103.
4 KleinD.TRENDSinMolecularMedicine,2002,8:257.
5 ZhangX,SchwarzEM,YongDA,eta1.JournalofClinicalInvestigation,2002,109(11):1405～1415.
邵四海等:SYBRGreenI荧光RT-PCR检测犬瘟热方法的建立和应用 183