全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2009年第 4期
ACC脱氨酶的作用机理和转基因的应用
王海滨 王平 陈永华
(中南林业科技大学,长沙 410004 )
摘 要: ACC脱氨酶是一种抑制乙烯生物合成的胞内酶, 目前在植物体内尚未发现该酶。其作用机理涉及植物体内乙
烯生成的蛋氨酸循环途径,在植物的保鲜、寿命延长、以及对 Cu、Fe、Zn、Co、N i、Pb、Cd等重金属的吸附等方面起着重要的作
用。就 ACC脱氨酶的基因特征、在蛋氨酸循环途径中作用机理、以及转基因应用等方面进行了系统的阐述,并对今后进一步
研究提出了适宜的建议。
关键词: ACC脱氨酶 乙烯 蛋氨酸循环途径 转基因应用
The FunctionM echanism and Transgenic Application of ACCdeam inase
W angH aibin W ang P ing Chen Yonghua
(Central Sou th University of Forestry and T echnology, Changsha 410004)
Abstrac:t ACCdeam inase is an endoenzym e tha t can be ab le to reduce biosynthesis o f ethy lene, and has not been d iscovered in
p lant body Its func tion m echan ism invo lves in me th ion ine c irculating path o f b iosynthes is o f plant e thy lene A lso, it p lays im po rtant
function in keeping plant fresh, life span extension and adsorb ing heavym eta ls conta in In this paper, the gene character istic o f ACC
deam inase, function m echanism of m ethion ine c irculating path and transgen ic applica tion w ere system atica l summ arized, and feasib le
suggestions fo r fu rther researches w ere presented
Key words: ACCdeam inase Ethy lene M eth ion ine circu lating path T ransgenic applica tion
收稿日期: 20081013
基金项目:国家科技部 ( 2007DFA91420) ,国家林业局 948!项目 ( 2005431 ) ,中南林业科技大学青年科学研究基金重点项目 ( 2008001A) ,湖
南省环境科学学科建设项目
作者简介:王海滨 ( 1981) ,男,山西阳泉人,硕士研究生,研究方向:生物化学与分子生物学
通讯作者:王平 ( 1964) ,男,湖南常德人,教授,理学博士,博士生导师,长期从事生物技术,生物医药及环境科学方面的教学与研究工作; T e:l
07315623472, Em ai:l cs fuw p@ 163 com
ACC脱氨酶是从土壤的假单孢菌 (P seudomonas
sp) [ 1]中分离出来的一种可以将 ACC分解成为
酮丁酸和氨的酶。在 ACC为惟一碳源的培养基上
筛选菌株,能正常生长的菌株中含有 ACC脱氨酶。
K lee等 [ 2 ]首先将此酶转入番茄植物中, 获得了转基
因的番茄果实,乙烯生物合成的抑制率达 97%, 果
实成熟明显延迟。ACC脱氨酶的优势之处在于它
破坏 ACC,而不是靠反义抑制, 因此, 它具有通用
性,可用于不同的作物, 使用范围。最近 Jia等 [ 3, 4]
从青霉菌 (P enicillium )中得到了 ACC脱氨酶,发现
它与 P seudomonas sp及土星汉逊酵母 (H ansenula
saturnus)中的 ACC脱氨酶分别有 50%和 54%的同
源性。可见自然界中也存在着多种类型的 ACC脱
氨酶, 目前至少发现了 3种, 但在植物中尚未发现。
但是,在植物的保鲜、花卉的延缓衰老、提高植物的
生物量增加对重金属的吸收量等方面的应用非常
广泛。
1 ACC脱氨酶的基因特征
ACC脱氨酶 ( 1氨基环丙烷1羧酸脱氨酶 )在
GenBank中 (登录号: AF047710 )的基因序列全长 1
017 bp, 编码 338个氨基酸, 是抑制乙烯合成前体
ACC的合成的一种胞内酶, 其分子量为 35~ 42 kD,
辅酶为 5磷酸毗哆醛 (维生素 B5 )。除 ACC外, 一
些 D型的氨基酸, 如 D丝氨酸、D半胱氨酸也可以
作为 ACC脱氨酶的底物, 而 L丝氨酸则是该酶的有
效竞争性抑制剂。X射线分析 ACC脱氨酶含有两
个结构域。每一个都含有一个开放的类似于色氨酸
合酶的亚基,而不象其它的磷酸毗哆醛依赖酶,并且
2009年第 4期 王海滨等: ACC脱氨酶的作用机理和转基因的应用
磷酸毗哆醛辅酶深埋在蛋白分子当中。酶上的两个
主要的氨基酸残基,包括 162位的丝氨酸, 位于两个
结构域之间的沟壑中; 52位的赖氨酸是磷酸毗哆醛
的结合位点。
自 1978年 Honma等 [ 5]发现 ACC脱氨酶以来,
已先后在多种土壤微生物中,如细菌、真菌和酵母发
现该酶的存在,其中包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性
菌、根瘤菌及真菌 [ 6~ 8] ,但并不意味着所有的这些微
生物都具有 ACC脱氨酶的活性。Fujino[ 9 ]的研究表
明,从 Pyrococcus horikoshii中克隆的 ACC脱氨酶基
因在 E scherichia co li中表达, 大肠杆菌虽然具备了
D丝氨酸脱氨酶的活性,但并不能表现出 ACC脱氨
酶活性。目前尚未在植物中发现 ACC脱氨酶。
该酶最早是从土壤细菌 P seudomonas sp中分
离出来的一种可以将 ACC分解成 丁酮酸和氨的
酶。目前 ACC脱氨酶已在部分微生物中得到了分
离和纯化,其生化特性也已基本明确,其中大部分是
从该酶的结构上分析所得, 特别是通过对酵母中该
酶的晶体结构分析获得。Gr ichko等 [ 10]通过对来自
阴沟肠杆菌 ( Enterobacter UW4) ACC脱氨酶基因的
序列分析,表明该基因上游含有在转录过程中起调
控作用的几个特征: 半个 CRP( cAMP recepto r pro
tein)结合位点, 1个 FNR ( fumaraten itrate reduction)
调控蛋白结合位点, 1个 LRP( leuc ine responsive reg
u latory prote in)结合位点和 1个类似 LRP蛋白的编
码区。
2 ACC脱氨酶的作用机理
21 乙烯的生化特性
乙烯是化学结构简单的不饱和碳氢化合物,具
有很强的生理活性。乙烯不仅是健康细胞的正常代
谢的产物,而且在感病的植物组织和衰老的植物组
织中也产生乙烯。一般植物组织中乙烯含量不超过
01 ppm,但在成熟的果实中有大量积累, 迅速促进
果实的成熟。此外,乙烯对偏上生长、促进脱落、器
官衰老、调节性别转变、形成侧根、叶片变黄、促进开
花、休眠等都有一定的作用,因此乙烯被列为 植物
激素!。
22 乙烯的生物合成
221 合成途径 1964年 Liebereman等就提出乙烯
来源于蛋氨酸 (M et), 1979年 Admas和 Yang[ 11]发现 1
氨基环丙烷1羧酸 ( 1am inocyc lopropane1carboxyl
ate, ACC)是乙烯生物合成的直接前体, 并确定了植物
体内乙烯生成的蛋氨酸循环途径。通过研究苹果组织
Met代谢发现, M et在空气中能有效的转变为乙烯,在
N2中却只形成甲硫核糖 (MTR)和 ACC。在有氧条件
下, ACC能迅速被组织氧化成乙烯,从而确定了植物体
中乙烯生物合成的途径:蛋氨酸作为乙烯生物合成的
前体,在 S腺昔蛋氨酸 ( SAM )合成酶作用下生成 SAM;
ACC合成酶催化 SAM形成 ACC, ACC由 ACC氧化酶
催化形成乙烯。ACC合成酶 ( ACC synthase, ACS)和
ACC氧化酶 ( ACC ox idase, ACO, 也称乙烯形成酶,
EFE)是乙烯生物合成途径中的关键酶。
ACC是乙烯生物合成的重要中间产物,除了形
成乙烯外,还可由丙二酸基转移酶催化形成 N丙二
酞1氨基环丙烷1羧酸 (MACC ), 在 谷氨酞转
肤酶催化下转化为 1( L谷氨酞氨基环丙烷 1羧
酸 ) ( GACC ); 在 ACC脱氨酶作用下转化为 丁酮
酸和氨气,降低 ACC含量进而控制乙烯的生成。
222 合成途径的调节 乙烯生物合成过程受到
多种内外因素的调节, ACC是形成乙烯的直接前
体,所以 ACC的形成是乙烯产生的限速步骤。最近
发现,植物体内 ACC除了游离态外, 还有以结合态
存在,即 ACC与丙二酸结合形成 ( 1丙二酰织基 )环
丙烷1羧酸 ( MACC ) , MACC 不能被逆转生成
ACC,因而不能用来再形成乙烯。因此, MACC的形
成是调节植物体内乙烯产生的重要内部因素之一。
乙烯生物合成还受到外部因素的调节,如施加适量
的生长素可以诱导乙烯的产生, 这是由于生长素能
增强 ACC合成酶的活性所致。此外, 细胞分裂素、
赤霉素、充足的氧气以及适当的温度 ( 28 ~ 30∀ )
等, 都能促进乙烯的形成。
抑制乙烯生成的因素包括缺氧条件、氮气、CO2、
AVG(氨基乙氧基乙烯基甘氨酸 )、AOA(氨基氧乙酸 )、
MVG(甲氧基乙烯甘氨酸 )、钻离子 ( Co2+ )、解偶联剂
( DNP)以及低温等。目前 AVG等已被用于防止脱落、
延长果实贮存期等方面。另外,当植物受到伤害 (如切
割或压力 )后,组织内乙烯的量可增加 10~ 100倍,即
伤乙烯!的形成。在逆境如高温、干旱、电离辐射等条
件下,植物体内的乙烯也会增多,这是对不良环境的一
种适应,称为 逆境乙烯!。有人认为,伤乙烯和逆境乙
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2009年第 4期
烯是由于植物细胞受到伤害后由膜中的脂肪酸 (包括
亚油酸 )在酶的作用下转化而来的,也可能是液泡中的
蛋氨酸在液泡膜破裂后被释放到细胞质中,与乙烯合
成酶接触后转化为乙烯所致。
3 ACC脱氨酶的应用
ACC脱氨酶使用范围广, 代谢产物不会对植物
生长和其它性状产生不利的影响, 另外该酶在动物
体内很快被降解,不存在人们所担心的 安全性 !问
题,因此其研究越来越受到人们的重视。
31 植物的保鲜
常规保鲜措施通常是利用物理或化学的手
段 [ 12] ,如低温冷藏,气调贮藏,辐射处理,保鲜剂处理
等来抑制果实的呼吸,延缓果实的呼吸跃变。但是物
理保鲜手段需要一定的保鲜设备和仪器, 成本较高;
化学保鲜手段又存在化学药剂的残留,长久食用不利
人体健康的问题。因此,增强植物本身耐贮保鲜的能
力,是近年植物保鲜的热点问题之一。
O eller等 [ 13 ]利用番茄中克隆到的 ACC合成酶
基因 L ACC 2, 反向插入到 caMV35S启动子和 NOS
终止子之间,再与 PB I101相连, 转化番茄子叶并获
得转基因植株; K lee等 [ 2 ]将 ACC脱氨酶基因正向导
入番茄中得到转基因植株, 乙烯的生物合成被抑制
达 97%,其果实成熟比对照明显推迟至少 6周; 此
外,通过根癌农杆菌介导将 ACC脱氨酶基因分别转
入番茄 [ 14, 15 ]青花菜 [ 16] , 哈蜜瓜 [ 17] , 白兰瓜 [ 18] , 获得
的转基因植株均表现出不同水平的 ACC脱氨酶
活性。
继保鲜番茄转基因植株获得以来,利用各种保
鲜基因来增强果品的保鲜耐贮能力, 已成为保鲜技
术中的一个新的研究热点和发展的新方向。例如新
疆甜瓜转保鲜基因的研究将能够解决植物保鲜中的
间题, 延长植物的利用率, 为实现植物的可持续利用
提供有利保障。
32 花卉的延缓衰老
人类进入 21世纪, 生活已达到小康水平,花卉
业已成为国民经济发展的一个新的增长点, 被称为
朝阳产业 !。目前花卉的采切后储运保鲜主要是
采用物理法,包括低温冷藏、气调法及降压法等;化
学法包括使用抗蒸腾剂、乙烯吸附剂及活性氧清除
剂等。物理方法存在设备费用较高的特点, 而化学
法又会造成环境污染, 且保鲜效果也不很理想。利
用生物基因改造的方法对花卉的生理过程进行调节
使之延缓衰老,既不需要昂贵的仪器设备,也不会造
成环境的污染,又具有良好的保险效果。同时,与转
基因粮食、蔬菜、饲料作物相比, 花卉植物的转基因
产品更易投放市场,实现产业化, 因而具有广阔的应
用前景。云南大学黄海泉 [ 19]、范志强 [ 20]等将 ACC
脱氨酶基因转入矮牵牛花中获得转基因植株, 并对
ACC脱氨酶基因在延缓花衰老方面进行基因工程
研究,初步建立了农杆菌叶盘法介导转基因体系。
33 增加植物的生物量
促生根际菌具有广泛的应用价值, 属于根际细
菌 ( PGPR)的微生物体内均含有 ACC脱氨酶, 通过
多种方式影响植物的生长 [ 21~ 24] , 具有 ACC脱氨酶
活性的 PGPR可以保护植物避免生物及非生物的胁
迫, 包括有水胁迫、重金属、盐碱胁迫及植物病原体
的侵害等。L in等 [ 25]的研究发现, 用 ACC脱氨酶活
性菌处理番茄种子,可以促进幼苗的芽与根的延长,
以及增加幼苗的鲜重、干重、叶绿素及蛋白的含量,
从而提高番茄在盐胁迫条件下的耐性。 Gr ichko
等 [ 26]用具有 ACC脱氨酶活性的菌株处理番茄后,
其根的生长,乙烯生成量、叶绿素含量、根的生长及
生长曲线等结果均表明, 番茄具有更好的耐性。其
原因可能是 ACC脱氨酶活性菌降低了植物体内
ACC的含量水平,与此同时还改变了受体水平植物
对乙烯的敏感性。Mayak等 [ 27]对盐胁迫下植物的
生理状况研究发现,具有 ACC脱氨酶活性的菌株处
理番茄后可以显著提高在高盐浓度下番茄的鲜重及
干重,并有效地降低了由盐分引起的乙烯的影响,增
加了水的利用率,增加了磷和钾的吸收,从而缓解了
盐对幼苗的损害。
在转基因作物方面也有相当多的研究, 如
Varvara等 [ 28]研究表明,能够表达具 ACC脱氮酶活性
菌的基因的番茄 (Ly copersicon esculentum )可以在含有
重金属 Cd、Co、Cu、N i、Pb和 Zn的土壤中进行生长,
并富集这些金属。
4 展望
至目前为止,所克隆的 ACC脱氨酶基因主要集
中于草本植物,如各种草本花卉和农作物等,而对木
本植物的基因克隆的研究较少, 只限于从一些原核
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2009年第 4期 王海滨等: ACC脱氨酶的作用机理和转基因的应用
细菌, 如阴沟肠杆菌、假单孢菌等中分离克隆得到。
此外,来自不同细菌的 ACC脱氨酶同源性很差或者
根本就无同源性,因此,对该酶的作用机理尚需进一
步研究。
利用基因工程手段将 ACC脱氨酶基因转入目
的植物中获得理想表型的植株是此基因应用的核
心。由于此基因于乙烯相互调节, 使人们在食品保
鲜、延长可观赏花卉的寿命等方面获益非浅。此基
因的表达还可以促进生长素 IAA等的合成, IAA等
生长素又必须在 Cu、Fe和 Zn等重金属的催化下合
成,此外, Cu可以直接降解乙烯, 而其它的 N i、Pb、
Cd等在植物体内是其它酶的有效竞争或抑制剂。
所以,转 ACC脱氨酶基因植物可以富集这些金属达
到治理土壤或湿地重金属污染的目的。这是利用基
因工程手段的重金属超富集植物修复技术, 是当前
研究的热点领域之一。
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