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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 12期
观赏桃 ISSR2PCR反应体系的优化
林玲 汤浩茹　刘燕 候艳霞
(四川农业大学园艺学院 ,雅安 625014)
　　摘 　要 : 　采用改良 CTAB法从观赏桃满天红叶片中提取基因组 DNA ,通过单因素实验探讨了模板 DNA、M g2 + 、dNTPs
和 Taq DNA酶等条件对观赏桃 ISSR2PCR扩增结果的影响 ,建立了 ISSR2PCR扩增的最佳体系 : 25μl反应体系中包含 10 ×
Buffer 215μl,模板 DNA 40 ng,M g2 +浓度 215 mmol/L ,引物浓度 014μmol/L , dNTPs浓度 014 mmol/L , Taq DNA酶 015 U。利
用所建立的体系对红叶桃、菊花桃和春艳等 13份材料进行检验 ,其结果表明优化后的体系适合观赏桃的 ISSR2PCR反应。
关键词 : 　观赏桃 DNA提取 ISSR 体系优化
Optim ization for ISSR2PCR Reaction Conditions of Ornamental Peach
L in L ing Tang Haoru L iu Yan Hou Yanxia
( Horticultural College, S ichuan Agricultural University, Ya’an 625014)
　　Abs trac t: 　The imp roved method CTAB was used to extract DNA from leaves of ornamental peach mantianhong. The research dis2
cussed different componentspieffect to the DNA amp lification, including p rogram temp late, p rimer, dNTPs, Taq polymerase and Mg2 + ,
through ladder experiments. The reaction conditions were op tim ized and then the op timal PCR system for ISSR analysis was established
as follows, total volume 25μl, 215μl 10 Buffer, 40 ng temp late DNA, 215 mmol/L Mg2 + , 014 mol/L Primer, 014 mmol/L dNTPs, and
015 U Taq DNA polymerase. The op timal PCR system was tested by 13 samp les, showing that it performed satisfactorily on ornamental
peach.
Key wo rds: 　O rnamental peach DNA extraction ISSR Op timal PCR system
收稿日期 : 2009209207
基金项目 :国家大学生创新性实验资助项目 (081062613)
作者简介 :林玲 (19862) ,女 ,在读硕士研究生 ,主要从事园艺植物种质资源与生物技术的研究 ; E2mail: hdnea@yahoo. com. cn
通讯作者 :汤浩茹 ,男 ,教授 ,博士生导师 ; E2mail: htang@ sicau. edu. cn
　　观赏桃 ( Prunus persica Batsh)是原产我国的古
老观赏植物之一 ,其花、叶、果都有很高的观赏价
值 [ 1 ]。随着经济的发展和社会的进步 ,人们对观赏
桃的需求量也日益增大 ,对观赏桃的色、香、形等奇
异的新品种的需求也日益强烈。然而观赏桃树生命
周期长 ,树体高大 ,基因高度杂合 ,遗传背景复杂 ,许
多重要的经济性状是受多基因控制的数量性状 [ 2 ]。
目前 ,对观赏桃的基因组了解很少 ,许多重要的经济
性状的遗传方式还不清楚。而分子标记技术以其简
单、快捷、实用等优势而成为植物遗传育种领域研究
的有力工具之一。利用分子标记技术对不同观赏桃
品种间 DNA水平上的多态性资料进行统计分析 ,可
以了解其在遗传上的同源程度 ,确定其亲缘关系和
进化地位 [ 3 ] ,为观赏桃的品种改良、种质资源保存
以及新品种的培育奠定基础。其中 , ISSR ( inter2sim2
p le sequence repeats)是继 SSR后发展出来的新型分
子标记 [ 4 ]。但由于 ISSR是基于 PCR的一种标记技
术 ,其稳定性受许多因素的干扰 [ 5 ] ,而且许多因子
在不适合的条件下会导致图谱弥散背景的产生、扩
增产物消失等 [ 6 ]。目前 ,有关 ISSR体系优化在许多
物种中均有报道 [ 5 ] ,但不同植物 ISSR最佳反应体系
的差别较大。为此 ,本试验通过对观赏桃 ISSR2PCR
反应体系的优化 ,完善该植物基因组 DNA的 ISSR
研究 ,为进一步对观赏桃遗传多样性、亲缘关系分析
研究以及新品种的培育奠定基础。
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2009年第 12期 林玲等 :观赏桃 ISSR2PCR反应体系的优化
1 材料与方法
1. 1 供试材料与试剂
满天红、红绣球、春艳、菊花桃、红叶桃、垂枝 3、
满红、春红、垂枝 2、绛桃、垂枝 4、月季桃、垂枝 1共
13份观赏桃材料 , 2008年从郑州果树研究所引进 ,
保存于四川农业大学教学科研园区。2009年 3月
15日～25日晴天上午取嫩叶片 ,于 - 20℃保存。体
系优化试验选取满天红叶片为材料。
乙二胺四乙酸二钠 ( ethylene diam ine tetraacetic
acid, EDTA)、十六烷基三甲基溴化铵 ( cetyl triethyl2
ammonium brom ide, CTAB )、氯化钠、无水乙醇、硼
酸、氯仿、异戊醇、醋酸钠、β2巯基乙醇等试剂为国产
分析纯 ;脱氧核苷三磷酸 ( dNTPs)和 10 bp随机引
物购自上海申能博彩生物科技公司 ;琼脂糖、核糖核
酸酶 A溶液 (RNase A液 )和 Taq DNA聚合酶 ( Taq
DNA polymerase)购自天根生化科技 (北京 )有限公
司 ,所用引物由英俊公司合成。
1. 2　DNA提取
采用 CTAB法提取观赏桃叶片基因组 DNA, CTAB
方法参照文献 [ 7 ]。
1. 3　DNA质量检测
将提取的 DNA样品适当稀释 ,在核酸蛋白质分
析仪上检测 OD260 /OD280及 DNA 的浓度 [ 8 ] ; 采用
112%的琼脂糖凝胶进行电泳 [ 9 ] ,溴化乙锭 ( ethidi2
um brom ide, EB )染色 ,在凝胶成像系统下拍照检测
DNA的降解程度和 RNA消化情况。
1. 4　 ISSR2PCR反应体系的优化
首先确立初始反应体系 ,即 PCR总体积为 25
μl,其中含模板 DNA 30 ng,Mg2 +浓度 210 mmol/L,
引物浓度 014 μmol/L , dNTPs浓度 013 mmol/L,
TaqDNA酶 115 U和 10 ×Buffer215μl,其余以去离
子水补足至 25μl。在此基础上 ,以 880 ( GGAGAG2
GAGAGGAGA)为引物 ,对反应体系中的模板 DNA、
引物、dNTPs、Mg2 +和 Taq DNA聚合酶分别设置了不
同浓度梯度 ,进行单因素优化试验并确定最适用量。
具体设计见表 1。
表 1　 ISSR反应条件的优化
试验因子 水平
Mg2 +浓度 (mmol/L) 110 115 210 215 310
dNTPs浓度 (mmol/L) 011 012 013 014 015
DNA模板浓度 ( ng/μL) 10 20 30 40 50
引物浓度 (μmol/L) 011 012 014 016 018
Taq DNA酶浓度 (U) 015 110 115 210 215
1. 5　 ISSR2PCR程序与产物检测
PCR扩增反应在 Eppendorf热循环仪上进行 ,
反应程序参考肖祖梅 [ 10 ] ,并做一定修改 : 94℃预变
性 4 m in, 94℃变性 1 m in, 52℃退火 1 m in, 72℃延伸
2 m in, 40个循环 , 72℃继续延伸 10 m in, 12℃保存。
采用 112%的琼脂糖凝胶电泳 ,取 5μl扩增产物与
1μl上样缓冲液混匀 ,恒压 (U = 120 V )电泳 2 h,经
EB染色 ,在凝胶成像仪 ( SYNGENE)下观察 ,拍照。
2 结果与分析
2. 1　DNA提取分析
采用 CTAB法提取观赏桃叶片基因组 DNA , 13
份材料提取得到的 DNA 颜色均为近白色 , OD260 /
OD280均在 117～119之间 (表 2) ,说明蛋白质、酚、
多糖等杂质去除的较干净 , DNA质量较高。DNA电
泳条带都较整齐、清晰 ,均无明显拖尾现象 (图 1) ,
表明 DNA完整且无明显降解 ,可用于 ISSR分析。
表 2 D NA样品浓度和纯度的测定结果
编号 样品 OD260 /OD280 浓度 (μg/μl)
1 满天红 1178 2 150. 00
2 红绣球 1. 80 3 380. 00
3 春艳 1. 87 3 785. 00
4 菊花桃 1. 70 3 345. 00
5 红叶桃 1. 76 2 115. 00
6 垂枝 3 1. 71 1 915. 00
7 满红 1. 83 4 205. 00
8 春红 1. 78 2 980. 00
9 垂枝 2 1. 73 3 290. 00
10 绛桃 1. 75 3 030. 00
11 垂枝 4 1. 76 2 815. 00
12 月季桃 1. 73 2 580. 00
13 垂枝 1 1. 90 4 575. 00
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 12期
图 1　13份观赏桃 D NA电泳图 (样品编号如表 2所示 )
2. 2 反应体系对 ISSR扩增的影响
在观赏桃 ISSR2PCR 反应体系中 , Mg2 + 浓度的
变化对 ISSR扩增条带的数量和强弱的影响较大。
试验结果表明 (图 22A) ,当 Mg2 +浓度在 110 mmol/L
时 ,无扩增条带出现 ;当 Mg2 + 的浓度为 115 ～210 mmol/L时 ,扩增条带数目和亮度均有增加 ;当 Mg2 +的浓度增加至 215 mmol/L时 ,扩增条带数目多且清晰稳定 ;而当 Mg2 +的浓度增加至 310 mmol/L时 ,弥散的现象加重。因此 ,本试验中确定的 Mg2 +浓度为215 mmol/L。
图 2　观赏桃 ISSR2PCR体系优化
　　图 22B表明了 dNTPs浓度对扩增的影响。当
dNTPs浓度为 011 mmol/L时 ,扩增条带数目较少 ,
且有拖尾现象 ;当 dNTPs浓度增加到 013 mmol/L和
014 mmol/L时扩增结果基本一致 ,扩增条带数目较
多 ,但 014 mmol/L时谱带更清晰 ;而当 dNTPs浓度
增加到 015 mmol/L时 ,条带严重缺失 ,亮度也有较
大的减弱。因此 ,综合考虑电泳带的质量 , dNTPs浓
度以 014 mmol/L为最佳。
试验在其它因素不变的条件下 ,将模板 DNA设
计 5个梯度 (10 ng、20 ng、30 ng、40 ng、50 ng) ,结果
表明在这一范围内均有扩增谱带 (图 22C)。当浓度
为 40 ng时 ,谱带最为清晰和稳定 ;当模板浓度在
50 ng时 ,出现非特异性扩增 ,非特异性产物过多会
形成背景 ,造成弥散型产物。所以 ,适合观赏桃 IS2
SR分析的 DNA模板浓度为 40 ng。
引物浓度对 ISSR扩增的影响的结果如图 22D所
示。当引物浓度为 011μmol/L时 ,扩增条带有严重
的缺失 ,亮度也很弱 ;当引物浓度升高到 012μmol/L, 条带数目和亮度都有所增加 ;当浓度为 014μmol/L时 ,条带最为清晰与完整 ;当引物浓度为 016和018μmol/L时 ,条带清晰但都有缺失。本着遵循条带清晰、经济的原则 ,确定最佳引物浓度为 014μmol/L。Taq DNA聚合酶的用量对试验结果的影响也较大。试验结果 (图 22E)表明 :浓度为 015 U时 ,条带最清晰完整 ,亮度最高 ; 但当浓度增加到 210 及215 U时 ,条带出现弥散趋势。从试验效果和试验成本的角度考虑 ,经重复比较试验确定 ,最终选用 TaqDNA聚合酶的用量为 015 U。综合上述试验结果 ,得出观赏桃 ISSR2PCR的最佳反应体系为 : 25μl总反应体系中 ,Mg2 +浓度为215 mmol/L , dNTPs浓度为 014 mmol/L , DNA模板浓度为 40 ng,引物浓度为 014μmol/L , Taq DNA聚合酶的用量为 015 U , 10 ×Buffer 215μl,其余用去离子水补充。2. 3 优化后的 ISSR2PCR反应体系的扩增结果采用优化后的 ISSR2PCR反应体系 ,以引物 868
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2009年第 12期 林玲等 :观赏桃 ISSR2PCR反应体系的优化
( GAAGAAGAAGAAGAAGAA )为模板 ,对 13份观赏
桃材料进行扩增 ,得到了清晰、明亮、多态性丰富的
ISSR谱带 (图 3) ,并具有较好的重复性 ,说明优化
后的体系适合观赏桃的 ISSR2PCR反应。
图 3　引物 868的 ISSR扩增电泳图谱
3 讨论
不同物种因基因组 DNA的质量、大小及浓度不
同 ,所要求的 ISSR2PCR的最佳反应条件也不一样。
ISSR反应的影响因子较多 ,本试验着重研究了
Mg2 +浓度、dNTPs浓度、DNA模板浓度、引物浓度以
及 Taq DNA酶浓度 5种主要成分对 ISSR扩增的影
响。一般认为模板 DNA、引物和 dNTPs等 3种因素
适宜用量的范围较宽 ,该试验结果也印证了这一点。
试验中还发现 ,模板含量对 ISSR2PCR反应影响不
大 ,但如果浓度低于一定范围时 ,由于分子碰撞的几
率降低 ,偶然性大 ,扩增产物无或不稳定 [ 11～13 ]。引
物浓度的变化实质上是改变了引物与模板配对几
率 ,从而影响扩增效果。因为引物作为 PCR增体系
中的重要组成成分 ,它的不足会降低与模板 DNA接
触的机会 ,可能会造成多态性位点的遗漏 ,不能进行
有效扩增而导致扩增产物偏少 ;而过多的引物可能
会引发碱基错配 ,还会导致引物二聚体的形成 ,并与
靶序列竞争 DNA聚合酶和底物 dNTPs,从而使靶序
列的扩增量降低 [ 14, 15 ]。Mg2 +浓度对扩增的影响很
大 ,在 PCR反应中 ,Mg2 +还对引物与 DNA模板的结
合效率、模板与产物的解链温度、产物的特异性和引
物二聚体的形成有影响 [ 16 ] ;而 dNTPs作为 PCR的
原料 ,其浓度变化对 ISSR带的数量和强弱的影响较
大。当 dNTPs浓度过高时 ,会螯合大量的 Mg2 + ,使
实际反应中的 Mg2 +浓度下降而影响聚合酶的活性 ,
最终将导致扩增量减少 ,甚至整个反应失败 ;但过低
的 dNTPs浓度 ,又会影响合成效率 ; TaqDNA酶用量
是重要的因子 ,它直接影响多态性的检出率和扩增
结果的重复性及忠实性 [ 17 ]。
通过优化反应体系 ,建立了重复性好 ,稳定性高
的观赏桃 ISSR 反应体系 ,即 25 μl反应体系中 ,
Mg2 +浓度为 215 mmol/L, dNTPs浓度为 014 mmol/
L , DNA模板浓度为 40 ng,引物浓度为 014μmol/L,
Taq DNA聚合酶的用量为 015 U , 10 ×Buffer 215μl,
其余用去离子水补足。反应程序 : 94℃预变性
5 m in, 94℃变性 1 m in, 52℃退火 1 m in, 72℃延伸
2 m in; 40个循环 ; 72℃继续延伸 10 m in, 12℃保
存。上述反应体系和扩增程序具有较强的可重复
性 ,为进一步开展观赏桃种质资源、遗传多样性、
品种鉴定和育种等各方面的研究奠定了基础。同
时 ,为增加试验的可比性和稳定性 ,对同一引物扩
增时 ,应尽量选择同一家公司同一批次的试剂和
药品。
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