全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 1期
魔芋葡甘露低聚糖的酶法制备工艺的初步研究
吴长菲1 董岩岩 1 李俊俊 1 唐湘华 1, 2, 3, 4 黄遵锡 1, 2, 3, 4
( 1云南师范大学生命科学学院,昆明 650092; 2生物能源持续开发利用教育部工程研究中心,昆明 650092;
3云南省生物质能与环境生物技术重点实验室,昆明 650092; 4云南师范大学酶工程重点实验室,昆明, 650092)
摘 要: 利用 甘露聚糖酶产品水解魔芋胶制备魔芋葡甘露低聚糖的工艺条件。在加样顺序、pH、酶添加量、时间、温
度等单因素试验的基础上,进一步通过正交试验确定的最佳工艺条件为: 魔芋胶浓度 10 g /L, 酶添加量为 100 U /g, pH55,
45 条件下, 酶解时间 15 h。再利用酵母发酵去除可发酵性糖的方法,以获得最终产物为 100%的魔芋葡甘露低聚糖。
关键词: 甘露聚糖酶 魔芋胶 魔芋葡甘露低聚糖
Study on the Preparation ofKonjacO ligoglucomannan by Mannanase
W u Chang fei
1
Dong Yanyan
1
L i Junjun
1
Tang X ianghua
1, 2, 3, 4
Huang Zunx i
1, 2, 3, 4
(
1
School of Life Sciences, Yunnan N ormal University, K unming 650092; 2Engineering Research Center of Sustainable
D evelopm ent and Utilization of B iomass Energy, M inistry of Education, K unm ing 650092;
3
K ey Laboratory of Yunnan for
B iomass Energy and Biotechnology of Environm ent, Kunm ing 650092;
4
K ey Laboratory of
Enzymatic Eng ineering, Yunnan N ormal University, Kunming 650092)
Abstrac:t In this paper, the preparation of Konjac O ligog lucom annan w as studied by hydro ly zing konjac gum using M an
nanase. The prepara tion conditions we re optim ized by onew ay ana lys is w ith adding sequence, pH, enzym e added, tim e, temperature, and
o rthogona l experim ent. Under the conditions of kon jac gum w ate r so lution 10g /L, mannanase 100 IU / g, pH 55, enzymo lysis in 45
for 15 h. The u ltim a te hydro ly sate is 100% o f oligog lucom annan through e lim ina teing saccharide of ferm entab le w ith yeast ferm enta
tion.
Key words: m annanase Konjac gum O ligog lucom annan.
收稿日期: 20091010
基金项目:云南省应用基础研究计划重点项目 ( 2006C0004Z)
作者简介:吴长菲,女,在职硕士研究生,主要从事微生物酶工程研究; Em ai:l w cf2003929@ 163. com
通讯作者:黄遵锡,男,教授,博士生导师,主要从事发酵工程、酶工程及基因工程方向教学科研工作; Em ai:l huangzunx@i 163. com
甘露聚糖酶又称 1, 4D甘露聚糖酶 ( 1,
4Dm annanmannanohydro lase, EC. 3. 2. 1. 78) ,是一
类能够水解含有 1, 4D甘露糖苷键的甘露寡糖、
甘露多糖的内切酶, 属于半纤维素酶类 [ 1] , 广泛存
在于动植物和微生物中。魔芋精粉的主要成分是魔
芋葡甘露聚糖 ( kon jac g lucomannan, KGM ) [ 2] , 它是
一种由 D葡萄糖和 D甘露糖按 1!16或 1!17的
摩尔比,以 1, 4糖苷键连接成主链并含有 1, 3
糖苷键支链的高分子不均一多糖 [ 3, 4]。魔芋精粉中
魔芋葡甘露聚糖含量可达到 70% - 80%,相对分子质
量为 2 ∀ 105 - 2 ∀ 106 (随魔芋精粉原料来源不同而
异 ) [ 5]。魔芋低聚糖 (m anno ligosaccharides, MOS)是
甘露聚糖酶水解魔芋胶的产物 [ 6]。 甘露聚糖酶
可将魔芋胶降解成 2- 10个单糖单位, 以 1, 4或
1, 3糖苷键连接而成, 具有直链或支链的魔芋葡
甘露低聚糖 [ 7]。试验证明, 魔芋葡甘露低聚糖除了
具有低热量、稳定、安全无毒等良好的理化性质外,
还具有促进以双歧杆菌为代表的有益菌群的增殖,
改善肠道内菌群结构,减少有毒发酵产物及有害细
菌酶的产生, 增强机体的免疫力和抗氧化能力 [ 8]。
魔芋葡甘露低聚糖有一定的甜度, 能替代蔗糖和葡
萄糖,但又会不使血糖升高。相关试验显示,魔芋葡
甘露低聚糖能降低糖尿病小鼠血糖和改善血液成
分 [ 9] , 可明显降低小鼠血清总胆固醇和甘油三酯水
2010年第 1期 吴长菲等:魔芋葡甘露低聚糖的酶法制备工艺的初步研究
平 [ 10]以及高脂小鼠血脂含量和血尿素氮水平 [ 6 ]。
因此, 用以防治肥胖、高血糖、高血脂、动脉硬化及冠
心病等病症。
近年来发现,低聚糖对动物健康和生产机能的
促进作用,就某些方面来说并不亚于抗生素,且为绿
色食品,因而低聚糖不论作为功能性食品或是作为
动物饲料添加剂均具有广阔的市场前景。我国是魔
芋生产国,魔芋资源丰富, 开发我国甘露低聚糖将有
较大的社会效益和经济效益 [ 11]。目前主要利用酶
法生产葡甘露低聚糖,主要优点是副反应少,成本低
等。利用 甘露聚糖酶产品对魔芋胶水解条件进
行了研究并对其工艺条件进行了优化, 以期为工业
化生产提供理论依据。
1 材料和方法
11 主要材料
魔芋精粉来自云南金田原魔芋精粉厂; 甘露
聚糖酶购自昆明爱科特生物科技有限公司, 酶活力
> 2 500U /g; D甘露糖和槐豆胶购自 S igma公司; G
型硅胶板购自青岛海洋化工厂分厂; 酿酒高活性干
酵母购自安琪酵母股份有限公司; 其他试剂均为国
产分析纯。
12 主要仪器与设备
分光光度计 ( UV722型 )、精密 pH仪、恒温水浴
锅、电炉和电子天平。
13 方法
131 酶活力测定 以 05%槐豆胶为底物, pH
55, 45 恒温水浴中反应 15 m in,采用 DNS法测定
酶解产生的还原糖量。在上述试验条件下, 以每分
钟水解底物产生 1 mo l还原糖 (以甘露糖计 )所需
的酶量定义为一个 甘露聚糖酶活单位 ( U )。
132 魔芋胶水解产物还原糖浓度的测定 不同
条件下的魔芋胶中加入适量单位的酶液 (酶量以
每克魔芋精粉计 ) , 于特定温度下酶解一段时间后
取样,样液经适当稀释后用 DNS法测定酶解液中
还原糖 (以甘露糖计 )的含量。还原糖转化率计算
公式:
还原糖转化率 (% ) =酶解液中还原糖的量 ( g) /
魔芋精粉的量 ( g)
133 酵母发酵法去除单糖 微生物发酵法是利
用葡甘露低聚糖的难发酵性, 选择合适的微生物
(如酿酒酵母 )将酶解产物中的甘露糖、葡萄糖等可
发酵性糖发酵成酒精除去, 以提高魔芋葡甘露低聚
糖的纯度 [ 12]。酵母发酵方法: 在待处理的魔芋胶酶
解液中添加酵母膏 20 g /L、蛋白胨 40 g /L、NaC l
02 g /L、MgSO4 7H2O 02 g /L、KH2 PO4 05 g /L,自
然 pH, 121 高压蒸汽灭菌 30m in,冷却后接种 10 g /
L的高活性干酵母,置于旋转式摇床上180 r/m in、30
培养 24 h[ 2]。
134 酶解产物定性检测 魔芋胶酶解液经煮沸
灭酶活, 离心, 取上清液点样至硅胶板 ( 100 mm ∀
100 mm, G型 )上, 于正丁醇 ( v ) !冰乙酸 ( v ) !水
( v ) = 2!1!1的展层剂中展层 2- 3次, 喷洒苯胺二
苯胺 磷酸显色剂中显色 ( 100 , 15m in)。
2 结果与讨论
21 影响酶解效率的单因素分析
211 加样顺序的影响 1%的魔芋胶在 45 , pH
55条件下, 按 200U /g的比例加酶,按不同加样顺
序对魔芋胶酶解 1 h,测定还原糖含量, 结果见表 1。
结果表明,现配魔芋胶后加酶液的方法比其他方法
所产生的还原糖及其转化率要高, 故选择现配魔芋
胶后加酶液的加样顺序为最佳方法。以下试验如无
特殊说明均按此加样顺序配制。
表 1 加样顺序对还原糖转化率的影响
加样顺序 还原糖含量
(m g /mL )
还原糖
转化率 (% )
魔芋胶 (溶胀 1 h后 ) +酶液 4889 # 0059 4889 # 059
魔芋胶 (现配 ) +酶液 5030 # 0067 5030 # 067
酶液 +魔芋精粉 4382 # 0027 4382 # 027
酶粉 +魔芋精粉 +缓冲液 4526 # 0055 4526 # 055
212 魔芋胶浓度的影响 配制浓度为 05%,
10% , 15%, 20%, 25% , 30%, 35%, 40% 魔
芋胶,按 200 U /g的比例加入酶, 45 , pH 55条件
下酶解 1 h,测定其还原糖的含量结果见图 1。由图
1可以看出在 05% - 1%还原糖转化率呈上升趋
势, 还原糖的转化率在魔芋胶浓度为 10%时达到
最大,之后继续增加浓度, 还原糖的转化率却随之
降低。
213 酶解 pH的影响 调配成不同 pH的 1%的
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 1期
魔芋胶,按 200 U /g的比例添加酶, 45 恒温水浴中
酶解 1 h,测定还原糖含量,结果见图 2。结果表明,
还原糖的转化率呈抛物线状变化, 在 pH55时达到
最高值。在不同 pH条件下,除该酶在最适 pH时可
发挥其最大活性外,酶活性都有不同程度损失,使得
酶解能力下降,进而导致还原糖浓度随之下降。
214 酶添加量的影响 向 1%的魔芋胶中加入
不同量的 甘露聚糖酶于 45 , pH55条件下, 酶
解 1 h, 测定还原糖含量,结果见图 3。结果表明,当
酶量在 50- 200 U /g时, 还原糖转化率随酶量的增
加而升高,但当酶量超过 200 U /g时,还原糖转化率
没有太大的变化, 可能是由于酶用量为 200 U /g时
已将魔芋胶中的甘露聚糖全部转化为甘露低聚糖,
故增大酶的用量无显著影响。
图 3 酶添加量对还原糖转化率的影响
215 酶解时间的影响 向 1%的魔芋胶中按 200
U /g的比例加入酶,于 45 , pH55条件下酶解, 每
隔 30 m in取一次样测定还原糖含量, 结果见图 4。
由图可以看出,在 05- 35 h间还原糖转化率迅速
上升, 35- 4 h之间还原糖转化率上升趋于平缓, 4
h以后,还原糖的转化率下降。说明酶促反应主要
集中在反应的 05- 35 h之间, 而当酶解时间达到
4 h后,魔芋胶中的葡甘露聚糖已经被完全降解为魔
芋葡甘露低聚糖,继续增加酶解时间对还原糖的浓度
影响不大。但由于本试验的目的是为了获取高含量
的魔芋葡甘露低聚糖,而尽量减少葡萄糖和甘露糖等
单糖的量,所以需控制魔芋胶的酶解程度 [ 13]。所以
在本试验条件下选择魔芋胶水解率在 50%左右的酶
解时间 1 h。
图 4 酶解时间对还原糖转化率的影响
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2010年第 1期 吴长菲等:魔芋葡甘露低聚糖的酶法制备工艺的初步研究
216 酶解温度的影响 向 1%的魔芋胶中添加
200U /g的 甘露聚糖酶,于 pH55条件下,置于不
同温度下酶解 1 h, 测定还原糖含量, 结果见图 5。
结果表明,在 45 下酶解还原糖的转化率最高, 与
此酶的最适温度基本相符,低于或高于此温度,由于
酶活力损失,酶解能力下降,从而还原糖的转化率也
有不同程度地下降。
图 5 酶解温度对还原糖转化率的影响
22 正交试验优化魔芋胶酶解条件
选取酶添加量、酶解时间、酶解 pH和酶解温度
4种因素作正交试验优化,以期获得最适的酶解条
件。据此设计了 L9 ( 3) 4的正交试验, 见表 2。影响
因素: 酶解 pH > 酶解时间 >酶添加量 >酶解温度;
最佳条件为 A 1B2 C2D2。故酶解得最佳条件:酶添加
量为 100 U /g, pH55, 45 , 酶解时间 15 h,在此条
件下还原糖转化率可达到 5165% (表 3)。
表 2 酶解因素的 L9( 3) 4正交分析表
水平
因 素
A
酶量 ( U /g)
B
酶解时间 ( h)
C
酶解 pH
D
酶解温度 ( )
1 100 1 0 45 35
2 150 1 5 55 45
3 200 2 0 65 55
表 3 酶解因素的正交分析试验条件
试验
编号
A
酶量
B
时间
C
pH
D
温度
还原糖转化率
(% )
1 1 1 1 1 4279
2 1 2 2 2 5165
3 1 3 3 3 4371
4 2 1 2 3 4802
5 2 2 3 1 4784
6 2 3 1 2 4316
7 3 1 3 2 4738
8 3 2 1 3 1420
9 3 3 2 1 4527
K1 13815 13819 10015 13590
K2 13902 11369 14494 14008
K3 10685 13214 13893 10593
R 1072 8 17 1493 11 38
23 酶解产物定性检测
231 酶解液酵母发酵前后还原糖量的变化 选取
酶添加量为 100 U /g, pH55, 45 条件下,酶解时间
15 h后的酶解液样品, 并利用酵母发酵法去除酶解
液中的可发酵性还原糖,结果发现,在相同酶解时间
下,酵母发酵后的还原糖量比发酵前的低,相对降低量
为 569%,这是由于酵母发酵消耗了可发酵性还原糖。
232 酶解液酵母发酵前后硅胶薄层层析定性检测
分别取葡萄糖, D甘露糖,糊精标准液以及酶解液 (酵
母发酵前和发酵后 ),进行硅胶板薄层层析检测,结果
见图 6。由图 6可见,酵母发酵后单糖斑点消失 (第 5
泳道 ),说明酵母发酵能有效地去除酶解液中的可发
酵性单糖。除了单糖斑点消失外, 还可看出二糖斑点
也消失了,说明酵母发酵也能利用还原性的二糖。
1.葡萄糖; 2. D甘露糖; 3.糊精; 4.酶解产物 (酵母发酵前 ) ;
5.酶解产物 (酵母发酵后 )
图 6 酶解产物的硅胶薄层层析
121
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3 结论
单因素分析试验了加样顺序对还原糖转化率的
影响, 结果发现配魔芋胶后加酶液的方法比其他方
法所产生的还原糖及其转化率要高, 故选择现配魔
芋胶后加酶液的加样顺序为最佳方法。
甘露聚糖酶能很好降解魔芋葡甘露聚糖为魔
芋葡甘露低聚糖。在单因素试验的基础上, 进一步
通过正交试验确定酶水解魔芋胶制备魔芋葡甘露低
聚糖的最佳工艺条件为魔芋胶 (水溶液 )浓度 10 g /L,
酶添加量为 100 U /g魔芋精粉, pH 55, 45 条件
下,酶解时间 15 h。在此条件下, 酶解产物主要为
2- 10个单糖单位以 1, 4或 1, 3糖苷键连接而
成的魔芋葡甘露低聚糖。
对酶解产物的硅胶薄层层析分析后发现, 酶解
产物中多为二糖以上的分子,有少量单糖产生,这与
已报道的的结果相符。魔芋胶酶解产物中少量的可
发酵性单糖及二糖可利用酵母发酵法除去。由硅胶
薄层层析结果表明, 通过酵母发酵有效地去除了酶
解产物中少量的可发酵性单糖及二糖, 使最终酶解
产物为 100%的魔芋葡甘露低聚糖。
参 考 文 献
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