全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 12期
hGH2双精氨酸 C肽人胰岛素原基因的
克隆表达及纯化研究
胡兵 1, 2 黄超 1, 2 李文静 1, 2 　邓柳红 2 肖苏生 2 张春发 2
(1海南大学农学院 ,海口 570228; 2中国热带农业科学院热带生物技术研究所 ,海口 571101)
　　摘 　要 : 　旨在提高基因重组人胰岛素在大肠杆菌中表达的稳定性及表达包涵体蛋白的复性水平。在人胰岛素原 N端
前融合人生长素 N端的一段序列来充当前导肽 ,同时将 C肽设计为两个精氨酸 ,分 10段合成长链寡核苷酸链 ,利用重叠延伸
PCR技术 ( SOE PCR)扩增得到该基因片段。与表达载体 PET230a连接 ,转化 E. coli BL21 (DE3) , IPTG诱导表达。表达的融合
蛋白采用 N i2NTA亲和层析纯化 ,纯化后的蛋白经复性、冻干等步骤后用胰蛋白酶 ,羧肽酶 B双酶切再过 DEAE Sepharose Fast
Flow阴离子交换柱 ,收集洗脱峰。对制备所得的胰岛素用 SDS2PAGE,W estern blot进行性质鉴定 ,及皮下注射小鼠测定生物活
性。结果显示 ,目的蛋白在大肠杆菌 BL21 (DE3)中得到了表达 ,表达产物以不溶性包涵体形式纯在 ,约占大肠杆菌总蛋白的
30%。经 N i2NTA亲和层析得到的重组蛋白纯度为 85% , DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换纯化得到单组分胰岛素。
W estern B lot显示制备所得的胰岛素具有胰岛素免疫原性 ,皮下给药注射小鼠活性测定表明具有明显的降血糖活性。获得了
一种高效生产基因重组人胰岛素的方法 ,为研究胰岛素类似物奠定了前期基础同时也为今后探索胰岛素的非注射给药途径
提供了原料。
关键词 : 　hGH2双精氨酸 C肽人胰岛素原 重叠延伸 PCR 融合蛋白表达 纯化 活性测定
Study on Clon ing, Expression and Purif ication of hGH2double
Arg C Peptide Human Proinsulin Gene
Hu B ing1, 2 Huang Chao1, 2 L i W enjing1, 2 　Deng L iuhong2 Xiao Susheng2 Zhang Chunfa2
(1 Agricultural college, Hainan University, Haikou 570228; 2 Insititute of Tropical B ioscience and B iotechnology, CATAS, Haikou 571101)
收稿日期 : 2009209207
作者简介 :胡兵 (19842) ,男 ,江西抚州人 ,硕士研究生 ,研究方向 :基因工程药物的开发 ; E2mail: hubing007hb@163. com
通讯作者 :张春发 (19532) ,男 ,研究员 ,博导 ,研究方向 :生物技术与药用基因工程 ; E2mail: zhang2cs@hutmail. com　　Abs trac t: 　 It was to enhance the stability of recombinant human insulin exp ressed in E. coli and imp rove renaturation efficiency ofinclusion body p rotein of human insulin. The sequence which is sim ilar to the N2term inal of human growth hormone ( hGH) was integrat2ed onto human insulin as as p recursor pep tide. A t the same time, the C2pep tide is rep laced with two arginines, to construct hGH2doubleA rg C pep tide human p roinsulin gene. The high efficiency exp ression vector exp ressed in E. coli BL21 (DE3) successfully induced byIPTG. . Then the exp ressed fusion p rotein was purified by N i2NTA Affinity chromatography. After renaturation, and freeze2dried p roce2dures, the purified p rotein was digested by tryp sinase and carboxypep tidase B. A t last, the digestion p roducts were under DEAE Sepha2rose fast flow purification p rocedure to get purified human insulin, and biological activity was carried out by injecting m ice directly. Re2sults demonstrated that the recombinant p rotein was exp ressed in E. coli BL21 (DE3) successfully in the form of insoluble inclusionbodies, accounting for about 30% of total p roteins in E. coli. The purity was up to nearly 85% by using N i2NTA affinity chromatography.W estern B lot showed that the recombiant p rotein possessed insulin antigenicity, and the subcutaneous injection of m ice showed the insu2lin have a significant ability to lower blood glucose. Thus, we achieved a app roach to p roduce recombinant human insulin efficiently,which lay a theoretical foundation for the study of all kinds of insulin analogues as well as p rovide raw materials for the future exp lora2tion of Non2injecting route.Key wo rds: 　hGH2double A rg C pep tide human p roinsulin　SOE PCR　Fusion p rotein exp ression　Purification　B ioactivity de2term ination
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2009年第 12期 胡兵等 : hGH2双精氨酸 C肽人胰岛素原基因的克隆表达及纯化研究
胰岛素作为治疗糖尿病的特效药 ,在体内是由
胰岛素原经胰蛋白酶和羧肽酶 B 酶解而成。胰岛
素是由 21个氨基酸的 A链和 30个氨基酸的 B链
通过 3对二硫键组成 ,其中 A、B链之间有两对 (A72
B7, A202B19) , A 链内一对 (A62A11) ,其胰岛素仅
含有 51个氨基酸其单独表达在 RNA水平 ,蛋白水
平不稳定 ,容易降解 ,故考虑在人胰岛素原蛋白前融
合上人生长素 N端的一段序列。本实验室经过初
步筛选发现与人生长素 ( hGH ) N端前 56个氨基酸
具有 8715%同源性的一段序列能很好地行使前导
肽的功能 ,促进胰岛素前体中二硫键的正确重组配
对。同时 ,在该前导序列和胰岛素原 N端设计一个
碱性氨基酸 (A rg) ,以便在复性后能和 C肽一起被
切除仅通过一步纯化得到胰岛素 ( h I)。
进一步证实了“胰岛素的 A , B链含有足够的使
二硫键配对的结构信息 ”的观点 ,将胰岛素原的 C
肽在 6个氨基酸的基础上进一步减少到两个精氨
酸 ,以期获得活性较好的胰岛素。真核基因在大肠
杆菌中表达最大的缺陷是重组蛋白以没有活性的包
涵体的形式存在 ,需要经过复杂的复性处理。因此 ,
对复性条件进行了探索。这为今后本课题组对胰岛
素基因进行改造 ,研制速效、长效胰岛素奠定了前期
基础。
1　材料与方法
111　材料
11111　质粒与菌株 pMD182T simp le vector购于
TaKaRa公司 ; pET230a, E. coli DH5a和 E1coli BL21
(DE3)均为本实验室保存。
11112　酶和主要试剂 Taq聚合酶 ,各种限制性内
切酶 , T4 DNA连接酶均购于大连宝生物工程有限公
司 ;胰蛋白酶 ,羧肽酶 B 购于上海生物工程服务技
术有限公司 ; 琼脂糖胶回收 ,质粒小提试剂盒和
HRP2DAB增强型底物显色试剂盒均为天根生化科
技 (北京 )有限公司产品 ;引物合成和 DNA 测序均
由上海英骏生物工程公司完成 ;胰岛素抗体购于美
国 Abcam公司 ;胰岛素标准品购于通化东宝有限公
司 ;它试剂都为国产或进口分析纯。
112　方法
11211 hGH2双精氨酸 C肽人胰岛素原基因的获取
　根据已知的氨基酸序列和大肠杆菌的偏好密码子
设计并合成 10段长链寡核苷酸片段 ,并将合成的引
物稀释成 10 pmol/μl的溶液 , - 20℃保存待用。将
合成的寡核苷酸片段各取 1μl加入 25μl的 EP
管中 , 70℃加热 5 m in,然后迅速置于冰上 5 m in,
用 T4 Polynucleo tide Kinase建立磷酸化反应。
将以上磷酸化的寡核苷酸片段用 PCR纯化试
剂盒纯化后 , 94℃加热 1 m in,缓慢退火至室温 ,用
T4 DNA L igase在 16℃下连接过夜。
以 Klenow片段完成中间补链和末端补平同时
设计一对引物 ,并在两端引入 EcoR I和 H ind III的
酶切位点扩增该基因便于连接到载体上。
11212　hGH2双精氨酸 C肽人胰岛素原基因的亚克
隆及表达载体的构建 将 PCR产物胶回收与 pMD
182T simp le vector连接后 ,双酶切 T载体回收小片
段与经相同酶酶切后的表达载体 pET230a相连 ,挑
阳性克隆送上海英骏公司测序。
11213　工程菌的诱导和表达 挑取阳性克隆单菌
落 ,接种于含 50 mg/L Kan的 LB 液体培养基中
37℃振荡培养过夜 ;次日将菌液按 1∶100的比例接
种于 50 m l含 50 mg/m l Kan的 LB液体培养基中 ,
37℃继续培养至 OD 值约 016 时 ,加入终浓度为
014 mmol/L诱导 6 h后收集菌体进行 SDS2PAGE电
泳 ,考马斯亮蓝 R2250染色。
11214　hGH2双精氨酸 C肽人胰岛素原的纯化 收
集诱导表达的菌体 ,将细胞悬浮于细胞超声波破碎
液 ( 50 mmol/L Tris2HCl pH810; 1 mmol/L EDTA )
中 ,超声破碎离心收集包涵体沉淀 ,用包涵体洗涤液
(50 mmol/L Tris2HCl pH810; 2 mmol/L脲素 0115%
TritonX2100)洗涤 3次。得到的包涵体沉淀溶解于
8 M脲中 ,离心取上清。用 0145μm细菌过滤器除
去颗粒 ,所得到的为包涵体脲溶液。取上述包涵体
的脲溶液过 N i2NTA柱亲和层析 ,分别收集穿流峰
和洗脱峰 ,取少量收集样品跑 SDS2PAGE进行纯化
效果的评价。
11215　hGH2双精氨酸 C肽人胰岛素原的复性 将
收集的洗脱峰用复性液稀释成浓度成蛋白浓度
015 mg/m l, GSSG为 013 mmol/L ,复性体系中 GSH /
GSSG的比例为 5, pH值为 9101于 4℃复性 24 h,复
性后液体用截留范围为 8 000的透析袋透析除脲后
冻干。
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11216　hGH2双精氨酸 C肽人胰岛素原的酶解 取
10 mg上述冻干目的蛋白 ,加入 200 U 胰蛋白酶和
100 U羧肽酶 B , 15℃反应 12 h,经 DEAE 2Sepharose
Fast Flow阴离子交换层析分离 ,收集胰岛素峰 ,脱
盐冻干。
11217　制备胰岛素的性质鉴定 参照《分子克隆
实验指南 》将制备所得的胰岛素进行 W estern blot
分析。将含有胰岛素的凝胶用 NC膜湿转过夜 , 1%
BSA 4℃封闭过夜 ,以羊抗鼠胰岛素抗体为一抗 (稀
释倍数 1 000) 37℃孵育 1 h,再以 HRP标记的小鼠
IgG (稀释倍数 7 500倍 )为二抗 37℃孵育 45 m in,用
增强型 HRP2DAB底物显色试剂盒显色 30 m in确 定制备所得胰岛素的免疫原性。同时将制备所得的胰岛素皮下给药注射小鼠 ,用通化东宝甘舒霖基因重组人胰岛素做标准品进行生物活性测定。2　结果211　hGH2双精氨酸 C肽人胰岛素原基因的合成及扩增将人 hGH2双精氨酸 C肽人胰岛素原基因分 10个片段合成 ,其中 F1、F3、F5、F7、F9片段为正向链 ,F2、F4、F6、F8、F10片段为反向链 (图 1)。将各基因片段按等摩尔数混合经磷酸化、退火连接后 :以 Kle2now片段完成中间补链和末端补平 ,获得编码所需蛋白的完整基因片段 ,全长 327 bp。
F1, F3, F5, F7, F9片段为正向链 ; F2, F4, F6, F8, F10片段为反向链
图 1　hGH2双精氨酸 C肽人胰岛素原基因的分段合成
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2009年第 12期 胡兵等 : hGH2双精氨酸 C肽人胰岛素原基因的克隆表达及纯化研究
　　在该基因两端设计一对引物 ( pF, pR )并引入
( EcoR I/H ind III)酶切位点 PCR扩增该基因片段 ,
结果见图 1。
pF: CCCGAATTCATGTTCCCAACCATCCCGCT2
GTC (划线为 EcoR I酶切位点 )
pR: CCGAAGCTTTTAGTTGCAGTAGTTTTC2
CAGCTG (划线为 H ind III酶切位点 )
M1Marker DL2000; 1, 21目的基因 PCR产物
图 2　hGH2双精氨酸 C肽人胰岛素原基因的 PCR扩增
212　hGH2双精氨酸 C肽人胰岛素原基因的亚克隆
及表达载体的构建
将 PCR产物与 pMD182T simp le vector连接后挑
阳性克隆送测序 ,将测序正确无碱基突变的阳性克
隆质粒用 EcoR I/H ind III双酶切 ,凝胶电泳回收目
的片段后与经相同两种酶酶切后的 pET230a载体连
接、转化。根据 pET230a载体上的 T7启动子和终止
子序列设计特异引物进行菌液 PCR鉴定 ,扩增出的
片段大小大约为 700 bp,初步表明了设计基因片段
已连上表达载体 (图 3)。抽提质粒 DNA进行酶切
鉴定来进一步筛选阳性克隆 ,结果见下图 4。测序
结果与设计的序列完全一致 ,未发现有碱基突变。
M1DNA Marker DL2000; 1, 2. T7为引物的 PCR扩增产物
图 3　用 T7启动子 /终止子引物验证阳性克隆
M1DNA Marker DL15000; 1, 2. EcoR I, H ind III双酶切产物
图 4　表达载体的双酶切图
213　工程菌的诱导和表达
挑取阳性克隆单菌落接种于含 kan (50μg/m l)
的 LB 三角瓶中 ,于 37℃摇床振荡培养至 OD 为
016,加入终浓度为 014 mmol/L的 IPTG分别诱导
0, 3, 4, 5, 6 h各取 1 m l菌液离心收集菌体经超声波
破碎后取沉淀进行 SDS2PAGE分析表达情况 (图
5) ;分子量大小为 1816 kD。对表达的重组蛋白可
溶性分析结果见下图 6,结果表明目的蛋白几乎全
部以包涵体的形式存在于沉淀中。
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214　hGH2双精氨酸 C肽人胰岛素原的亲和层析纯化
由于表达载体是 pET230a,其在所表达的 hGH2
双精氨酸 C肽人胰岛素原 N端含有 6 ×H is2tag标
签 ,故采用亲和层析来纯化该融合蛋白。将经过超
声破碎的包涵体沉淀溶解于 8 M的尿素中 ,离心取
上清液经 0145μm 的细菌滤器过滤后上样于 N i2
NTA亲和层析柱 ,先用 10 mmol/L的咪唑洗涤柱子
收集穿流峰 , SDS2PAGE检测发现穿流峰中没有重
组蛋白条带。再用 500 mmol/L的咪唑洗脱收集第
2、3、4个洗脱柱体积 , SDS2PAGE检测重组蛋白主要
集中在第 2、3、4个洗脱柱体积 ;其中在第 3个洗脱
柱体积重组蛋白的含量最高 (图 7)。纯化的目的蛋
白纯度大概在 85%左右 ,这可能与 N i2NTA填料经
多次使用结合效率下降有关。
　　1. Flow peak;M. 蛋白质分子量标准 ; 2, 3, 4. 分别为第
2, 3, 4洗脱柱体积
图 7　表达蛋白经 N i2NTA亲和层析纯化后的
SD S2PAGE分析
215　hGH2双精氨酸 C肽人胰岛素原酶切后的纯化
将经过复性 ,冻干后的 hGH2双精氨酸 C肽人胰
岛素原经胰蛋白酶和羧肽酶 B酶切反应后上样于
DEAE2Sepharose Fast Flow阴离子交换柱 ,收集第 3
峰 (图 8)冷冻干燥后经 15% SDS2PAGE分析结果说
明该方法生产的人胰岛素 ( h I)纯度在 PAGE上表现
为一条带 (图 9)。
图 8　胰岛素的 D EAE2Sepharose Fa st Flow的柱层析
图 9　纯化得到胰岛素的 SD S2PAGE
216　纯化后人胰岛素的性质鉴定
21611　W estern blot对纯化获得的人胰岛素进行免
疫原性分析 以羊抗小鼠胰岛素抗体做一抗 ,小鼠
来源 HRP标记的 IgG做二抗对纯化得到的人胰岛
素进行免疫原性分析 ,结果见下图 10。
1. 阴性对照 ; 2. 制备所得胰岛素 ; 3. 胰岛素标准品
图 10　胰岛素的 W estern blot分析
21612　人胰岛素的生物活性测定 取饲养健康小
白鼠采用皮下多点注射给药对制备所得的胰岛素 ,
胰岛素标准品 ,无菌水进行活性测定 ,结果显示我们
制备所得的胰岛素具有很好的降血糖活性 (图 11) ;
注射剂量加大出现抽搐症状 ,及时灌喂葡萄糖症状
消失进一步证实了制备所得的胰岛素具有很好的降
血糖活性。
图 11　胰岛素的生物活性测定
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2009年第 12期 胡兵等 : hGH2双精氨酸 C肽人胰岛素原基因的克隆表达及纯化研究
3　讨论
针对胰岛素的研究一直以来都是国内外的研究
热点 ,利用大肠杆菌表达系统单独表达胰岛素这样
的小分子物质不稳定 ,容易在 RNA、蛋白水平被降
解。一般的做法是先克隆出人胰岛素原基因 ,再在
克隆出的人胰岛素原基因或者经过突变设计的人胰
岛素原基因的 5′端加上一段适当长度的序列 ,插入
质粒构建融合蛋白表达载体 ,转化大肠杆菌。经过
发酵表达来产生胰岛素原 ,获得的胰岛素原经胰蛋
白酶和羧肽酶 B等处理 ,去除中间 C肽和 N端肽段
得到胰岛素。长期以来人们认为 C肽对于胰岛素
A、B链的正确重组是必需的 ,W etzel等证实 6个氨
基酸的 C肽胰岛素原类似物具有与胰岛素一致的
放免测定活性 ,本研究中将 C肽缩减至 2个氨基酸
同样获得了有活性的胰岛素。前导肽是一类能够帮
助多肽的正确折叠 ,但又不是其功能性组装结构成
分的一类蛋白。在缺少它的情况下目标蛋白没有足
够的信息来完成正确的折叠。本研究在胰岛素原 N
端前引入一段前导序列 ,该序列与人生长素的 N端
前 56个氨基酸具有 8715%的同源性 ,试验结果证实 了这段序列能够很好地促进胰岛素前体的正确折叠 ,帮助胰岛素正确构象的形成。该研究除了得到一种高效生产具有生物活性人胰岛素的方法外 ,从某种意义上来说也获得了一前导肽序列 ,从而为其他重组蛋白类药物的生产提供了一个思路。参 考 文 献1　 Tikhonov RV, W ulfson AN, Kirp ichnikov MP. Journal of B ioorganicChem istry, 2008, 34 (1) : 56～59.2　 Q iao ZS, M in CY, Hua QX, et al. J B iol Chem, 2003, 278 ( 20 ) :17800～17809.3　王洪涛 ,怀文辉 ,茹炳根.南京农业大学学报 , 2004, 27 (3) : 125～127.4　陈雅惠 ,杜雅励 ,唐建国. 中国生物化学与分子生物学报 , 1999,15 (4) : 558～562.5　 Kemm ler W S, Peterson JD, Steiner DF. J B iol Chem, 1971, 246:6786～6791.6　 Chong S,Mersha FB, Comb DG, et al. Gene, 1997, 192 (2) : 271～281.7　 Chen Y, L i JZ, et al. Chinese B iochem ical Journal, 1995, 11 ( 6) :636～641.8　 W inter J, L ilie H, Rudolph R. FEMS M icrobiology Letters, 2002,(213) : 225～230.
(上接第 95页 )
验中几个试验号较好的结果进行对比试验 ,综合比
较 ,从而建立适合北方粳稻 RAPD分析的反应体系。
RAPD2PCR反应体系中的各组分均对 PCR扩
增产生一定影响 ,但从正交试验结果可以看出 ,
dNTP和 Taq酶浓度的影响更大。 dNTP是 PCR反
应的原料 ,浓度过低 ,偶然性大 ,扩增产物减少 ;浓度
过高 ,会导致聚合酶错误掺入 ,其特异性和精确性降
低。Taq酶浓度过高、过低都不利于 PCR扩增。浓
度过高引起非特异性扩增 ,且成本高 ,浓度太低则产
物合成量减少。因此 ,在试验中应严格控制 dNTP
和 Taq酶的用量。
另外 , RAPD反应体系的稳定性与试验条件有
很大关系 ,如不同的厂家、不同批次的试剂 ,仪器 ,及
试验材料 ,都可能对试验结果产生影响。因此 ,为保
证试验的精确性和重复性 ,在优化 PCR反应体系的
前提下 ,应尽可能的保持条件的恒定。
参 考 文 献
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