全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 4期
运用重叠延伸 PCR技术构建在甘丙肽全长
cDNA嵌入第二内含子的重构分子
雷小春 司苏晋 薛亮亮 刘田福
(山西医科大学实验动物中心,太原 030001 )
摘 要: 构建嵌入第二内含子的甘丙肽 ( Ga lanin, GAL )全长基因组 cDNA的重构分子。通过 RTPCR扩增出 cDNA编
区的序列, 分别从基因组中扩增出 cDNA的 5 和 3 端部分非编码序列; 使用重叠延伸 PCR ( over lap extention PCR, OEPCR )方
法将三个片段重叠获得全长 cDNA序列;再将全长 cDNA从第三外显子第 15个碱基处分成两部分, 分开的 cDNA前半部分和
后半部分以及第二内含子进行重叠延伸获得重构分子,含有第二内含子的甘丙肽 ( GAL )全长基因组 cDNA;将重构分子连入
pMDI9T sim ple载体。电泳分析观察到清晰的重构分子片段 ;测序显示重构分子由所设计的序列组成, 第二内含子插入的位
置准确, 且无移码。使用重叠延伸 PCR能够成功在 cDNA中插入内含子获得一段重构基因。
关键词: 重叠延伸 PCR 甘丙肽 内含子 重构分子
Construction ofRecombinantM olecule of Galanin Full Length
cDNA Including the Second Intron by OEPCR
LeiX iaochun S i Su jin XueL iang liang L iu T ianfu
( Labro tory AnimalC entro l of Shanx iM ed ical University, Taiyuan 030001)
Abstrac:t The study w as design to construct a recomb inan t gene composed o f ga lan in( GAL ) fu llleng th cDNA and the second in
tron of the ga lan in gene. F irstly, by RTPCR the cod ing cDNA sequence w as amp lified, and the 5 and 3 noncoding sequences o f Ga l
cDNA was am plified by PCR. Secondly, the fu lllength cDNA sequence w as ob tained by overlap extention PCR ( OEPCR ). Th ird ly, the
fulllength cDNA w as cuted in to two part a t the 15 bp o f the third exon and amp lified them respectiv ely. F ina lly, U sing the tw o pa rt of
the fu lllength cDNA and the second intron as a temp late by OEPCR, and the second intron was inse rted in to the ga lan in fu llleng th
cDNA, and the recom binant mo lecu le w as obta ined then c loned into pMD19T s imp le vector. The e lectrophoresis ana lysis illustra ted a
clear band of recom b inant mo lecu le fragm en t, and the squenc ing result proved that the recom binantm o lecule was com posed of the sec
ond intron and fulllength cDNA o f ga lanin. The inse rtion position of the second intron is accura tew ithout basem alpos ition. Therefore,
it proved that the Ga l recomb inant genew as obta ined successfully by OEPCR.
Key words: Over lap ex ten tion PCR Galan in Intron Reconstructed m o lecule
收稿日期: 20091218
基金项目:山西省实验动物专项基金资助项目
作者简介:雷小春,女,硕士研究生,研究方向:人类疾病动物模型; Em ai:l sandra1116@ 126. com
通讯作者:刘田福,男,教授,研究方向:人类疾病动物模型; Em ai:l ykd lt@f yahoo. com. cn
甘丙肽 ( ga lanin, GAL)是一种神经小肽,在中枢
和周围神经系统都有广泛分布。并与诸多疾病如阿
尔茨海默病、癫痫、高泌乳血症、抑郁和神经痛等的
发病机制相关,同时也与摄食、学习和记忆等功能相
关 [ 1]。随着研究的深入, 现已构建出许多甘丙肽转
基因的动物模型,研究热点主要集中于甘丙肽缺失
表达或者过表达模型中某些疾病相关的生理、病理
特征,定位甘丙肽在这些生理、病理过程中的作用。
深入研究内源性释放的甘丙肽的功能补充基于外源
性甘丙肽投药的复合研究, 可能为新的治疗策略提
供线索 [ 2, 3]。
转基因的小鼠制作过程中要构建的外源基因主
2010年第 4期 雷小春等 :运用重叠延伸 PCR技术构建在甘丙肽全长 cDNA嵌入第二内含子的重构分子
要包括两部分即调控序列和结构基因序列。迄今为
止有关的制作甘丙肽过表达的转基因小鼠的文献中
对于结构基因序列的选择各有不同, 有用全基因片
段的也有只用全长 cDNA的还有在 cDNA中插入一
段内含子的, 均取得了成功 [ 3- 5]。有文献表明在
cDNA中插入一到几个内含子可提高外源基因在动
植物体内的表达水平 [ 6- 9]。本研究在分析了 cDNA
各外显子表达产物的基础上 [ 12] , 尝试使用重叠延伸
PCR方法,将甘丙肽的第二内含子插入到第三外显
子中间,构建了如图 1所示的重构分子为下一步真
核表达和显微注射提供结构序列片段 [ 10, 11]。
注: 1- 6表示外显子,其中第三外显子分成两部分, 黑色部
分编码信号序列,灰色部分编码甘丙肽的前 13个氨基酸,
斜线部分为酶切位点,重构分子总长为 1 493 bp
图 1 甘丙肽全长 cDNA与待构建的重构分子
1 材料与方法
1. 1 供试动物及试剂
试验动物 C57小鼠购自山西医科大学实验动
物中心许可证号: SCXK (晋 20090001)。RNA iso
Reagen,t DNA Fragment Purificat ion K i,t DNAA Ta il
ing K i,t DNA W ide Range DNA M arker ( 100 -
6 000) , pMD19T S imp le Vector均购自 T aK aRa公
司; Phusion超保真聚合酶, Sal I, P st I限制性内切酶
购自 NEB公司; AMV反转录酶、RNA酶抑制剂购自
Promega公司; Q IAquick Gel Ex traction K it购自 Q ia
gen公司, P lasm idM in iK it购自 Omega公司; XGa lI、
PTG和 Amp购自 Amresco公司。
引物如表 1所示。
1. 2 重组分子的扩增策略
为了构建出在全长 cDNA嵌入第二内含子的重
构分子,要先从 RNA中反转录出甘丙肽的 cDNA的
编码序列 C片段,再以 DNA为模板扩增出 cDNA 5
和 3 非编码序列 A和 B片段,以 cDNA的 A、B、C片
段为模板通过重叠延伸 PCR扩增出全长 cDNA。由
于第二内含子需要插入的位点在第三外显子的第
15个碱基处, 没有合适的内切酶位点, 必需用 PCR
扩增的方法以所要插入位点两侧的 25个碱基作为
引物与扩增全长 cDNA的引物分别配对, 将插入位
点两端的片段切成两个片段 D和 E。片段 D和 E
再与第二内含子一起为模板通过重叠延伸 PCR扩
增重构分子 (图 2)。根据 GenBank上甘丙肽的基因
序列和 cDNA序列使用引物设计软件 O ligo6. 72设
计引物 (表 1) , 引物由北京奥科生物技术有限责任
公司合成。
表 1 引物序列表
片段名称 引物序列 ( 5 - 3 )
cDNA的 A片段 F: TGCAGTAAGCGACCATCCAG
R: AGCACAGGAACACACGTGCAC
cDNA的 B片段 F: TGCCACGGACACGTCGAGGCAT
R: GGAGGCAACCGCAGGAGGACTAGAG
cDNA的 C片段 F: TCCTGAGACCATGTCCACTG
R: ACCACACTGGAGGTGAGAG
全长 cDNA片段 F: TGCCACGGACACGTCGAGGGAT
R: ACCACACTGGAGGTGAGAG
cDNA的 D片段
F: TGCCACGGACACGTCGAGTGAT
R: GTCTTCTTTTCCGATCAGTACTTACTCT
CTTCTCCTTTGCAGGCATCCCA
cDNA的 E片段
F: CTAACCCTGTGTAATCCTGTTTTAGGGT
TGGACCCTGAACAGCGCTGGCT
R: ACCACACTGGAGGTGAGAG
第二内含子片段
F: TGGGATGCCTGCAAAGGAGAAGAGA
GTAAGTACTGATCGGAAAAGAAGAC
R: 5 AGCCAGCGCTGTTCAGGGTCCAA
CCCTAAAACAGGATTACACAGGGTTAG
重构分子
F: AAGGCGCCGGCGATATCCGGCCTG
GTCGACTGCCACGGACACGTAGAG
R: AACGTTTACGAACCTGCAGCGATACGCT
GCAGCATAGACG
1. 2. 1 RTPCR扩增 cDNA的 C片段 用 T aK aRa
的 RNA iso试剂、氯仿和异丙醇,从 C57小鼠的新鲜
脑组织中提取总 RNA, 纯度和浓度采用分光光度计
法测定。浓度为 1. 47 g /L, 纯度为 1. 98。使用
AMV反转录酶进行 cDNA第一链的合成。反应条
件为 48! 、30 m in, 95! 、5 m in, 4! 、5 m in; 用 Phu
sion超保真酶, 2 L的反转录液, 扩增出 cDNA序
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列的编码序列 C片段。反应条件: 98! 预变性 1
m in, 98! 、5 s, 65. 5! 、15 s, 72! 、30 s, 共 26个循
环, 72! 延伸 10m in。 1. 2%琼脂糖凝胶电泳鉴定,
测序。
图 2 重构分子的扩增策略
1. 2. 2 高保真扩增 cDNA的 A和 B片段及第二内
含子 用 TaKaR aDNA提取试剂盒从 C57小鼠的新
鲜脑组织中提取 DNA,纯度和浓度采用分光光度计
法测定。浓度为 0. 33 g /L, 纯度为 1. 78。使用
Phusion超保真酶扩增 cDNA 5 和 3 的非编码片段 A
和 B及第二内含子, A片段扩增条件为 98! 预变性
1 m in, 98! 、5 s, 61! 、15 s, 72! 、20 s, 共 25个循
环, 72! 延伸 10m in。B片段扩增条件为 98! 预变
性 1 m in, 98! 、5 s, 65! 、15 s, 72! 、20 s,共 25个循
环, 72! 延伸 10m in。第二内含子扩增条件为 98!
预变性 1 m in, 98! 、5 s, 63! 、15 s, 72! 、30 s,共 25
个循环, 72! 延伸 10 m in。1. 2%琼脂糖凝胶电泳鉴
定,测序。
1. 2. 3 重叠延伸 PCR构建全长 cDNA 将 cDNA
的 A、B、C片段 PCR产物等摩尔比混合作为重叠延
伸 PCR的模板延伸 5个循环加入引物扩增条件为
98! 预变性 1 m in, 98! 、5 s, 61! 、15 s, 72! 、40 s,
共 25个循环, 72! 延伸 10 m in。 1. 2%琼脂糖凝胶
电泳鉴定,测序。
1. 2. 4 在 cDNA插入第二内含子构建重构 分子
第二内含子需要插入的位点在第三外显子的第 15
个碱基处,以所要插入位点两侧的 25个碱基加上第
二内含子两端的 25个碱基共 50个碱基构成引物,
与扩增全长 cDNA的引物分别配对, 将插入位点两
端的片段扩增出来,即将全长 cDNA切成了两部分:
D片段和 E片段。其中 D片段扩增条件为 98! 预
变性 1 m in, 98! 、5 s, 65! 、15 s, 72! 、20 s,共 25个
循环, 72! 延伸 10m in。E片段扩增条件为 98! 预
变性 1 m in, 98! 、5 s, 64! 、15 s, 72! 、25 s,共 26个
循环, 72! 延伸 10 m in。 1. 2%琼脂糖凝胶电泳鉴
定, 测序。
将 D片段和 E片段、第二内含子 PCR产物等摩
尔比混合作为重叠 PCR的模板延伸 5个循环加入
引物扩增条件 98! 预变性 1 m in, 98! 、5 s, 68! 、15
s, 72! 、50 s,共 25个循环, 72! 延伸 10m in。1. 2%
琼脂糖凝胶电泳鉴定,测序。
1. 2. 5 重组质粒 pMD19T Simp le /重构分子的构建
及鉴定 胶回收重构分子片段 PCR液与 pMD19T
S imp le载体片段以摩尔比为 3∀1混合, 加入等体积
So lution I, 16! 下进行连接反应 12 h, 然后将连接产
物转化大肠杆菌 DH5a感受态细胞。将转化菌取
150 L涂于含 100 mg /L氨苄西林、IPTG ( 20 mg /
mL)和 XGa l( 20 mg /mL)的 LB平板上, 37! 孵育
16 h,挑 10个白色单菌落扩大培养。采用质粒小提
试剂盒提取质粒,经 Sal I、P st I分步酶切。 1. 2% 琼
脂糖凝胶电泳,筛选阳性克隆。将含插入重构分子
片段的质粒测序。测序均由大连宝生物工程公司
完成。
2 结果
2. 1 RTPCR、PCR产物
RTPCR的产物为 cDNA的编码序列 C片段包
括二到五外显子的全部和一和六外显子的小部分,长
度为 584 bp。常规 PCR从基因组 DNA中扩增出的
cDNA5 的部分非编码序列 A片段长度为 173 bp, cD
NA 3 部分非编码 B片段长度为 241 bp。第二内含子
长度为 682 bp,加上两边用于重叠的各 25 bp, 共 732
bp。以第二内含子需要插入的位点在第三外显子的
第 15个碱基处为分开点,扩增出的 D片段和 E片段
的长度分别为 297 bp和 514 bp (图 3)。
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M. m arker; 1- 6.分别为 A片段, B片段, C片段, D
片段, E片段,第二内含子
图 3 甘丙肽全长 cDNA与待构建的重构分子
2. 2 全长 cDNA的构建
以 RTPCR和 PCR扩增得到的 cDNA的 A、B、
C片段为模板扩增全长 cDNA序列,全长 cDNA 699
bp,加上两端的 Sal I、P st I酶切位点分别为 55和 56
bp,共 811 bp(图 4)。
2. 3 重构分子的构建
重构分子是以 D片段和 E片段以及第二内含
子为模板重叠延伸出来的,长度为 1 493 bp(图 5)。
测序结果表明重叠片段序列正确, 第二内含子插入
的位置准确,无突变和移码。
图 4 重构分子的扩增策略 图 5 全长 cDNA的电泳图
2. 4 重组质粒 pMD19T Simp le /重构分子的构建及
鉴定
pMD19T Simp le /重构分子用 Sal I、P st#分步
酶切,在图 6中泳道 1为酶切产物 2. 7 kb和 .l 5 kb
左右的条带, 泳道 2为没有酶切的 pMD19T S imple /
重构分子,测序证明酶切得到的条带即为 pMD19T
S imp le载体和重构分子, 证明重构分子克隆到
pMD19T S imple载体上了。
1.酶切后产物; 2.未酶切重组质粒; M. M ark er
图 6 Sa l l、Pst#酶切鉴定 pMD19- T S im ple /重构
分子质粒电泳图
3 讨论
研究表明甘丙肽与众多生理或病理过程相关,
故对其功能的研究的研究显得相当的重要, 构建甘
丙肽过表达或表达缺失的动物模型就是一种关键的
研究工具。根据 Ko fler等 [ 12]发表的研究, 甘丙肽
cDNA的第一外显子是非编码序列, 第二外显子编
码了 27个碱基的前导序列,第三外显子的前 15个
碱基编码了信号序列。第三外显子的后 39碱基和
第四、五, 六外显子编码了甘丙肽 ( GAL)和甘丙肽
相关肽 ( GMAP) ,第六外显子的后 150个碱基为非
编码序列,本研究中尝试将第二内含子插入后并没
有改变读码框。本研究介绍的运用重叠延伸 PCR
方法构嵌入第二内含子的甘丙肽 ( AL)全长基因组
cDNA的是一种嵌合分子,自然不存在,但是并没有
打乱其基因表达框,这在以往的甘丙肽过表达动物
模型的构建研究中曾成功使用过但与本研究中内含
子插入的位点不同 [ 3]。早在 20世纪 80年代 等 [ 13- 15]
在进行转基因植物和动物的研究中已经开始在 cD
NA中插入一段内含子以增强其表达。 Pa lm iter
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等 [ 7]进行的转基因试验了发现含有内含子时能比
cDNA的表达水平提高 5- 75倍。而国内学者卢一
凡等 [ 16]的研究也得出类似的结论,并且证明了内含
子插入的位置对转基因的表达没有影响。
本试验进行了两次重叠, 第一次重叠是以 cD
NA的 3个片段为模板的, 所以扩增出的片段使重叠
部分非常长, 5 和 3 重叠的部分分别为 83 bp和 109
bp,重叠延伸能能有效进行; 第二次重叠是在内含
子和切开的 cDNA片段的引物中均为重叠部分故有
两端都有 50 bp的重叠部分,重叠也能有效进行。
在应用重叠延伸 PCR技术时, 必须考虑 DNA
聚合酶的质量。应避免使用 Taq酶, 因其在 PCR产
物 3 末端添加一个突出 A ,从而造成移码。本研究
使用 Phusion超保真聚合酶, 具有 3 外切纠错功能,
可以保证嵌合序列的正确性。其次, 重叠延伸 PCR
为多重扩增,极易发生碱基错配。本研究在进行重
叠时不直接使用两端片段的上下引物扩增, 而是仿
照巢式 PCR的设计引物的方法以预计的重叠产物
为模板重新设计新的内引物,以防止引物错配发生,
试验表明使用内引物可有效的增加引物的特异性。
另外在进行所有的 PCR是除了使用保真度高的聚
合酶外,扩增的循环数不能太多,否则突变出现的可
能性就会增大。
本研究以重叠延伸 PCR技术构建的重构分子
为下一步构建一种新的甘丙肽过表达转基因动物模
型提供了甘丙肽表达载体中的结构基因, 为甘丙肽
生理病理功能的研究奠定了一定的试验基础。
参 考 文 献
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