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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 8期
重叠 PCR法合成轮状病毒抗原基因 VP4
冉丹霞　王荣荣　郝亚宁　宋方洲　马永平
(重庆医科大学生物化学与分子生物学教研室 分子与肿瘤研究中心 ,重庆 400016)
　　摘 　要 : 　用重叠延伸 PCR (overlap extension PCR)法获得轮状病毒 VP4基因。根据 Genbank中鼠 VP4基因的序列设计
34对引物 ,用 overlap PCR法合成 VP4全基因的两个片段 A、B,将 A、B分别连入 pMD192T simp le载体 ,测序结果显示 ,成功合
成了 VP4全基因。证明了重叠延伸 PCR法是获得目的基因的有效方法。
关键词 : 　轮状病毒 　VP4基因 　合成 　重叠延伸 PCR
Synthesis of the M urine Rotavirus Antigen Gene VP4 by Overlapping PCR
Ran Danxia　W ang Rongrong　Hao Yaning　Song Fangzhou　Ma Yongp ing
(Departm ent of B iochem istry and M olecular B iology of Chongqing M edical University,
The M olecularM edicine and Cancer Research Center , Chongqing 400016)
　　Abs trac t: 　 It was to synthesize the murine rotavirusVP4 antigen gene with overlapp ing PCR. According to the sequence of murine
rotavirus antigen gene VP4, 34 pairs of p rimers were designed. The full2length VP4 gene was synthesized through overlapp ing PCR and
cloned into pMD192T simp le vector. Sequencing results showed that the p roduction of PCR was correct. Overlap extension PCR was
p roved as a utility method to synthesize long2length gene.
Key wo rds: 　Rotavirus　VP4 Gene　Synthesize　Overlapp ing PCR
收稿日期 : 2009203216
基金项目 :国家自然科学基金项目 (30671865)
作者简介 :冉丹霞 (19822) ,女 ,硕士研究生 ,生物化学与分子生物学专业
通讯作者 :马永平 , E2mail: ypma0909@yahoo. com. cn
　　轮状病毒 ( rotavirus, RV )是引起全世界婴幼儿
严重腹泻的重要病原 ,其危害严重且无有效的治疗
手段 ,根除 RV感染的惟一途径是发展安全、有效的
疫苗 ,这已成为一个全球性的公共医疗目标 [ 1, 2 ]。
在缺乏 VP4基因扩增模板的情况下 ,本研究用重叠
PCR法合成鼠源轮状病毒外壳蛋白基因 VP4,下一
步将其克隆到表达载体上 ,为新型口服 RV基因工
程疫苗的研究奠定了基础。
1　材料和方法
111　材料
E. coli DH5α菌种由本实验室保存。限制性 DNA
内切酶 B sp1407 I、N otI、Sal I,DNA Marker DL2000、250 bp
ladder DNA marker, PrimerSTAR HS DNApolymerase、
pMD192T Simple Vector、X2Gal、IPTG、Amp、Kana均为
TaKaRa产品。 Plasm id M ini KitI、Gel Extraction Kit
够自 Omega公司 ,引物由博尚生物技术有限公司
合成。
112　方法
11211　引物设计与基因合成 　根据基因库中鼠
VP4基因序列 ,将整个基因分为两段 ,设计了 P4A12
P4A17、P4A1 r2P4A17 r、P4B12P4B17、P4B1 r2P4B17 r
共 34对引物 ,每个引物的长度在 40～58 bp 范围
内 ,正负链之间互补碱基为 20 bp。其中 P4A17、
P4A17 r、P4B17、P4B17 r的 5′端分别设计了 Sa l I、
B sp1407 I、N ot I酶切位点。引物的工作浓度为 10
μmol/ l。第一轮 PCR 反应体系 : 5 ×Primer STAR
Buffer 5μl、2 mmol/ l dNTP M ixture 2μl、P4A1 3μl、
P4A1 r 3 μl、PrimerSTAR HS DNA polymerase 0. 25
μl、灭菌水 11. 75μl和 5 ×Primer STAR Buffer 5μl、2
mmol/ l dNTP M ixture 2μl、P4B1 3μl、P4B1 r 3μl、
Primer STAR HS DNA polymerase 0. 25 μl、灭菌水
11. 75μl。反应条件 : 94℃ 40 s、55℃ 30 s、72℃
2009年第 8期 冉丹霞等 :重叠 PCR法合成轮状病毒抗原基因 VP4
45 s。第二轮 PCR反应时 ,在 25μl反应体系中 ,加
入上一轮 PCR产物 3μl、P4A2和 P4A2 r各 2μl,其
余同前。从第 7轮到 10轮的延伸时间为 60 s,从第
11轮到第 17轮的延伸时间为 90 s,其余反应条件
同前。用重叠 PCR策略 ,通过逐步拼接法人工合成
VP4基因的两段 A、B [ 3～6 ] (图 1)。
图 1　A、B片段的合成策略
11212　PCR扩增产物的回收 　用同样的条件和体
系扩 10管 ,电泳从琼脂糖凝胶上切下含目的片段的
电泳条带 ,用琼脂糖 DNA回收试剂盒回收 ,操作按
说明书进行 ,回收体积为 25μl。
11213　重组质粒 pMD192T Simp le /A、pMD192T Sim2
p le /B的构建及鉴定 　回收的目的基因扩增片段和
pMD192T Simp le载体片段以摩尔比为 3∶1混合 ,加入
等体积 solution I, 16℃下连接反应 4 h,然后将连接产
物转化大肠杆菌 DH5α感受态细胞。将转化菌取 100
μl涂于含 100 mg/L氨苄西林、IPTG(20 mg/m l)和 X2
Gal(20 mg/m l)的 LB平板上 , 37℃孵育 16 h,分别挑
10个白色单菌落扩大培养。采用质粒小提试剂盒提
取质粒 , A 经 Sal I、B sp1407 I分步酶切 , B 经 N ot I、
B sp1407 I分步酶切。1%琼脂糖凝胶电泳 ,筛选阳性
克隆。将含目的插入片段的质粒测序。
2　结果
211　VP4 A、B两片段的合成
分别经过 9轮扩增后 ,电泳检测 ,有目的条带 ,
但同时还有非特异性条带 (图 2)。13轮 PCR后 ,电
泳检测 ,出现了严重的拖尾 (图 3)。降低 dNTP M ix2
ture至 1. 5μl,引物各 1μl,上轮 PCR产物为 2μl,
13轮的退火温度提高至 63℃,此后 ,每扩增一轮提
高退火温度 1℃。17轮后 ,扩增合成了另 4条分子
量较小的非特异性条带和包括酶切位点及保护碱基
在内的约 1 200 bp的 A和 B (图 4,图 5)。
1. A9; 2. B9; 3. A13; 4. B13; 5. A16; 6. B16;
7. A17; 8. B17; M. DL2000 DNA
图 2～图 5　用重叠 PCR合成 A、B片段
212　重组质粒 pMD192T Simp le /A、pMD192T Sim2
p le /B的构建及鉴定
pMD192T Simp le /A用 Sa l I、B sp1407 I分步酶切 ;
pMD192T Simp le /B用 N ot I、B sp1407 I分步酶切均得
到 3 kb和 1 kb左右的条带 (图 6)。测序证明 A、B
分别克隆入 pMD192T Simp le载体。
1. pMD192T Simp le /A质粒 ; 2. SaIⅠ、B sp1407 I分步酶切的 pMD192T
Simp le /A质粒 ; 3. N otⅠ、B sp1407 I分步酶切的 pMD192T Simp le /B质
粒 ;M. 250 bp ladder DNA Marker
图 6　酶切鉴定 pMD192T S im ple /A,
pMD192T S im ple /B质粒
3　讨论
重叠 PCR法是在没有基因模板的情况下获得
基因的可行方法。本研究中利用重叠 PCR合成鼠
轮状病毒外壳蛋白 VP4基因 ,结果表明序列正确 ,
说明本方法效果较好。在用重叠 PCR扩增较长片
(下转第 124页 )
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
Abou2Jaoudé等 [ 16 ]在近期的研究中证实如将豆蔻酰
化的位点从 L蛋白转移到 M蛋白或者 S蛋白后 ,以
HBV包膜蛋白包装的 HDV就失去了感染能力 ,进
一步说明了 p reS1区域在 HBV感染中的重要性。
本实验室在前期研究中发现 HepG2细胞膜蛋
白 p110能与 p reS1特异结合。用逐步删除突变的
方法融合分段表达 p reS1的各片段 ,并与预处理的
HepG2细胞裂解液反应 ,试验结果显示 p reS1的 21
～33 aa是其与 p110特异结合的关键位点。进一步
用 GST2(21～33)预先与细胞裂解液孵育 ,能有效的
阻断 p reS1 与 p110 的特异结合 , 从反面证实了
p reS1 (21～33 aa)是 p110的结合位点。Paran等 [ 17 ]
通过突变研究和单个细胞黏附分析 ,发现 p reS1 ( 21
～47 aa)的 QLDPAF序列对细胞的黏附尤为重要 ,
在其他病毒、细菌和细胞蛋白中也发现有类似的序
列 ,该序列在病毒或细菌的黏附、附着和融合过程中
起重要作用。而 p reS1 (21～33 aa)的氨基酸序列为
PLGFFPDHQLDPA,其中含有 QLDPAF的大部分序
列 ,试验结果与 Paran的研究结果相似 ,提示 p110
蛋白可能是 HBV 黏附入侵肝细胞的关键分子。
HepG2细胞膜蛋白与 p reS1结合位点的鉴定为后续
研究 p reS1在 HBV早期感染中的作用和包膜蛋白
受体打下了基础。
参 考 文 献
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～4453.
(上接第 119页 )
段时 ,容易出现拖尾和非特异扩增的现象 ,且随着目
的片段的增长 ,扩增出的非特异性条带增多。可以
通过降低 Mg2 +浓度、引物量、模板量和逐步提高退
火温度减少 ,控制循环次数 (一般为 15～20个 )等措
施解决 [ 7～9 ]。
轮状病毒外壳蛋白 VP4是病毒中和反应的主要
目标 ,经胰蛋白酶裂解成蛋白 VP5或 VP8 ( P蛋白 )
两部分 ,可增强病毒的感染性。由于 VP4作为同源
抗原具有良好的异源中和抗体 ,因此以 VP4作为抗
原基因进行表达研究 ,将为研制开发有效的轮状病
毒口服基因工程疫苗探索一条新的途径。
参 考 文 献
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2　 Glass R I, B resee JS, Parashar UR, et al. A rchives de pédiatrie,
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