全 文 ：轮状病毒外壳蛋白 !#在转基因番茄果实中的特异表达!
沈文涛!，周 鹏!!，郭安平!，王健伟
（! 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 热带作物生物技术国家重点实验室，海南 海口 #$!!%!；
中国预防医学科学院病毒研究所，北京 !%%%#）
摘要：将轮状病毒外壳蛋白 !# 基因克隆到含有番茄果实特异性启动子 $% 的植物表达载
体 &’(，并转化到根癌农杆菌（&’()*+,-.(/01 -01.2+,/.34）菌株 )*+!%#中，采用叶盘转化法转
化番茄（56,)7.(4/,)3 .4,08.3-01 ,-.. /）栽培品种 ’0%%!1，获得了转基因植株。经 234、2345
6789:;<= >.79和 6789:;<= >.79分析表明 !# 基因已整合到转基因番茄植株的核基因组中，4’5
234、?;@9;<= >.79结果表明 A2$蛋白在果实中获得了特异表达。
关键词：轮状病毒；!# 基因；番茄；特异表达
中图分类号：B C1D 文献标识码：+ 文章编号：%#D E $%%（%%1）% E %%$ E %F
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轮状病毒（479HR-<8@，4A）是引起婴幼儿急性腹泻的重要病原体，占所有肠道感染病
云 南 植 物 研 究 %%1，AB（）：%$ ] !
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!! 通讯作者：) E SH-.：\:^9W_&8>.-T‘ :O‘:-‘ T= ’;.：%aCa E FFaC%Fa$
收稿日期：%%D E %C E !a，%%D E !! E %D接受发表
作者简介：沈文涛（!C$F E）男，硕士，主要从事植物生物反应器的研究。
基金项目：国家自然科学基金资助（D%%F%%DD）
因的 !#以上，几乎所有 $岁以下儿童都发生过 %&感染，因此，%&有“民主病毒”之
称（’()*(+等，,）。迄今，对 %&感染最有力的预防和控制措施，仍是发展有效的疫
苗。&-.是轮状病毒的主要外壳蛋白和中和抗原，是发展基因工程疫苗的首选。目前，基
因工程表达的轮状病毒蛋白大多由大肠杆菌或病毒表达系统来表达，这些表达系统使需要
糖基化的外壳蛋白 &-.表达受到限制（何湘君等，/000；袁力勇等，,/）。随着分子生
物学技术的发展和植物细胞培养及再生方法的完善，人类在成功改变植物遗传性状的同
时，尝试着将转基因植物转变为人类所需昂贵药品的廉价“生产工厂”，如利用植物细胞
来表达细菌性或病毒性病原体的植物口服疫苗（1234)356 7 89:;<5:，,）。这种疫苗不
仅改变了传统的疫苗生产方式和接种手段，而且大大降低了疫苗的生产成本，给免疫预防
领域带来了生机。本研究使 !# 基因在番茄果实中特异表达，以期获得具有免疫原性的、
可口服的轮状病毒植物疫苗，这将为防治轮状病毒引起的小儿腹泻提供新型疫苗，具有潜
在的社会和经济价值。
! 材料与方法
!! 植物材料
番茄（$%&’()*+,&’- )+&./)-0.1 =(33 >）品种：?@/A，由华南热带农业大学园艺所提供。培养无菌苗，
取子叶做转化外植体。
!# 质粒
根癌农杆菌（23*’45&0)*,.1 0.1)65&,)-+）菌株为 BC8/!，番茄果实特异性启动子 ?D-由本课题组克隆
（周鹏和郑学勤，,/），并构建植物表达载体 E?DF&-.（图 /）。8组轮状病毒 G/型中国株 !# 基因由中
国预防医学科学院病毒研究所王健伟博士提供。
!$ 重组农杆菌介导的番茄遗传转化
转化方法参照王关林和方宏筠（/00H）。取 / I左右无菌子叶，在芽分化培养基 =/：=J K L M N8 ,O
4PFQ K R88 O, 4PFQ上预培养 , I，用重组农杆菌侵染，在铺有烟草悬浮细胞的 =/ 上看护共培养 , I，转
入含有 S2:246T(:（卡那霉素，S2:）.! 4PFQ、U29V5:(T(33(:（羧苄青霉素，UV）$ 4PFQ的 =/ 选择培养基
上，诱导芽再生。待芽长到 , W $ T4时切下，在=,：=J K R88 O/ 4PFQ K S2: ! 4PFQ K UV $ 4PFQ上诱导
生根。将根系生长良好的转化植株，移入温室中种植。
!% 转基因植株的鉴定分析
/OAO/ -U%和 -U%XJ+Y;*59: V3+;检测 采用 U?8N法提取转化的番茄植株基因组 Z’8。!# 基因的 -U%引
物由上海生物工程技术服务有限公司合成。
!’端引物：![X8? UUU GGG 8UU 8?G GG? GG? 8?? G8G ?8U 8UX$[（-/）
$’端引物：![XUG G8G U?U ?U8 ?8U ?U? 8?8 8?8 888 UGX$[（-,）
扩增条件是：0A\预变性 ! 4(:；0A\变性 $ )，!$\退火 $ )，.,\延伸 0 )，进行 $个循环；最后
.,\延伸 / 4(:；将 -U%产物作琼脂糖电泳。然后将电泳胶进行 J+Y;*59:印迹转移、杂交，方法见王关林
和方宏筠（/00H）。实验使用 N+5*9(:P59 =2::*5(4公司生产的 ZRG Z’8 Q2V53(:P 2:I Z5;5T;(+: S(;，以 !# 基
因片段（约 00 VE）为模板进行探针标记。
/OAO, J+Y;*59: V3+;检测 分别提取 -U%XJ+Y;*59: V3+;阳性番茄植株总 Z’8约 /!P，用 7&’8 R和 9,-: RRR
$.\酶切消化过夜。电泳后，进行 J+Y;*59:印迹转移、杂交，方法见王关林和方宏筠（/00H）。
/OAO$ %?X-U% 利用 %’8抽提纯化试剂盒（上海华舜生物工程有限公司）分别提取 J+Y;*59: V3+;阳性转
化植株果实和叶片的总 %’8，用 %?X-U%试剂盒（N+5*9(:P59 =2::*5(4公司）进行反转录，再以反转录产
H, 云 南 植 物 研 究 ,L卷
物为模板，! 和 !# 为引物 !$%扩增（非转化植株果实和叶片作为对照）。
&’&’ ()*+),- ./0+检测 取约 #11 23 转基因番茄植株叶片和果实为实验材料。蛋白提取方法、4546
!789电泳分离蛋白质和 ()*+),- ./0+杂交方法见王关林和方宏筠（::;）。免疫反应所选用的第一抗体为
抗轮状病毒豚鼠血清，第二抗体为兔抗豚鼠 <38血清，第三抗体为辣根过氧化酶标记的抗兔 <38，由海军
总医院尹国才提供。
! 结果与分析
!# 载体的构建
=>?是含有番茄果实特异性启动子的植物表达载体，为了方便克隆，在设计 !$%引物
时就引进植物表达载体 =>?具有的克隆位点 !# <和 !#$ <，经 !$%、=89@6> 9A*B载体克
隆，得到了 =>C!D克隆载体，基因测序结果表明 %&’ 获得了正确的设计改造。利用 !# <
和 !#$ <切除 =>?上的 ()! 基因，用同样的两种酶消化 =>C!D克隆载体获得 %&’ 基因片
段，使之形成与线性化 =>?质粒相同的粘性末端。在 >’65E7连接酶的作用下，将线性化
=9C质粒和酶切后的 %&’ 基因片段连接成新的重组质粒 =>?FC!D。这样 %&’ 基因 GH端是果
实特异性启动子 *+&，IH端是 ,-! 终止子，卡那霉素抗性作为转化植株的筛选标记，具
体构建见图 。
图 果实特异性表达载体 =>?FC!D的构建示意图
?J3& >K) L0-*+,ML+J0- 0N =>?FC!D ,)L02.J-A-+
!! 转化与植株再生
预培养 # O的番茄子叶用工程根癌农杆菌侵染后，转接到芽分化培养基上，看护共培
养 I O，然后再转移到选择性芽分化培养基上，经过约 G O的选择培养后，大部分子叶黄
化或褐化，逐渐死亡。少数子叶伤口的基部能长出黄绿色的愈伤组织，约 1 O后分化出
绿色芽点。待芽长到 # P I L2时，切下转入生根培养基，当根系发达后，移入温室。本研
究共获得 #I株抗性转化再生番茄植株。
!$ 番茄转化植株的 %&’和 %&’6()*+,-./ 01)+检测
对获得的抗性转化再生苗进行 !$%和 !$%640M+K),- ./0+检测，有 #1 株转化植株 !$%
扩增出预期约 ::1 .=的电泳带，且 !$%640M+K),- ./0+也呈阳性，而未转化的番茄植株则无
特异性扩增带，初步证明 %&’ 基因已导入番茄植株，部分检测结果如图 #（A，.）。
:1##期 沈文涛等：轮状病毒外壳蛋白 C!D在转基因番茄果实中的特异表达
图 ! 番茄转化植株的 #$（%）和 #$&’()*+,-. /0(*（/）检测结果
1234 ! #$（%）%.5 #$&’()*+,-. /0(*（/）%.%06727 (8 *-%.73,.29 *(:%*(
;%., <：#$ =%->,-；;%., !：?@1ABC；;%., D：.(.&*-%.78(-:,5 *(:%*(；;%., E F C：*-%.78(-:,5 *(:%*(
图 D 番茄转化植株 ’()*+,-. /0(*检测结果
1234 D ’()*+,-. /0(* %.%06727 (8 *-%.78(-:,5
*(:%*(
;%., <：?@1ABCA!#$ G H %&’( GGG；;%.,
!：.(.&*-%.78(-:,5 *(:%*( IJKA!#$ G H
%&’( GGG；;%., D F L：*-%.78(-:,5 *(:%*(
IJKA!#$ G H %&’( GGG
!# 番茄转化植株 $%&’()*+ ,-%’检测
对 #$和 #$&’()*+,-. /0(*检测为阳性的转化番茄
植株进一步进行 ’()*+,-. /0(*分析。以回收的 )*+ 基因
作为标记探针，对番茄总 IJK以 !#$ G和 %&’( GGG进
行酶切消化，印迹杂交。共有
出现杂交信号，根据阳性对照片段大小推算，转化植
株的杂交目的带大小约 DN< >/（,-* O
基因、终止子 234 ,56 已经整合入转基因番茄植株核基
因组中，部分结果如图 D。
!. /0&12/检测
对 ’()*+,-. /0(* 阳性的植株进行 $@&#$ 分析，初
步表明有
分结果如图 E。
图 E 转基因植株的叶片和果实 $@&#$检测结果
1234 E $@&#$ %.%06727 0,%R,7 %.5 8-)2*7 (8 *-%.73,.29 *(:%*(
;%., <：#$ =%->,-；;%., !：.(.&*-%.73,.29 *(:%*( 0,%R,7；;%., D F M：*-%.73,.29 *(:%*( 0,%R,7；
;%., L：.(.&*-%.73,.29 *(:%*( 8-)2*7；;%., C F S：*-%.73,.29 *(:%*( 8-)2*7
Q!# $%&’%() *+,’
提取 !#$%!检测呈阳性的 &’株转基因植株的叶片和果实总蛋白，()(#$*+,电泳分
离蛋白后进行 -./0.12 3450，结果表明在 &6株的果实中出现两条蛋白杂交带，而在叶片中
无 7$8蛋白表达。图 9为其中 9株转基因番茄果实的 -./0.12 3450结果。
图 9 转基因植株的叶片和果实 -./0.12 3450检测结果
:;<= 9 -./0.12 3450 >2>4?/;/ 4.>@./ >2A B1C;0/ 5B
01>2/<.2;D 05E>05
F>2. &：G1.#/0>;2.A G150.;2 H>1I.1；F>2. 6：252#01>2/<.2;D
05E>05 B1C;0/；F>2. ’ J &K：01>2/<.2;D 05E>05 B1C;0/
- 讨论
植物口服疫苗（51>4 @>DD;2.）或食用疫
苗（.A;34. @>DD;2.）是转基因植物疫苗的研
究热点，也是其主要的发展方向，与传统的
疫苗表达系统如细菌系统、酵母系统和哺乳
动物细胞系统相比，植物表达系统生产疫苗
有以下的优点：&）成本低。只需增加耕种
面积，就能迅速形成产业化规模，并且植物
表达系统生产的疫苗可以直接储存在植物种
子和果实中，故易于长距离运输和普及推广
（LC M F>2<1;A<.，6KKK）；6）植物真核表达
系统生产的蛋白质疫苗可进行正确加工，能
保持自然状态下的免疫原性（F>11;DI M N5E>/，6KK&）；’）安全性好。转基因植物生产疫
苗避免了动物细胞生产疫苗中可能污染动物病毒的问题（)>2;.44等，6KK&）；O）转基因植
物细胞可以启动粘膜免疫的有效途径，其机制可能是植物细胞壁、细胞膜和细胞器作为天
然的生物胶囊可使细胞内的疫苗蛋白能够抵抗消化道的酸性环境和各类酶的降解，使表达
的疫苗在小肠内慢慢释放，产生缓释作用，以实现免疫功能（LC M F>2<1;A<.，6KKK）。本
研究获得了能够在番茄果实中特异表达轮状病毒外壳蛋白 7$8的转基因植株，这不仅有
助于对 7$8结构和功能的进一步研究，也为研究和开发新型轮状病毒口服疫苗提供一条
新的途径，具有一定的理论意义和应用前景。
7$8是轮状病毒外壳上的主要糖蛋白，其糖基化对免疫原性有很大影响，决定着病毒
的血清型，并可以诱导中和抗体（P>BB.Q..，&RR9）。7$8蛋白在轮状病毒中的重要性使其
成为轮状病毒基因工程疫苗的首选，已在大肠杆菌（袁力勇等，6KK&）、杆状病毒系统
（何湘君等，&RRR）、原虫系统（,E/4;.等，&RR9）、重组腺病毒（何金生等，6KK&）等系统
中获得不同程度的表达，一些还同时表达出不同分子量的 7$8蛋白。本研究利用番茄果
实特异表达启动子 !# 在转基因番茄果实中特异表达了 7$8蛋白，-./0.12 3450结果显示，
在果实蛋白杂交中出现两条带。至于为什么会表达出不同分量子大小的蛋白，其结构修饰
和功能上各有什么异同？是否是 $#% 基因中的两个顺反子产生了不同基因表达，或是与
去除的 9S和 ’S非编码区以及基因本身的特性所决定有关，还有待进一步研究。
选择合适的植物启动子是增强外源基因表达的关键。为了避免组成型 表达启动子控
制下，外源基因在转基因植物所有部位和所有的发育阶段都会表达而造成的浪费，使外源
基因能在植物体内能持续、高效的表达，并且减少对植物生长发育的不利影响，目前在植
物表达载体中广泛应用的组成型启动子如 &’($)*+、,-./0.1.2 和 341.25 启动子逐渐被一些
&&66期 沈文涛等：轮状病毒外壳蛋白 7$8在转基因番茄果实中的特异表达
特异性表达启动子（组织器官特异性启动子和诱导型启动子）所代替（侯丙凯等，!#）。
本研究采用的番茄果实特异表达启动子由我室周鹏博士克隆，并在番茄和番木瓜中特异表
达 !# 基因（周鹏和郑学勤，!#），$%&蛋白在转基因番茄中的特异表达又进一步证明
了这一启动子的特异性。
〔参 考 文 献〕
王关林，方宏筠，#’’( ) 植物基因工程原理与技术［*］) 北京：科学出版社
+,-./00 1，234/,35./06 27，89:;55 <，!# ) */6.:,0 =;0/:>0,4 5,4=.-?：@4;6>:3.;- ;5 ,-3.A;6./B，A.;@C,4=,:/>3.:,0B ,-6 /6.A0/ D,:E
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1/ 72（何金生），8,-? 78（王健伟），8/- SS（温乐英）， &- ,+，!#) RC/ B9B3/=.: ,-6 =>:;B,0 4/B@;-B/B :,- A/ .-6>:/6
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报），%&（!）：#!!—#!G
1/ U7（何湘君），V.,- S（钱渊），W.> 7（刘军）， &- ,+，#’’’) HK@4/BB.;- ;5 39@/ X# $%& 54;= , ?4;>@ , 4;3,D.4>B 5./06 B34,.- .-
A,:>0;D.4>B B9B3/=［7］) 89/’ 5 6/%2+（病毒学报），%’（#）：&F—&&
1;> J<（侯丙凯），U., X*（夏光敏），YC/- Z1（陈正华），!#) 234,3/?./B 5;4 ;@3.=.T.-? /K@4/BB.;- D/:3;4 >B/6 .- @0,-3 ?/E
-/3.: /-?.-//4.-?［7］) :&%&(/-,)（遗传），#(（F）：O’!—O’&
W,44.:M 78，RC;=,B +8，!#) %4;6>:.-? @4;3/.-B .- 34,-B?/-.: @0,-3B ,-6 ,-.=,0B［7］) 83%% ;O#(
[.BC.; \，*,3B>. <，\M, R， &- ,+，! ) I;3,D.4>B .-5/:3.;- ,=;-? .-5,-3B ].3C 6.,44C/, .- %,M.B3,-［7］) *&(/,-%/.) >’-&%’,-/2’,+，
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S>,- WS（袁力勇），W.> S（刘勇），W. Y1（李春宏）， &- ,+，!#) HK@4/BB.;- .- A).9&%/.9/, .2+/ ,-6 .==>-;?/-.:.39 ;5 4;3,D.4E
>B $%&［7］) 89/’ 5 =/2-&.9（生物工程学报），%&（!）：#OF—#O’
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［7］) 89/’ 5 $%2< 8%2<（热带作物学报），##（N）：F#—F&
!#! 云 南 植 物 研 究 !G卷