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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2010年第 9期
家蝇抗菌肽 Defensin在
毕赤酵母中的表达及活性鉴定
金小宝 王婷婷 朱家勇 李小波 马艳 褚夫江 卢雪梅
(广东药学院基础学院广东省生物活性药物研究重点实验室,广州 510006 )


摘
要 :
拟通过酵母系统表达家蝇抗菌肽 De fensin基因, 并初步鉴定其抗菌活性。采用限制性内切酶 Sac
将分泌型重
组表达质粒 pPIC9K /De fensin线性化后, 运用氯化锂转化法将其转入巴斯德毕赤酵母 GS115中, 行 G418加压筛选和 PCR鉴
定; 所得阳性转化子转至摇瓶, 28
条件下 0
5%甲醇诱导表达,连续诱导培养 4 d后,上清液进行 T ricine
SDS
PAGE检测表达
效果, 并采用琼脂糖孔穴扩散法检测表达产物对大肠杆菌 E. coli K12D31的抑制作用。结果显示, 家蝇抗菌肽 De fensin在毕赤
酵母中得到了成功表达,表达产物对大肠杆菌 E. co li K
12
D
31
的生长有抑制作用。说明酵母系统适合抗菌肽的表达。
关键词:
家蝇 抗菌肽 De fensin 毕赤酵母 表达
Expression and Activity Analysis of Antim icrobial
Peptide Defensin in P ichia pastoris Yeast
J in X iaobao W ang T ingting Zhu J iayong L iX iaobo M aYan Chu Fu jiang Lu Xueme i
(Guangdong K ey Laboratory of Pharmaceu tical Bioactive Substances, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006)


Abstrac:t
The resea rch w as desighed to study the express ion o f antibacter ia l peptide de fensin inP ich ia pastor is yeast and ana lysis
o f its antibacteria l activ ity. A fter linearized bySac I, pP IC9k / Defens in w as transformed intoP ichia pastoris GS115 stra in by the lithium
ch lor ide transfo rm ation m ethod. Through G418 screen ing and PCR identification, the positive c lonesw ere transferred into shake flasks at
28
w ith 0
5% me thano l induction. The supernatant w as co llected and detected by T ric ine
SDS
PAGE, and bacter icida l activ ity w as
analyzed by agarose diffusion assay after 4 days. The resu lts show ed thatM usca dom estica defens in w as successfu lly expressed in P ichia
pastor is and could inhibit the grow th o fE. co li K12D31. Th is study w ould lay the foundation fo r further research.
Key words:
Musca dom estica Antibacter ia l peptide
De fensin P ich ia pastoris
Expression
收稿日期: 2010
04
21
基金项目: 2007年度广东省科技计划项目 ( 2007B020708015)
作者简介:金小宝,男,医学博士,副教授,研究方向:抗菌肽结构与功能研究; E
m ai:l jinxf2001@ 163. com
通讯作者:朱家勇,男,教授,博士生导师,研究方向:药用生物活性物质的功能与应用研究; E
m ai:l zhu jy@ gdpu. edu. cn
昆虫防御素 ( insect defensins)是一类阳离子多
肽,对细菌、真菌等微生物具有广谱杀伤作用。最初
是 Matsuyama等 [ 1]从棕尾别麻蝇 ( Sarcophaga p ereg

rina )中分离到, 故命名为麻蝇防御素。后来, 发现
昆虫防御素广泛存在于外翅类昆虫 (半翅目和蜻蜓
目 )和内翅类昆虫 (双翅目、鞘翅目、毛翅目和膜翅
目 )。目前研究表明 [ 2, 3] , 大多数昆虫防御素均带有
一个净正电荷,相对分子量为 4
0 kD左右,由 34-
51个氨基酸组成,含 6个保守半胱氨酸, 3个分子内
二硫键形成
片状和 1个
螺旋结构, 二硫键以
Cys1
Cys4、Cys2
Cys5、Cys3
Cys6连接。本课题组 [ 4]
从家蝇 (Musca dom estica )体成功克隆了该基因的成
熟肽编码区序列 ( G enB ank登录号: EF175878) , 长
度为 120 bp,编码 40个氨基酸, 并构建了重组酵母
表达质粒 pPIC9K /De fensin。本研究拟采用巴斯德
毕赤酵母系统表达该基因, 为进一步研究抗菌肽的
生物功能奠定基础。
1
材料和方法
1
1
菌株和质粒
毕赤酵母 ( P ichia pastoris )宿主菌 GS115和
2010年第 9期 金小宝等:家蝇抗菌肽 Defensin在毕赤酵母中的表达及活性鉴定
大肠杆菌 E. coli K1 2D 31 (本实验室保存 ) , 重组酵
母表达质粒 pPIC 9K /Defensin (本实验室构建并
保存 )。
1
2 主要试剂
Taq DNA聚合酶、限制性内切酶 Sac
、质粒抽
提试剂盒和凝胶回收试剂盒为 TaK aRa公司产品;
胰蛋白胨和酵母提取物为英国 Oxo id公司产品,
G418抗生素为美国 G IBCO公司产品,蛋白质分子
量标准品为美国 G enScript生物公司产品;用于扩增
目的片段的 PCR引物由上海生物工程技术公司合
成。其它试剂为国产分析纯。
1
3 质粒转化毕赤酵母菌
采用氯化锂 ( L iC l)法转化酵母菌。简要步骤如
下: 分别取质粒 pPIC9K和重组质粒 pPIC9K /De

fensin 8- 12
g, 经限制性内切酶 Sac
酶切线性
化后;取 50
L该酶切回收的线性化质粒, 加入到
100
L酵母感受态细胞 GS115中,并依次加入下列
溶液: 240
L 50% PEG
3350、36
L 50mmo l/L L iC ,l
振荡混匀; 30
静止水浴 30 m in, 42
热击 25 m in,
重复该步骤 1次; 1 200
g离心 1 m in,弃上清,加入
0
5mL YPD培养基; 30
水浴振荡培养, 1 h后取 200

L涂于含有 25
g /mL G418的 YPD平板上, 30
温
箱培养 2- 3 d直至长出单菌落 (转化子 )。
1
4 重组毕赤酵母的平板筛选
用灭菌牙签挑取转化子分别点种到筛选培养基
MM和 MD平板上, 30
培养 2 d, 确定其表型。在
MD上生长正常而在 MM上生长缓慢或不生长的转
化子为阳性转化子。挑取阳性转化子, 分别点种于
含 250、1 000、2 000、4 000
g /mL G418的 YPD培
养基平板上, 进一步加压筛选。挑取 4 000
g /mL
浓度平板上生长最快的菌落进行菌落 PCR鉴定。
1
5 酵母菌落 PCR初步鉴定阳性重组子
依据酵母表达载体 pPIC9K的核苷酸序列设计
1对引物,引物序列如下: 5

TACTATTGCCAGCATT

GCTGC
3
(含 5
端

factor部分序列, 21 bp) , 5


GCAAATGGCATTCTGACATCC
3
(含 3
端 AOX 部
分序列, 21 bp)。反应程序: 94
变性 45 s, 60
退
火 45 s, 72
延伸 1 m in 15 s, 扩增 30个循环。扩
增完毕后, 取 8
0
L PCR产物行 1
5% 琼脂糖电
泳,并拍照记录结果。
1
6 家蝇抗菌肽 Defensin的诱导表达及 T ricine

SDS
PAGE鉴定
挑取经鉴定的阳性转化子 pPIC9K /GS115 (试
验对照 )和 pPIC9K /Defensin /GS115单菌落,分别接
种于 100mL BMGY培养基, 30
培养至 A 600
4
0,
离心、收集酵母菌体; 用 25 mL BMMY培养基重悬
培养, 28
甲醇连续诱导表达 4 d, 每天补加甲醇至
终浓度为 0
5%,收集培养物; 4
, 10 000
g离心 2
m in; 取上清与等量 2
SDS上样缓冲液混合, 100

水浴 5 m in ,取 20
L进行 T ricine
SDS
PAGE,凝胶
用考马斯亮蓝染色, 鉴定家蝇抗菌肽 Defensin在酵
母中的表达情况。
1
7
琼脂孔穴扩散法鉴定表达产物的抑菌活性
融化 10mL固体培养基, 冷却至 45
左右, 按
100
1的比例加入对数生长期的大肠杆菌 E. coli
K12D31,混匀; 倒入直径 9 cm的平皿中, 迅速铺平,
待凝固后, 于超净台内用灭过菌的不锈钢打孔器
(直径 3 mm )打孔 4个; 各孔依次加入 15
L氨苄
青霉素 ( 10 mg /mL, 阳性对照 )、重组质粒 pPIC9K /
Defensin分泌表达上清液、空质粒 pPIC9K分泌表达
上清液和空白酵母培养上清液, 置 37
下培养,
18- 24 h后观察抑菌圈大小,拍照记录结果。
2 结果
2
1
质粒转化效果
空质粒 pPIC9K转化 P. pastoris GS115, 产生 52
个转化子,重组质粒 pPIC9K /Defensin转化 P. pasto

ris GS115,产生 70个转化子; 均在 24 - 48 h内在
MD平板上长出转化子, 而在 MM上生长极慢,表现
为甲醇利用型 (M ut+ )。用含 G418的 YPD平板加
压筛选,最后分别获得 4 000
g /mL浓度条件下 4
个和 5个转化子。
2
2 转化子的 PCR鉴定
各选择其中一个生长快的菌株进行菌落 PCR
鉴定, 以转化子的单菌落为模板, 理论上空质粒
pPIC9K转化子应得到 220 bp左右的 PCR扩增产
物, 重组质粒 pPIC9K /De fensin转化子应得到 340 bp
左右的 PCR扩增产物 ( Defensin基因成熟肽序列为
120 bp)。电泳结果 (图 1)显示, 空质粒 pPIC9K转
化子扩增出 220 bp左右的特异条带, 重组质粒
pPIC9K /De fensin转化子扩增出 340 bp左右的特异
条带,说明质粒转化成功。
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生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 9期
1.转化重组质粒 pPIC 9K /Defens in的 PCR扩增结果; 2.
转化空质粒 pPIC9K的 PCR扩增结果; M. DNA M arker
图 1
PCR检测转化子
2
3
Tric ine
SDS
PAGE检测家蝇抗菌肽 De fensin
在酵母中的表达
G418加压筛选出的转化子进行小瓶发酵, 由于
pPIC9K为分泌型表达载体,所以将发酵液离心后取
上清即可做表达产物分析。表达产物经 T ricine

SDS
PAGE电泳后,重组质粒 pPIC9K /Defensin组在
4 kD左右可见一目的条带, 与理论值基本相符, 而
空质粒 pPIC9K组未见相应蛋白条带 (图 2),证明家
蝇抗菌肽 Defensin表达成功。
M.蛋白质分子量标准; 1.酵母上清液; 2.转染 pP IC9K空质
粒的酵母上清液; 3.转染 pPIC9K
Defensin重组质粒上清液
图 2
表达产物的 Tricine
SDS
PAGE检测结果
2
4
表达产物的的抑菌效果
琼脂孔穴扩散试验结果 (图 3 )表明, 在加有
pPIC9K
Defensin分泌上清的孔周围可见明显的抑
菌圈, 而加有 pPIC9K空质粒分泌上清的孔周围无
抑菌圈,表明该抗菌肽具有抗大肠杆菌的活性,能抑
制大肠杆菌 E. coli K12D31的生长繁殖。
1.抗生素 AM P阳性对照; 2.重组质粒 pPIC 9K /D efens in
分泌表达上清液; 3.空质粒 pP IC9K分泌表达上清液; 4.
酵母上清液
图 3
表达产物 D efensin抑菌活性结果
3 讨论
由于抗菌肽 Defensin具有抗菌作用, 如果直接
采用原核表达系统,表达产物抗菌肽会反馈性抑制
宿主细胞 (细菌 )的活性,从而影响抗菌肽的进一步
表达 [ 5]。采用融合表达的方式, 可能是一种较理想
的方式,但也面临着诸多问题:融合小分子量标签蛋
白进行表达,不能很好地屏蔽产物对宿主细胞的活
性; 融合大分子量标签蛋白, 会造成宿主细胞将过多
的能量与物质用于合成标签蛋白, 降低了抗菌肽相
对表达量;再者,后续融合蛋白的切割, 步骤繁琐,成
本大。另一方面, 由于家蝇抗菌肽基因 Defensin为
真核生物基因, 原核表达系统的宿主细胞


细菌
不具备真核生物蛋白质的翻译后加工修饰过程, 可
能会影响表达产物的后续生物活性研究。酵母表达
系统作为真核表达系统有许多原核蛋白表达系统所
不具备的优点 [ 6] :可对表达的蛋白进行加工折叠和
翻译后修饰,从而使表达出的蛋白具有生物活性;具
有强有力的乙醇氧化酶基因启动子, 可严格调控外
源蛋白的表达;营养要求低、培养基廉价、生长快,易
于进行操作和培养,是表达抗菌肽一种理想选择。
毕赤酵母真核表达体系常采用甲醇营养型酵母
为宿主菌,本试验中我们选用的宿主细胞为甲醇营
养型毕赤酵母菌 GS115, 该菌株可以高效表达许多
外源蛋白 [ 7]。 pPIC9K是整合型分泌表达载体,含有
乙醇氧化酶基因的 AOX1启动子及上游调控区 3

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2010年第 9期 金小宝等:家蝇抗菌肽 Defensin在毕赤酵母中的表达及活性鉴定
AOX1终止子, 含有可供外源基因插入的多克隆位
点、酵母宿主菌的营养互补筛选标志基因的组氨醇
脱氢酶基因 ( h istidino l dehydrogenase gene)和抗生素
G418选择标志基因, 操作方便 [ 6 ]。
本试验选用 D efensin基因的成熟肽编码区,即
去除了氨基端信号肽和 C端跨膜区的编码区, 从初
步结果来看, Defensin能在酵母细胞表达,并且分泌
到上清中,容易分离纯化。采用氯化锂化学转化法,
操作简便,但效率较低,通过连续两次热休克, 可以
提高转化效率。经 1次热休克时, 每板转化子只有
1- 5个, 而经连续两次热休克后, 每板转化子达
50- 72个,转化率提高了 14倍, 这为摸索抗菌肽的
高效表达条件提供了思路。后续试验拟构建重组表
达质粒 pPIC9K /De fensin
6
H is, 即在抗菌肽 Den

fensin的 C端融合 6个寡聚组氨酸标签, 利于目的
蛋白的分离纯化 [ 8] , 为抗菌肽的鉴定、抗体制备及
生物功能研究等打下基础。
参 考 文 献
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