全 文 ：
研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 5期
牛奶掺豆浆和奶粉的 PCR检测
陈沁 徐仙 姚丽萍
(上海大学生命科学学院,上海 200444)
  摘  要:  以光明纯牛奶和酸奶、蒙牛纯牛奶和酸奶为材料, 按不同浓度在牛奶中掺杂豆浆和奶粉, 提取 DNA,利用 PCR
技术检测牛奶掺杂后的多态性情况。结果表明,用引物 S111进行 PCR扩增可以有效地区分牛奶、酸奶、豆浆, 并且区分不同
品牌牛奶的产品; 用引物 S1015和 S109进行 PCR扩增能检测出牛奶中是否掺杂了豆浆,检出限为 3% ;用引物 S111进行 PCR
扩增能检测出牛奶中是否掺杂奶粉,检出限为 40%。
关键词:  牛奶 PCR扩增 豆浆 奶粉
Determ ining the Adulteration of NaturalM ilk w ith
Soym ilk andM ilk Powder Using PCR
Chen Q in Xu X ian Yao L iping
( Schoo l of L ife Science, Shanghai University, Shanghai 200444)
  Abstrac:t  Extracted DNA from adulte ra tion o f natura lm ilk w ith d ifferen t concentrations o f soym ilk and m ilk powderw as detected
by PCR and its po ly
m orph ism w as ana lyzed. The resu lts show ed that PCR electrophoretogram es of prim er S111 cou ld not only d ifferen

tia te am ongm ilk, yogurt and soym ilk but a lso distingu ish the products o f brands. Am plification of pr ime r S1015 and S109 could detect
whe ther the naturalm ilk was adu lterated w ith soym ilk w ith 3% detection lim it and the detection lim it o f aduleration o f natura lm ilk w ith
m ilk pow der using PCR am plified w ith pr im er S111 w as 40% .
Key words:  M ilk PCR am plification Soym ilk M ilk powder
收稿日期: 2009
12
14
作者简介:陈沁,女,副教授,博士,研究方向:植物生理与分子生物学; E
m ai:l chenq in cc@ yahoo com cn
随着人们生活水平的提高, 牛奶已成为大众化
食品, 但不少不法分子在经济利益的驱动下制假造
假,严重危害了消费者的利益, 牛奶的品质问题也受
到科学工作者的重视 [ 1
4]。韩东海等 [ 5 ]运用近红外
光谱技术检测纯牛奶、奶粉、掺假奶, 实现了纯牛奶
中奶粉的鉴定,当奶粉掺入量为 50%, 其正确判别
率为 100% ,但图谱的读取需要较强的专业知识,测
试仪器体积庞大。马志科等 [ 6]按两种原理进行了
牛乳中掺豆浆的鉴别试验, 原理一是由于大豆及其
制品中含有黄酮类化合物,如果牛乳中掺入豆浆,在
碱性条件下会呈明显黄色,加酸颜色消失;二是由于
大豆制品中含有异黄酮,其结构中带有酚羟基,能被
溴水氧化为黄色化合物并析出沉淀。按这两种原理
均能检出 5% 豆浆掺入量, 但化学试剂溴水本身颜
色会影响观察颜色变化,且反应受温度影响较大,一
定程度限制了试验的精确性。分子生物学检测方法
具有简易、直观的优点, 且稳定性、重复性较好 [ 7]。
鉴于此,本试验拟建立基于 PCR的检测牛奶掺豆浆
和奶粉的方法 [ 8]。
1 材料与方法
11 材料
超市购买的光明纯牛奶和酸奶、蒙牛纯牛奶和
酸奶、光明奶粉、豆浆。试验所用引物均为上海生工
合成的,序列见表 1。
表 1 引物序列
引物 序列 ( 5 ! 3 )
S128 GGGATATCGG
S129 CCAAGCTTCC
S111 CTTCCGCAGT
S1015 CTACAGCGAG
S109 TGTAGCTGGG
2010年第 5期 陈沁等:牛奶掺豆浆和奶粉的 PCR检测
12 牛奶 DNA的提取
参照田雨 [ 9]的方法略加修改。将牛奶、酸奶、
豆浆分别置于 50 mL的离心管中, 4∀ 、2 000 # g离
心 10m in,弃上清,用酒精棉球小心擦去管壁上的乳
蛋白、乳脂, 其中牛奶重复操作 3次。 10 mL PBS重
新悬浮, 轻轻振荡, 重复操作 1的离心擦拭步骤。
4∀ 、10 000 # g离心 1 m in,加入 440
L TEN ( 1mL
1 mol /L Tris+ 02 mL 05 mol /L EDTA + 05844 g
N aC l定容至 100mL)和 60
L 02 mo l/L N aOH,剧
烈振荡,直到沉淀完全悬浮, 取 600
L上述裂解液
置于15mL Eppendo rf管中, 95∀ 水浴 8 m in, 冷却
离心取上清液。加入等体积的 SEVGA (氯仿 ∃异戊
醇 = 24∃1) ,混匀, 4∀ , 12 000 # g, 离心 10 m in, 取上
清液。加入 3
L RN aseA, 37∀ 水浴 30 m in。异丙
醇沉淀, 70%乙醇洗涤,干燥, 双蒸水溶解。测 DNA
浓度, 电泳, - 20∀ 储存备用。
13 不同浓度豆浆和奶粉的牛奶的配制
分别配制含 3%、5%、10% ( v: v )豆浆的牛奶。
按奶粉外包装说明将 30 g奶粉溶于 200 mL水中,
得到奶粉溶液; 再分别配制含 0%、20%、40%、
60%、80%、100% ( v: v )掺奶粉的牛奶。同 12法分
别提取 DNA, - 20∀ 储存备用。
14 PCR反应及检测
20
L反应体系中含 10 # PCR buffer (M g2+ free)
2
L, M gC l2 ( 25 mmol /L ) 2
L, dNTP ( 25mmol /L )
32
L,引物 ( 20
mo l/L ) 2
L,模板 2
L, rTaq酶
( 5 U /
L) 02
L,双蒸水至 86
L。
反应条件: 95∀ 预变性 3 m in; 94∀ 变性 20
s, 36∀ 退火 40 s, 72∀ 延伸 1 m in 20 s; 45个循
环; 72∀ 再延伸 6 m in。取 10
L PCR 产物,
1 2% 琼脂糖凝胶 110 V电泳 40 m in, 凝胶成像
系统记录结果。
2 结果与分析
21 不同生产日期光明纯牛奶的 PCR扩增结果
为了检验不同生产日期光明纯牛奶是否有区
别,分别提取生产日期不同的光明纯牛奶的 DNA,
并测定浓度列于表 2。设计以所提取的 DNA为模
板,同一引物的 PCR扩增反应结果如图 1。由图 1
可知, 同一品牌的样品不同生产日期之间的差异较
小。以引物 S128为例, 4 d的样品均可见 5条带,为
1强 4弱,其中强带的位置也较为固定, 分子量约为
700 bp, 弱带分别约为 1 300、900、550和 480 bp。由
此可见不同生产日期光明牛奶的 PCR扩增结果保
持相对一致性。
表 2 不同生产日期牛奶的 DNA浓度测定结果
天数 ( d ) 1 2 3 4
DNA浓度
x % s(mg /mL) 448 % 029 197 % 004 132 % 007 210 % 009
又以引物 S129进行相同试验,得到相似的结果
(图 1
b), 可知牛奶的 PCR扩增具有稳定性和可重
复性。
a. 引物为 S128的扩增产物; b.引物为 S129的扩增产物; 1- 4.生
产天数分别为 1, 2, 3, 4 d的光明纯牛奶的 DNA; C对照
图 1 不同生产日期光明纯牛奶的 PCR扩增结果
22 牛奶、酸奶、豆浆的 PCR扩增结果
分别提取光明纯牛奶和酸奶、蒙牛纯牛奶和酸
奶、豆浆的 DNA并测定浓度列于表 3。由表 3可
知, 不同样品 DNA含量差异较明显, 其中光明牛奶
DNA含量远大于蒙牛牛奶, 酸奶 DNA含量比牛奶
的高,豆浆 DNA含量介于两者之间。
以上述提取的 DNA为模板, S111为引物进
行 PCR扩增反应, 结果见图 2。据图 2可见牛
奶、酸奶、豆浆三者 PCR扩增结果有明显的区别 ,
且不同品牌之间也存在差别: 光明牛奶在 400 -
163
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 5期
1 500 bp之间有条带,为 1强 7弱;光明酸奶分别在
1 200 bp、800 bp、700 bp处有弱带,在 600 bp处有 1
强带;蒙牛牛奶在 350- 1 300 bp之间有 5条弱带;蒙
牛酸奶分别在 1200 bp、900 bp处有强带; 豆浆在
400- 1 400 bp之间有条带,为 2强 4弱。
表 3 牛奶、酸奶、豆浆的 DNA浓度测定
光明牛奶 光明酸奶 蒙牛牛奶 蒙牛酸奶 豆浆
DNA浓度 x % s(m g/mL) 022 % 002 126 % 004 011 % 001 142 % 005 113 % 003
1- 5. 分别为光明牛奶, 光明酸奶,蒙牛牛奶, 蒙牛酸奶, 豆
奶; C.空白对照
图 2 牛奶、酸奶、豆浆的 PCR扩增结果
23 豆浆浓度对牛奶品质的影响
研究不同浓度豆浆对牛奶品质的影响,从含
10%、5%、3%、0%豆浆的光明纯牛奶中提取 DNA,
测定浓度见表 4。并以含 10%、5%、3%、0%豆浆的
光明纯牛奶 DNA为模板,以 S1015为引物进行 PCR
扩增,结果如图 3
a。由图 3
a可见掺有不同浓度豆
浆的牛奶有 4条共同的条带, 分别为于 1 000 bp、
800 bp、500 bp和 350 bp处, 并发现随着豆浆浓度的
递增各扩增带的强度增强,纯牛奶的条带强度最弱。
当豆浆掺入量为 3%时,多 1条分子量约为 1 100 bp
的条带,但颜色较浅; 当掺入量达 5%以后, 多 2条
分子量分别约为 1 100 bp、200 bp的条带;由此可以
有效检出 3%豆浆惨入量。
表 4 掺杂不同浓度豆浆的牛奶 DNA浓度测定
掺杂豆浆浓度 (% ) 10 5 3 0
DNA浓度 x % s(m g/mL) 297 % 011 474 % 009 225 % 016 041 % 003
  以 S109为引物进行同样试验,显示相似的结果
(图 3
b )。不同浓度豆浆的牛奶有 4条共同的条
带,分子量分别为 1 200 bp、600 bp、500 bp和 350
bp;当豆浆掺入量达 3%以后,多 2条分子量分别为
1 300 bp、1 500 bp的条带; 同样发现随着豆浆浓度
的递增各扩增带的强度增强, 检出限为 3%豆浆惨
入量。
24 奶粉浓度对牛奶品质的影响
提取含不同浓度奶粉的光明纯牛奶的 DNA,并
测定浓度列于表 5, 以了解掺奶粉对牛奶品质的影
响。从表 5可知 DNA浓度随着掺奶粉量的增加而
明显增加。
以 S111为引物,含不同浓度奶粉的光明纯牛奶
的 DNA为模板进行 PCR扩增,结果如图 4。由图 4
可知加有不同浓度奶粉的牛奶共同拥有 4条带, 分
a.引物为 S1015扩增产物; b.引物为 S109的扩增产物; 1- 8分别为
10%、10%、5%、5%、3%、3%、0%、0%豆浆; C.空白对照
图 3 不同浓度豆浆对牛奶品质的影响
164
2010年第 5期 陈沁等:牛奶掺豆浆和奶粉的 PCR检测
子量分别为 1 500 bp、1 100 bp、900 bp和 650 bp;随
着奶粉浓度的增加 650 bp条带的强度越来越强,当
浓度达 40%时,上述现象较为明显; 且浓度达 40%
时, 缺失两条分子量为 600 bp、500 bp的弱带,增加 1
条 2 000 bp的弱带。由此可见,若奶粉加入量达到
40%以上时,该方法有效;若低于 40%,则不能检出。
表 5 掺杂不同浓度奶粉的牛奶 DNA浓度测定
掺杂奶粉浓度 (% ) 0 20 40 60 80 100
DNA浓度 x % s(m g/mL) 013 % 002 044 % 002 084 % 003 133 % 005 144 % 005 287 % 009
  1- 6.分别为 0%、20%、40%、60%、
  80%、100%奶粉; C.空白对照
图 4 不同浓度奶粉对牛奶品质的影响
3 讨论
不同生产日期光明纯牛奶的 PCR扩增结果 (图
1)显示以同一引物不同生产日期光明纯牛奶的
DNA为模板进行 PCR反应,得到的扩增条带保持相
对的一致性,且产物图谱条带清晰、片段大小分布均
匀、稳定性较高, 说明在保质期内的光明纯牛奶品质
的稳定性,也体现了 PCR扩增结果的可重复性和稳
定性。分别以不同品牌和不同规格的牛奶为材料,
提取 DNA后进行扩增,结果存在明显差异 (图 2) ,
据此可鉴别不同品牌和规格的牛奶, 这为建立基于
PCR的检测体系提供了可能。
牛奶掺假现象极为普遍,常见的为加入豆浆和
奶粉尤其为刚过期的奶粉, 因为这两类物质不仅廉
价且蛋白含量高能通过牛奶蛋白测定的普通指
标 [ 10- 12 ] ,且豆浆掺入量大于 5%以上才能达到盈利
的目的 [ 13]。为防止这种情况的发生, 张东送等 [ 14]
通过毛细管电泳在牛乳中酪蛋白含量测定能检出牛
奶中 10%杂蛋白的掺入量, 虽然此方法快速、样品
用量少,但由于毛细管电泳设备昂贵,操作人员需要
一定的训练,故影响了该法的推广。荷兰食品安全
研究所 [ 15]用高效液相色谱
质谱技术检测脱脂奶粉
中掺植物蛋白的情况, 此方法的灵敏度高, 能检出
1%掺假量, 但前提需样品浓缩,且同样存在仪器体
积庞大、价格昂贵的问题。对于鲜奶中掺入奶粉的
现象,徐亚丹等 [ 16]以伊利牛奶中掺入不同浓度的伊
利奶粉为材料,通过电子鼻传感器阵列的优化能有
效检测出掺假牛奶,但此方法的数据庞大并难以处
理, 且电子鼻极其昂贵。此外,上述几种方法基本都
从测定牛奶的蛋白质入手, 导致其结果会受热处理
过程中蛋白质变性和水解的影响, 使结果失真。本
研究设计方法以 DNA为检测对象有效地解决了这
一难题。且如果建立 PCR图谱库, 可以同时检测是
否有豆浆或奶粉掺入牛奶中,同时,试验结果具有高
稳定性和重复性,结果明了易懂, 克服了大多数光学
图谱复杂难懂的缺点。
本研究运用 PCR技术对牛奶掺杂的测定是对
牛奶品质检测在分子生物学方面的一种补充, 使人
们从分子生物学的角度鉴定牛奶的品质,具有一定
的参考价值。但是该方法也有缺陷, 仅能检出含
3%豆浆的光明牛奶和 40%奶粉的光明牛奶, 若掺
杂量过少,则难以被检出,故进一步的试验将主要针
对提高该方法的灵敏度而开展。
参 考 文 献
[ 1] 李喆,王诗哲,吴也平. 牛奶掺假检验试纸的研制. 高师理科学
刊, 2004, 24( 2 ): 38
40.
[ 2] 丁伟,黄素珍,李绪英. 牛奶掺假快速检测方法的研究. 山西农
业大学学报, 1994, 14 ( 1) : 4
7.
[ 3] Karou i R, Dufour E, P illon el L, et a.l F luorescence and in frared
sp ectroscop ies: a tool for th e determ inat ion of th e geograph ic origin of
Emm ental ch eesesm anu factured du ring summ er. Le Lait, 2004, 84:
359
374.
[ 4] Rom dh ane K, Josse DB. A review of the ana lyticalm ethod s coupled
w ith ch emom etric tools for the determ ination of th e qual ity and iden

t ity of d airy produ cts. Food Chem istry, 2007, 102: 621
640.
[ 5] 韩东海,鲁超, 刘毅. 纯牛奶、奶粉、掺假奶、牛奶新鲜度的近红
外检测. 乳业导刊, 2006, 4: 39
41.
(下转第 178页 )
165
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 5期
蟹猴MHC
B基因的地域特征, 例如大部分菲律宾食
蟹猴和毛里求斯食蟹猴具有延缓 S IV感染的 MHC

B基因, 而马来尼西亚和印度尼西亚的食蟹猴却比
较少 [ 8]。引起基因地域特征的原因较为多样, 而进
化作用只是其中的一个比较主要的原因。
本试验共获得 24条Mafa
B等位基因,其中 20
条为已知序列, 4条为新等位基因。已为 NCBI收
录,收录号分别为 GQ411543、GQ411545、GQ411546、
GQ41155。由国际非人灵长类动物 MHC命名委员
会 ( IPD)命名为 Mafa
B* 01702、Mafa
B* 12801、
Mafa
B* 0380302、Mafa
B* 13001[ 9]。在每个试验
个体中均获得 6至 11条等位基因, 显示食蟹猴的
MHC
B基因为重复基因座。通过比对所获得的
Mafa
B基因, 发现在 1和 2的多态性位点较多,
这与 MHC功能是一致的。抗原结合部位的多态性
可使得 MHC
I分子识别大量的抗原肽。通过比较
食蟹猴、恒河猴及人中与 S IV 病毒感染相关的
MHC
B基因的同源性, 虽然 Mafa
B* 8301、HLA
B
* 5701、Mamu
B* 08、Mamu
B* 17被认为能延缓
血液中 S IV病毒复制,抑制 SIV疾病发展,但是彼此
之间的遗传进化关系较远,因此推测这些基因产生相
同免疫功能的作用机制可能大相径庭。而用食蟹猴
作为 S IV研究的动物模型,其试验数据的可靠性还需
要在病毒水平和细胞水平进行深入研究和验证。
参 考 文 献
[ 1] Campbell JK, Detm er MA, Karl AJ, et a.l Characterization of 47
MHC class I sequences in Fil ip ino cynom olgu sm acaqu es. Imm uno

genet ics, 2009, 61: 177
187.
[ 2] Bontrop ER. C om parative gen et ics ofMHC polym orph ism s in d iffer

ent prim ate species: dup lications and deletions. H um an Immunolo

gy, 2006, 67: 388
397.
[ 3] Uda A, T anabayash i K, Fu jita O, et a l. Iden tification of the MHC
class I B locus in cynom olgusm onkeys. Imm un ogenet ics, 2005, 57:
189
197.
[ 4] K rebs CK, J in ZY, Rudersdorf R, et a.l Unu sually h igh frequen cy
MHC class I alleles in m au rit ian orig in cynom olgu sm acaques. The
Journal of Immunology, 2005, 175: 5230
5239.
[ 5] O tt ing N, Doxiad is GG, Bon trop RE. Defin it ion of M afa
A and
B
hap lotypes in ped igreed cynom olgus m acaques (M acaca fa scicu

laris) . Imm unogenetics, 2009, 61( 11
12) : 745
53.
[ 6] Ot ting N, H eijm an sMCC, NoortCR, et a.l U nparalleled com plexity of
theMHC class I region in rh esus macaques. PNAS, 2005, 102:
1626
1631.
[ 7] Ku lsk iKJ, AnzaiT, Sh iina T, et a.l Rhesusm acaque class I dup licon
structu res, organ izat ion, and evolut ion w ith in th e alpha b lock of the
m ajor h istocompat ib ility com p lex. M ol B iol Evo,l 2004, 21 ( 11 ):
2079
2091.
[ 8 ] Pend ley JC, B ecker AE, KarlA J, et al. MHC class I characterization
of Indones ian cynom olgus m acaques. Imm unogenetics, 2008, 60:
339
351.
[ 9] Rob inson J, WallerM J, Parham P, et a.l M arsh SGE IMGT /H LA and
IMGT /MHC: sequen ce databases for the study of them ajor h istocom

pat ib ility comp lex. Nucleic Acids Research, 2003, 31: 311
314.
(上接第 165页 )
[ 6] 马志科, 王倩. 牛乳中掺豆浆的鉴别试验. 黄牛杂志, 1997, 23
( 3) : 32
33.
[ 7] Lopez
C alleja I, GonzalezA lon so V, FajardoMA, et a.l Appl icat ion of
a po lym erase ch ain reaction to detect adu lterat ion of ovin e cheeses
w ith caprine m ilk . Eur Food Res Techno,l 2007, 225: 345
349.
[ 8 ] 徐仙,陈沁,雍克兰,韩奕奕. PCR方法在区分牛奶牧场来源中的
应用.食品科技, 2008, 12: 258
261.
[ 9 ] 田雨,从牛奶中分离 DNA方法的建立. 乳业科学与技术, 2006,
118( 3 ): 112
113.
[ 10 ] M arabol iA, C attaneo T. M. P, G iang iacom o R. D etect ion of vegeta

b le p roteins from soy, pea and wh eat isolates inm ilk pow der by near
in frared sp ectroscopy. Journ alofN ear Infrared Spectroscopy, 2002,
10( 1 ): 63
69.
[ 11] G arciaM C, TorreM, M arinaM L, et a.l C ompos it ion and ch aracter

ization of soyabean and related produ cts. C rit ical Review s in Food
Science andNu trition, 1997, 37: 361
391.
[ 12 ] Lusas EW, Riaz MN. S oy Protein Products: Processing and U se.
The Journal of Nutrition, 1995, 125( 3S) : 573
580.
[ 13 ] H aasnootW, O liem an K, Cazem ierG, et a.l Direct b iosensor immu

noassays for the detection of nonm ilk proteins in m ilk pow der. Jour

nal ofA gricu ltu ral and Food Ch em istry, 2001, 49( 11) : 5201
5206.
[ 14 ] 张东送,庞广昌,高法国,等. 毛细管电泳在牛乳中酪蛋白含量测定
及掺假检测方面的应用. 食品与发酵工业, 2005, 31(1) : 130
132.
[ 15 ] Luykx DMAM, Cordew en er JHG, et a.l Iden tif icat ion of p lant p ro

tein s in adu lterated sk imm ed m ilk pow der by h igh
p erform ance liq

u id ch rom atography
m ass spectrom etry. Journal of Ch rom atography
A, 2007, 164: 189
197.
[ 16 ] 徐亚丹,王俊,赵国军. 检测掺假牛奶的电子鼻传感器阵列的优
化. 传感技术学报, 2006, 19 ( 4) : 957
962.
178