全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 4期
链球菌合成透明质酸的研究进展
张容鹄1, 2 白洋 1 冯建成 1 温珍昌 1
( 1海南优势资源化工材料应用技术教育部重点实验室 热带生物多糖利用教育部工程中心 海南大学材料与化工学院,海口 570228 ;
2海南省农业科学院农产品加工设计研究所,海口 570110)
摘 要: 透明质酸是一种具有极大商业价值的线性、高分子粘多糖, 微生物的生物合成是透明质酸来源的首选。主要
综述链球菌合成透明质酸的研究概况,分析了目前存在的主要问题及解决途径,并对其前景进行了展望。
关键词: 链球菌 透明质酸 生物合成 进展
Research Development of Hyaluronan B iosynthesis in Streptococci
Zhang Ronghu
1, 2
BaiYang
1
Feng Jiancheng
2
W en Zhenchang
1
(
1
K ey Laboratory forH ainan sNatural Resources Chem icalM aterials App lication Technology, T rop icalB ioEngineering Center forM inistry of
Education Poly saccharide U tilization, Co llege of M aterials and Chemical Engineering, H ainan University,H aikou 570228;
2
Farm Produce Processing and D esign R esearch Institute, H ainan A cademy of Agricultural Sciences, H aikou 570110)
Abstrac:t H yaluronic ac id (HA ) is a comm erc ially va luab le linear g lycosam inog lycan w ith h igh m o lecularw e ight, and m icrob ia l
production is the pre ferred source of HA. In th is review, the recent progress on HA producing by S trep tococcus was desc ribed. In add i
tion, the ma in problem s in HA produc tion were also discussed, and them ethods w ere put forwa rd fo r the research and industr ia l produc
tion. M oreover, the prospect o f this research w as proposed.
Key words: S trep tococci H yaluronic ac id B iosynthesis Developm ent
收稿日期: 20100107
基金项目:海南省自然科学基金资助项目 ( 509003 )
作者简介:张容鹄,女,助理研究员,研究方向:农产品加工; Em ai:l zrh0912@ 126. com
通讯作者:冯建成,男,副研究员, Em ai:l fjc197228@ 126. com
透明质酸 ( hyaluronic acid, 简称 HA )又名玻璃
酸,最初于 1934年由美国哥伦比亚大学 KarlM eyer
和 John Pa lmer从牛眼玻璃体中分离出而得名 [ 1 ]。
HA是一种均一的、重复的、线性高分子粘多糖, 是
由 2 000- 25 000个 D葡糖醛酸与 N乙酰葡糖胺组
成的二糖结构单位,以 1, 3和 1, 4糖苷键交替
连接而成,广泛的分布于玻璃体、骨关节滑液、皮肤
等处。通过 HA的特异性受体如 CD44和 RHAMM
等介导, HA具有多种特异的生物学功能。高含量
的 HA大量出现在细胞增殖和细胞迁移的区域,研
究其机理,对于特殊食品的研发、眼科手术、形态发
生、组织修复、癌症转移控制及新颖的药物载体设计
具有重要的意义 [ 2]。微生物的生物合成是 HA来源
的首选。主要综述链球菌在合成 HA的研究上所取
得的进展,分析了目前存在的主要问题和解决途径,
以期为 HA的生产研究提供借鉴。
1 HA的特性及其应用
HA是一种独特线性粘多糖, 各种来源纯化出
的 HA, 其分子量范围从 104 - 107Da。在生理溶液
中, HA展示出构象上的刚性源于 糖苷键、内在的
氢键及其与溶液的相互作用, 因而 HA在溶液中呈
现出伸展卷盘结构, 占据很大的区域。近来的研究
表明,它的分子结构采用反式, 片层式的稳定的三
级结构。其流变学的特性主要依赖于 HA的分子量
和浓度 [ 3]。HA具有独特的黏弹性, 无免疫源性或
毒性,在胚胎发生、信号转导、细胞运动及癌细胞的
侵入转移中起着重要的作用 [ 4]。HA在临床上的应
用主要依赖于其分子量的大小, 因为分子量反映出
它的生物学功能。高分子量的 HA有好的黏弹性,
可广泛用于眼科学、整形术、伤口愈合;而低分子量
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
的 HA作为保湿因子用于化妆品和滴眼液中的润
滑剂 [ 5]。
20世纪 70年代, B alazs及其同事发展了从组织
中提取 HA的方法并应用于医疗中。HA的第一个
商业化的产品 Healon于 1979年面世, 主要用于辅
助治疗眼科手术,如白内障摘除、青光眼、角膜移植
等,已有近 3 000万病人使用; 而另一产品 V iscoa,t
从 1983年起已用于 2 600万例眼科手术。HA另一
个主要用途是用作骨关节的黏性填充剂, 首次在
1987年用于日本; 在美国, HA在 1997年被允许作
为骨关节的黏性填充剂后,其市场每年以 15%速度
激增 [ 6]。HA作为化妆品用的填充材料特别受欢
迎,是因为其不需做皮肤测试, 而且皮肤过敏的风险
极低, 截至 2008年 12月 31日已有 8种 HA填充材
料产品获得美国 FDA批准。目前全世界对于 HA
的市场需求价值,在日本约为 3亿美元,美国大致相
当,而欧洲在 1亿美元左右 [ 7]。
2 链球菌生产 HA
目前, HA主要从 3个方面获取: 人脐带、鸡冠
和溶血性的 A、C族链球菌培养物。前面两种来源
主要有产量低, 生物污染和 HA的纯化要花费大量
的人力物力等缺点; 同时由于种间病毒传递危险及
其它外来的感染,使得来源于动物组织的生化产品
遭到日益强烈的反对。细菌来源的 HA具有技术、
经济及伦理上的优势。因此微生物合成法生产透明
质酸逐步取代动物组织提取法,成为透明质酸来源
的首选方法 [ 8]。
2. 1 菌种
产 HA的菌种主要是 A组和 C组链球菌, A组
中主要有化脓链球菌 ( S. py og enes) , 其治病性强较
少作为生产菌种; C组中主要有马疫链球菌 ( S.
equi )、兽疫链球菌 ( S. zooep idem icus )、类马链球菌
(S. equisim ilis)等, C组链球菌属于非人体致病菌,
适合于大规模发酵生产。马疫链球菌兰氏 A、C群
合成的 HA, 是组成其胞外荚膜的主要成分。在羊
血琼脂平板上, 这些具 溶血性的细菌产生透明
圈。HA荚膜在这些链球菌中作为毒性因子, 推测
其为细菌提供一项特殊功能,使其在侵染高等生物
时,不被其免疫系统识别为外源抗原。某些链球菌
在整个生长期都有荚膜, 而有些链球菌在对数生长
期的前段产生,后段消失, 或在稳定期消失, 有的则
根本不产生荚膜。研究发现, 链球菌是否产生荚膜
与透明质酸酶 ( hya luron idase , HA ase)有关, 荚膜消
失是由于被 HA ase降解。根据是否产生 HA 和
HA ase, 将有荚膜的链球菌 C组分为 3类, 分别为只
产生 HA,不产生 HA ase; HA和 HA ase都产生; 只产
生 HA ase, 不产生 HA。HAase的产生对 HA发酵生
产非常不利,在筛选菌种时, 要注意观察菌种是否同
时产生 HA ase[ 9, 10]。
从 20世纪 80年代早期,已经开始用 C群链球菌
发酵法商业化生产透明质酸。筛选生产 HA的微生
物菌种很大程度上是一个随机的过程,野生型菌种的
一大缺陷是它们在发酵中产生含有降解 HA的透明
质酸酶和其它的胞外蛋白,不利于 HA的积累;另一
缺陷是产生 溶血素,能够导致溶血作用 [ 11]。陈永
浩等 [ 12]以马链球菌为出发菌株, 通过物理诱变剂紫
外线和 60Co射线辐照诱变, 得到一株无溶血性菌
株 NC1150,该菌的产量和分子量均大幅度提高; k im
等 [ 13]采用化学诱变剂 NTG (N甲基N硝基N亚硝
基胍 )对 S. equi ATCC6580进行化学诱变, 获得双缺
陷型产高分子量 HA的突变菌; 而本课题组 [ 14, 15]对
S. equi SH0,分别进行了物理诱变 (紫外线诱变 ),化
学诱变 (NTG诱变 ), 以及紫外线加 NTG复合诱变等
方式,分别筛选到一些产大分子 HA的突变菌株,同
时筛选到的突变菌株无溶血性和无透明质酸酶活性,
且遗传稳定性好。从专利 [ 16]和已有的试验结果可以
看出,应用物理、化学突变和一系列筛选,可成功获取
无溶血性和透明质酸酶缺陷型菌种,证明是一种有效
获取优良菌种的手段,同时随机突变还可以获取产高
分子量 HA的菌种。
2. 2 HA的合成途径
HA是由两种单糖 ! ! ! D葡糖醛酸和 N乙酰葡
糖胺聚合而成。在 A群和 C群链球菌中, HA的合成
途径见图 1[ 6]。葡萄糖作为起始碳源,有两条代谢路
径最终形成 HA的两个前体。M atsubara等 [ 17 ]运用 13
C标记 NMR对 S. zooep idem icus的研究证实, D葡糖
醛酸与 N乙酰葡糖胺分别来源于 6磷酸葡萄糖和 6
磷酸果糖。葡萄糖第一步生成 6磷酸葡萄糖,这是许
多有机体中贮存性多糖生成的通用步骤; 葡萄糖
磷酸变位酶可逆地催化 6磷酸葡萄糖转变为 1磷
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2010年第 4期 张容鹄等:链球菌合成透明质酸的研究进展
酸葡萄糖; UDP葡萄糖焦磷酸化酶催化 UTP和 1磷
酸葡萄糖生成核糖 UDP葡萄糖, 后者在 UDP葡萄
糖脱氢酶的作用下生成 HA合成的一个前体, UDP
葡萄糖醛酸。起始于 6磷酸果糖的通路主要与氨
基糖的生成相关,在转氨酶的作用下,谷氨酸的氨基
转移到 6磷酸果糖生成 6磷酸葡萄糖胺, 最后在乙
酰转移酶作用下转乙酰基生成 N乙酰6磷酸葡糖
胺,这是一个耗能步骤;在变位酶的作用下, 又生成
N乙酰1磷酸葡糖胺, 最后在焦磷酸化酶的作用
下,加入 UDP生成 HA合成的另一个前体, UDPN
乙酰葡萄糖胺。最后, 两个前体在 HA合成酶的作
用下生成 HA。
图 1 链球菌合成 HA的途径
2. 3 HA合成酶及其特性
合成 HA的酶是 HA合成酶 (HASs) ,该酶系是
整合在细胞膜的糖基转移酶, 集 HA聚合和转运到
胞外基质等功能于一体。基于结构的相似性和酶学
的特性,已知的 HA合成酶系可以划分为两类, 链球
菌和脊椎动物属于 I类 HASs, 而来源于 Pasteurella
multocida的 HASs是惟一属于 II类 HASs[ 18 ]。 II类
的 HASs与 I类的 HASs明显的区别在于酶的结构,
膜的拓扑学结构, 以及 HA合成的机理。按照从链
球菌 HASs酶系研究获得的信息, HASs必须包含至
少 7种明显的功能,包括 UDPG lcNA c受体的结合;
UDPG lcA受体的结合; HAG lcAUDP供体结合;
HAG lcNAcUDP供体结合; HAG lcNA cUDP: UDP
G lcA, 1, 4 ( HAG lcNA c )转移酶; AG lcAUDP:
UDPG lcNA c, 1, 4( HAG lcA )转移酶; HA的跨膜
转运 [ 19]。
HASs是 HA合成中惟一需要的蛋白质, 其功能
是通过还原端的延伸合成 HA, 它不需外部引物或
共价结合的引物, 合成 HA中无共价连接的中间体
的形成,而链的跨膜转运,以及链终止机理仍然存在
争议。链终止机理具有理论和实践上双重重要性,
因为 HA的分子量是生产中希望控制的重要参数。
W eige l及其同事 [ 20]提出 HA链是由 HA合成酶自身
形成的小孔伸出的,而链的终止则是链上剪切作用
而产生,链长或多或少是固定的。这一假说尽管获
得突变研究的某些支持, 但没有直接的证据证明
HASs与 HA的跨膜运输有关, 因此该假说很难成
立。另外的模型包括随机终止和流产迁移, Forsee
等 [ 21]基于 S trep tococcus pneumoniae提出了流产转移
模型,他认为链终止是由于在一种底物浓度太低或
缺乏时,链合成即终止并释放。因而产生高分子量
HA的前提是要求前体物质的平衡而不是仅仅要求
前体物的丰富。
2. 4 链球菌发酵生产 HA
2. 4. 1 发酵模式及参数的优化 链球菌属于兼性
厌氧菌, H uang[ 22]和 Duan[ 23]的研究都发现,链球菌
在有氧发酵条件下生产 HA的产量比无氧发酵条件
下高。已有很多学者对链球菌合成 HA进行了深入
研究,包括影响生物量、HA产量及分子量的各种因
素, 如发酵模式,培养基的组成,溶氧等。
在发酵模式上, 分批发酵在链球菌发酵生产
HA中仍然占支配地位。连续发酵尽管有利于延长
培养时间,减少蛋白质的污染,但由于高度囊膜包裹
的链球菌在连续培养中 HA生产的不稳定性, 使得
HA在恒化器中生产不容易得到 [ 23 ]。分批发酵中溶
氧水平对生产 HA的影响目前仍然存在不同看法。
HA的发酵培养基具有非牛顿流变学特性, 改变搅
拌速率和通气率是调节溶氧的两种主要方式。
Gao
[ 24]发现搅拌能增加 HA产量,但增加转速降低
HA的分子量; 而 K im[ 13]研究认为高的搅拌速率使
HA分子量增加显著,但降低 HA的产量和微生物的
生物量。A rmstrong [ 25 ]认为 HA的分子量与搅拌速
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
率无关, 高的通气率有利于高分子 HA的积累,
K im
[ 26 ]则认为当通气率超过 0. 5 vvm降低 HA的产
量, Duan[ 27]的研究表明高溶氧和较为温和的剪切环
境,有利于高分子量 HA的生产。因而这一问题还
有待进一步探索。
链球菌对于培养基的要求极其苛刻, 由于没有
TCA循环,缺乏必须的合成大部分氨基酸和核苷的
前体, 因而其培养基必须富含嘌呤、维生素和超过
10种以上的氨基酸。典型的生长培养基是多采用
葡萄糖作为碳源,并在培养基中补充小牛血或血清。
Zhang等 [ 28]的研究发现对于 S. zooep idem icus NU JST
01,采用淀粉做惟一碳源,不添加血清, 也能生产高
质量的 HA;在氮源的选择上, 高海军等 [ 29 ]认为最适
宜的氮源为酵母浸膏。而本课题组研究发现, 对于
S trep tococcus equi SH2而言,酵母浸膏和牛肉膏以质
量比 2∀1组成的混合氮源最利于 HA的生产 [ 30] ,推
测可能是不同的菌种对于氮源的要求不同造成的。
在培养基的组成上, K im [ 13]和 Ogrodow sk i[ 8]研究了
在 S trep tococcus equi突变体的分批发酵中加入溶菌
酶,能提高 HA的产量及其分子量,推测主要是溶菌
酶对于链球菌细胞壁的破坏作用, 使菌体产生生理
反应, 用生产更多的 HA来保护细胞壁。目前采用
化学限定性培养基 ( chem ically defined m edium ,
CDM ) )来研究链球菌营养物的代谢成为热点, 文献
中报道采用的 CDM培养基多类似于复合培养基,主
要含有葡萄糖,氨基酸,核苷酸、无机盐和微量元素
及维生素 [ 19]。
2. 4. 2 基于发酵水平上代谢通路分析 对于分批发
酵模式下生产 HA的研究主要集中于发酵参数优化,
而基于发酵水平上代谢通路分析研究较少。代谢通
路分析 (metabo lic flux analysis, MFA ) )可决定代谢通
路的流向,并比较环境变化时其代谢流向的响应, 可
对目前微生物的生理和新陈代谢做深入的了解 [ 31]。
链球菌是乳酸发酵型细菌, 分批发酵中主要产
物来自于葡萄糖分解代谢生成的乳酸以及少量的甲
酸、乙酸和乙醇。葡萄糖中的碳元素绝大部分流向
发酵产物中, 少量用于细菌生物量增加。对于 HA
的发酵而言, HA的合成和细胞生长所耗碳源占 5%
- 10% ,而 80% - 85% 的碳源用于合成乳酸和醋
酸,细胞生长与 HA的合成竞争碳源和能源的利用,
同时乳酸还能抑制细胞生长和 HA的合成 [ 32]。它
们之间的关系见图 2。
图 2 链球菌细胞生长, HA合成及乳酸累积三者关系图
基于链球菌的代谢特性, 可以通过降低细胞生
长对 HA合成的竞争及乳酸的抑制作用来促进 HA
的合成。目前,已有一些用 MFA法研究链球菌合成
HA的报道。G ao等 [ 24]用 MFA方法对 S. Z ooep i
dem icus分批发酵中影响合成 HA的关键因素进行
了研究,包括 HA的产量、生物量、碳源的消耗、能量
流等几个方面; L iu等 [ 32]考虑到细胞的合成 (HA合
成酶的合成 )和乳酸的生产 (产生能量 )是 HA合成
的前提,通过调节 pH值可调控碳源的走向,提出间
歇的碱调控策略,以提高 S. zooep idem icus发酵生产
HA的产量。该策略可重新指导碳源的走向, 增加
NADH氧化酶的活性 ( NOX ) , 更易于 HA的合成。
Duan等 [ 23, 27]通过代谢通路分析发现, HA的合成通
路是一个独立的网络,几乎不受溶氧的影响,而代谢
物乳酸和醋酸受影响最大,在高的溶氧条件下,伴随
着醋酸的生成, 更多的 ATP产生; 推测 HA的分子
量依赖于 ATP的产生及活性氧的种类。以上研究
证明代谢路径分析 (MFA )对于优化链球菌发酵法
生产 HA的重要性。
2. 5 生产 HA的新方法
目前,基于生产 HA有机体基因组信息的遗传
学或代谢工程学方法, 为 HA的生产提供了新的思
路。有些链球菌包括 S. pyogenes[ 33 ] , S. mu tans[ 34] ,
Sagalactiae[ 35 ]完整基因组序列已经获取, 在链球菌
中涉及编码 HA合成的基因位于 has操纵子的单顺
反子转录单元。在 S. equ isim ilis和 S. zooep idem icus
链球菌中,有 4个基因组成一个操纵子编码 HA的
合成, 依次为 hasA (编码 HA合成酶 ); hasB ( UDP
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2010年第 4期 张容鹄等:链球菌合成透明质酸的研究进展
G lc脱氢酶 ) ; hasC (编码 UDPG lc焦磷酸化酶 ) ;
hasD(编码 UDPG lcNA c焦磷酸化酶 )。对于链球菌
的遗传操纵,已经可以运用多种载体,如用于插入突
变的载体和用于诱导表达的载体。另外一条思路是
运用代谢工程学的方法, 平衡 HA合成两种前体分
子形成的通路来实现。
按照合理的设计, 使用基因组插入辅之以转录
物分析、代谢物分析和酶学分析更易优化 HA的生
产,通过在异源宿主中表达 has基因, 是生产 HA的
新途径。目前有报道选择 Bacillus subtilis作为重组
表达的宿主菌,原因是可以用价格低廉基本培养基
发酵生产 HA, 同时生产的 HA易于后续的分离,发
酵中不产毒素和透明质酸酶;与大肠杆菌表达系统
相比, B. subtilis过表达 hasA不影响细胞的生长。
为了在 Bacillu s subtilis中重组生产 HA,需要人工构
建表达载体, 其操纵子含有来自 S. equisim ilis的
hasA基因,以及前体基因或者来自 S. equisim ilis的
hasB /C /D基因 [ 36]。 Graves等 [ 37 ]还报道了一种全
新的 HA生产体系 ! 绿藻病毒 PBVC1( chlore lla v i
rus PBVC1)。PBVC1的双链基因组含有编码 HAS
酶, UDPG lc脱氢酶和谷氨酸 6磷酸果糖氨基转移
酶的基因。这些基因在绿藻病毒 PBVC1感染绿藻
过程中,在极早期进行表达, 感染后 30 m in内, HA
纤维即出现在被感染的绿藻表面, 日本科学家已经
从 1 L被 chlorella virus感染的绿藻细胞培养物中,
提取出 0. 51 g的 HA, 该体系无疑为 HA的生产提
供新的思路。
3 存在的主要问题及解决途径
在过去的几年中, 通过链球菌发酵法生产 HA
尽管已到相当高的水平, 目前链球菌分批发酵后生
产的 HA可达 510 g /L,因而,如何提高透明质酸的
质量而不是产量成为菌株筛选和过程优化的重点。
影响 HA质量最为关键的两个参数,一个是分子量的
分布,一个是纯度。因此链球菌合成 HA亟待解决的
瓶颈问题主要是如何提高 HA的纯度和分子量。
目前, 国内外的研究重点过多集中于优化发酵
参数以提高的 HA产量上, 而对于影响高分子量 HA
形成的机理,高分子量 HA产生菌的筛选及如何提
高 HA纯度等问题的研究上存在不足, 为提高透明
质酸的质量,主要应从以下几个方面开展工作:高分
子量 HA产生菌突变株获取。随机突变可采用物理
诱变、化学诱变或生物诱变等方式;筛选出的菌种不
仅无溶血性、透明质酸酶缺陷型,遗传稳定性优良,
而且应能稳定的生产高分子量 HA。采用化学限定
性培养基,优化链球菌生物合成高分子量 HA的营
养条件。采用代谢通路分析方法 (MFA ) ,从整体上
研究碳源、氮源及无机盐的代谢流向对于 HA分子
量累积的影响。在分批发酵的基础上,开展对链球
菌连续发酵生产 HA的研究, 逐步摸索提高 HA纯
度的方法。综合运用基因工程和代谢工程学方法,
进一步开展对异源宿主生产 HA的研究, 弄清高分
子量 HA形成的机理。
4 展望
国内外学者对链球菌生物合成 HA进行了大量
研究,尽管取得了很大进展, 但尚有许多未解之谜。
传统的菌种及发酵过程的优化对 HA产量的提高效
果非常明显,但趋于到达一个上限,而利用代谢工程
的方法正在提供新的研究思路, 通过不同的宿主生
产 HA的方法即将面世。为充分挖掘代谢工程法研
究 HA的潜力, 必须更深入地理解 HA合成的链终
止机理。目前最需要研究体内 HASs酶的动力学,
探讨体内代谢物浓度,酶的活性和分子量特性之间
的联系,可以预计基于基因工程和代谢工程方法的
综合运用, HA分子量控制机制,影响 HA纯度的因
素等困惑终会被解开。
参 考 文 献
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