全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第5期
收稿日期:2008-08-08
基金项目:山东省农科院重大成果培养基金(2006YCG012),山东省农业科学院高技术创新基金(2006YCX027)
作者简介:王英杰(1982-),女,硕士,研究方向:分子生物学;E-mail:wyj2468@163.com
通讯作者:杨宏军(1976-),男,博士,研究方向:动物传染病诊断与防治;E-mail:longfei1997@sina.com
金黄色葡萄球菌能产生血浆凝固酶,它是一种能使含有枸椽酸钠或肝素抗凝剂的人或兔血浆发生凝
固的酶类物质,致病菌株多能产生此类物质,常作为鉴别葡萄球菌有无致病性的重要标志。凝固酶有 2种:
一种是分泌至菌体外的,称为游离凝固酶。作用类似凝血酶原物质,可被人或兔血浆中的协同因子激活变
成凝血酶样物质后,使液态的纤维蛋白原变成固态的纤维蛋白,从而使血浆凝固。另一种凝固酶结合于菌
体表面并不释放,称为结合凝固酶或凝聚因子,在该菌株的表面起纤维蛋白原的特异受体作用,细菌混悬
于人或兔血浆中时,纤维蛋白原与菌体受体交联而使细菌凝聚[1~3]。
凝固酶耐热,粗制品 100℃,30min或高压灭菌后仍保持部分活性,但易被蛋白分解酶破坏[1]。凝固酶和
PCR扩增血浆凝固酶基因检测致病性金黄色葡萄球菌
王英杰 2 王长法 1 陈营 2,3 安利国 2 杨桂文 2
仲跻峰 1 杨少华 1 杨宏军 1
(1山东省农业科学院奶牛研究中心,济南 250100;2山东师范大学生命科学学院,济南 250014;
3烟台大学化学生物理工学院,烟台 264005)
摘 要: 金黄色葡萄球菌致病株能同时产生两种蛋白质,一种分泌于菌体外,另一种结合在菌体表面,它们能使含
有抗凝剂的家兔或人的血浆凝固,称为凝固酶(Coagulase)。凝固酶是检验致病性金黄色葡萄球菌的重要指标。试验根据
GenBank公布的血浆凝固酶序列,设计特异PCR引物,利用聚合酶链式反应扩增出金黄色葡萄球菌凝固酶基因,克隆测
序,与Genbank中已公布的序列同源性达到100%,并且检测结果与用兔血浆进行血浆凝固酶实验结果完全吻合,建立了
金黄色葡萄球菌性乳腺炎的快速诊断方法。
关键词: 金黄色葡萄球菌 PCR 血浆凝固酶
IdentificationofCoagulaseGeneofPathogenicStaphylococcus
aureusBovineMastitisbyPCR
WangYingjie2 WangChangfa1 ChenYing2,3 AnLiguo2 YangGuiwen2 ZhongJifeng1
YangShaohua1 YangHongjun1
(1DairyCatleResearchCenter,ShandongAcademyofAgriculturalScience,Jinan250100;2ColegeofLifeScience,
ShandongNormalUniversity,Jinan250014;3ColegeofChemistryandBiology,YantaiUniversity,Yantai264005)
Abstract: Staphylococcusaureuscanproducttwoproteinssimultaneously,oneofwhichsecretectobacteria,andthe
othercansectretendobacteria.Theywerecaledcoagulase,whichcanenablethebloodplasmacontainingdecoagulantof
therabbitorhumantoclot.Coagulaseisanimportantindexesindetectionofpathogenic.Accordingtothesequence
ofcoagulaseinGenbank,apairofoligonucleotideprimerswasdesigned.Polymerase-ChainReaction(PCR)wasusedto
amplifyasequenceofCoagulasegene,andcloningandsequencingfolowed.Itsharedtheidentityof100%withgenethat
reportedingenbank.Theidentificationresultwasidenticaltothecoagulaseexperimentinwhichrabbitbloodplasm was
used.ThisexperimentestablishedarapiddiagnosismethodtodetectpathogenicStaphylococcusaureusbovinemastitis.
Keywords: Staphylococcusaureus PCR Coagulase
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葡萄球菌的毒力关系密切。凝固酶具有抗原性,并且有助于致病菌抵御宿主体内吞噬细胞和杀菌物质的作
用,同时也使感染局限化[4]。
本试验的目的是建立一种在分子水平上快速检测金葡菌血浆凝固酶的 PCR方法。通过此方法对山东
省内 20多个规模化牛场乳腺炎病例中分离得到的金葡菌进行检测[5,6],检测奶牛乳腺炎金葡菌中血浆凝固
酶[7],可为研制奶牛乳腺炎金葡菌基因工程疫苗提供科学的依据。
1 材料
1.1 菌株和样品
金黄色葡萄球菌临床分离株 JN43由本试验室鉴定保存。标准株金黄色葡萄球菌 (Sta.aureusATCC
25923)和大肠杆菌(E.coliATCC35218)均购自杭州天和微生物工程公司;无乳链球菌(Str.agalactiaeCVCC
1886)购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。
1.2 试剂
高盐甘露醇琼脂、营养琼脂(杭州天和)、Tris(上海生工)、Agarose、Tryptone、YeastExtract(OXOID)、溶
菌酶 (上海伯奥)、蛋白酶 K(Merck)、Ampicilin(北京鼎国生物技术公司)、pMD18-T载体、BamHⅠ和
HindⅢ(TAKARA),其他试剂国产分析纯。
2 方法
2.1 引物设计
根据公开发表的基因序列设计引物,并由上海生工合成如下引物对:xjngmj1:5-GAGATACAGACAATC
CACATAA-3;xjngmj2:5-CTACCTTCAAGACCTTCTAAAA-3扩增目的基因:601bp。
2.2 金黄色葡萄球菌模板提取
将金黄色葡萄球菌标准及分离株接种在 LB液体培养基中,37℃摇菌过夜,取 1.0ml菌液于离心管中,
12000r/min离心 3min,TNE洗一次,200μlTE重悬,加 4μl溶菌酶(50mg/ml),37℃水浴 1h,加 4μl蛋白酶 K
(25mg/ml),55℃水浴 1h,煮沸 10min,冰浴,12000r/min离心 5min,取上清作模板。
2.3 PCR循环参数
94℃预变性 3min;94℃:1min,52℃:45s,72℃:1min,30个循环;72℃延伸 10min。
2.4 DNA琼脂糖凝胶电泳
取 5μlPCR扩增产物在 1%琼脂糖凝胶中,以 1×TAE缓冲液,110V电压电泳 30min,溴化乙锭染色,紫
外线下观察,记录结果并拍照保存。
2.5 PCR检测金葡菌临床分离株
将所有保存的临床分离株金黄色葡萄球菌提取模板,利用建立的 PCR方法进行血浆凝固酶基因的检
测,产物进行琼脂糖凝胶电泳,溴化乙锭染色,紫外线下观察,记录结果并拍照保存。
2.6 兔血浆凝固酶实验
采用试管法,取小试管 3支,每支加 1:4稀释的新鲜的兔血浆 0.5ml,其中一支加被检细菌生理盐水悬
液或肉汤培养物 0.5ml,另一支加阳性菌株生理盐水或肉汤培养物 0.5ml,再一支加生理盐水或肉汤培养基
0.5ml作为阴性对照。将 3支试管置于 37℃水浴箱中,每隔 30min,观察一次结果,在 3h内若试验管和阳性
对照出现凝固,阴性对照不出现凝固,为阳性。多数阳性细菌在 0.5~1h内发生凝固,极少数阳性细菌,须在
24h后才发生凝固,说明凝固力较弱[8,9]。并且检测结果与 PCR检测结果完全一致。
3 结果
3.1 特异性检测
利用设计的聚合酶链式反应条件,将金黄色葡萄球菌标准及临床分离株,大肠杆菌和链球菌标准株进
行了扩增反应,仅金黄色葡萄球菌在 761bp位置出现特异性条带(图 1),其它菌株未发现条带。证明此方
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法特异性良好。
3.2 敏感性试验
取过夜培养的细菌培养物,于 OD600测其菌体浓度,然后取菌液进行梯度稀释,1×104cfu/ml~6.25×102
cfu/ml,按照 2.2方法提取模板进行敏感性试验。结果显示当模板稀释到 1.25×103cfu/ml时,仍能检测到目
的条带。
图 1 引物特异性试验 图 2 敏感性检测试验
M:Marker2000 1:金葡菌 ATCC25923 2:大肠
杆菌 ATCC35218 3:无乳链球菌 CVCC1886
M:Marker2000 1~4:金黄色葡萄球
菌模板依次倍比稀释
3.3 临床分离株检测结果
通过对奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌临床分离株血浆凝固酶基因检测发现,60%的菌株存在此基因,这
就证实了血浆凝固酶在乳腺炎致病中的重要作用(图 3)。
4 讨论
金黄色葡萄球菌的凝固酶能使含有抗凝剂的家兔或人血
浆凝固,类似凝血酶原作用[10]。Jonsson等(1985)发现 α-HL和凝
固酶能协同作用引发小鼠乳腺炎。根据其生物学功能,推测其
在奶牛乳腺炎的病理过程中具有十分重要的作用,可能正是首
先由溶血素造成乳腺局部毛细血管穿孔,红细胞破裂,然后通
过凝固酶的作用导致乳腺导管及乳腺小泡内的血液和乳汁等
物质发生凝固,导致局部的阻塞,由于血管和乳腺导管的闭塞引发局部微循环障碍,诱发局部乳腺组织的
水肿,进而导致乳腺炎的发生。
试验发现,在奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌临床分离株中[11],60%的菌株存在血浆凝固酶基因[12],说明此
酶在金黄色葡萄球菌致病中具有比较重要的意义,为进一步克隆表达此基因,并进行体外乳腺炎模型建立
提供了一定的科学依据。
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图 3 临床分离株金葡菌血浆凝固酶基因检测
王英杰等:PCR扩增血浆凝固酶基因检测致病性金黄色葡萄球菌 187
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(上接第184页)
有毒赤潮藻类培养是藻体含有藻毒素的关键。Lim和 Ogata[21]在研究产生麻痹性贝毒(PSP)的塔马亚历
大藻(A.tamarensis)时发现,来源于相同亲细胞的不同亚株,在相同培养条件下其产毒量差别较大[22]。此
外,不同的培养条件对藻体藻毒素含量也具有一定程度的影响[23]。采用的微小亚历山大藻 LJX02株系,经
过多次培养的藻细胞均获得了藻毒素,表明该株系比较稳定,且培养条件适合该株系产藻毒素。
不同藻细胞生长周期接种对于藻细胞生长具有较大影响。接种处于稳定期的藻细胞,需要经过 5~6d
迟缓期才能进入对数期生长,而接种对数期的藻细胞则可立刻进入对数生长期,且最高藻细胞生长密度可
达约 30000ml-1,表明本试验藻细胞培养技术达到了较高水平。
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