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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 7 期
新生犊牛睾丸细胞体外培养获取类 EGC集落
李冬旭 郑鹏 黄贺 田亚光 张贵学
(东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030)
摘 要: 在不同条件下培养新生犊牛睾丸细胞，3 － 4 d 生成类似胚胎生殖干细胞(EGC)集落，通过对集落进行形态学
观察，免疫荧光细胞化学染色等技术，分析鉴定细胞集落是否为 EG细胞集落或精原细胞过渡状态。
关键词: 新生犊牛睾丸细胞 EGC EGC集落 免疫荧光
Newborn Calf Testis Cells Cultured in vitro for EG-like Cell Colony
Li Dongxu Zheng Peng Huang He Tian Yaguang Zhang Guixue
(College of Animal Science and Technology，Northeast Agricultural University，Harbin 150030)
Abstract: Newborn calf testis cells were cultured in vitro under different conditions． Colonys similar to embryonic germ cell
(EGC)colonys could be obtained after the testis cells were cultured 3 － 4 days． Cellular morphology was observed and immunofluores-
cence staining techniques were used to analyze and identify whether the cell colonys were EGC colonys or the transition state of spermato-
gonia．
Key words: Newborn calf testis EGC EGC colony Immunofluorescence staining
收稿日期:2009-12-18
基金项目:黑龙江省农业科学院基金(LRBO4-185)
作者简介:李冬旭，男，硕士研究生 ，研究方向:动物遗传育种与繁殖;E-mail:mujiazi-zz@ 163． com
通讯作者:张贵学，男，教授，博士生导师，E-mail:gxzhang@ neau． edu． cn
胚胎生殖干细胞(embryonic germ cell，EGC)同胚
胎干细胞(ESC)一样具有发育全能性和分化潜能，多
通过在体外培养原始生殖细胞(primordial germ cells，
PGCs)而获得。雄性的 PGCs迁移到胚胎生殖脊后大
量增殖，随性腺的分化而过渡到性原细胞(gonocytes)
或称前精原细胞(prospermatogonia)［1，2］，动物出生后
不久，性原细胞大量增殖［3］。本试验从新生犊牛睾丸
组织中分离出生殖细胞，通过不同条件的培养，得到
类似 EG细胞集落，并分析集落与 EG细胞集落的相
似性，以期找到 EG细胞获取的另一途径。
1 材料方法
1. 1 试验材料
新出生 3 h 内的犊牛睾丸，摘出后消毒，4℃条
件下，2 h 内送回实验室。
1. 2 主要试验试剂
DMEM/F-12(Gibco) ;胰蛋白酶(1 ∶ 250，Amres-
co) ;胎牛血清(FBS，Gibco) ;丝裂霉素 C(Sigma) ;胶
原酶Ⅳ(Sigma) ;β-巯基乙醇(Sigma) ;非必需氨基
酸(GibcoBRL) ;谷氨酰胺(GibcoBRL) ;青链霉素混
合液(Hyclone) ;AKP 检测试剂盒(中杉金桥) ;Per-
coll;OCT-4 兔抗人抗体、生物素化羊抗兔 IgG、SABC
试剂盒、DAB显色试剂盒为武汉博士德生物工程有
限公司产品;重组卵泡刺激素(r-FSH，Serono，
USA) ;白血病抑制因子(LIF，Sigma) ;表皮生长因子
(EGF，Invitrogen)。
培养基:DMEM/F-12 + 2. 5%(或 10%)FBS + 2
mmol /L L-谷氨酰胺 + 1%双抗 + 10 －3mol /L 丙酮酸
钠 + 0. 1%非必需氨基酸 + 0. 1 mmol /L β-巯基乙醇
+ 0. 05 IU /mL r-FSH +1 000 IU /mL LIF + 1 000 IU /
mL EGF +100 IU /mL青霉素 + 100 IU /mL链霉素。
1. 3 新生犊牛睾丸细胞悬液的制备及性原细胞的
分离纯化
将睾丸剥去白膜等结缔组织，摘取曲精细管组
织，分成小块，在 PBS 中拨散，获得曲精细管小段，
PBS冲洗 2 次。用含有 0. 15%胶原酶Ⅳ及 10 μg /
mL DNaseⅠ的消化液在 37℃ 条件下消化 10 －
2010 年第 7 期 李冬旭等:新生犊牛睾丸细胞体外培养获取类 EGC集落
15 min，期间吹打 2 － 3 次，1 000 r /min 离心 10 min
去除消化液，重复上述消化过程 1 次。然后用
0. 25%胰酶室温消化，期间不断吹打，待悬液中看不
到曲细精管时加入等量的含 10% FBS 的 DMEM/F-
12 终止消化，100 μm 筛网过滤细胞悬液，将过滤后
的细胞悬液以 1 000 r /min离心 10 min去除上清液，
将细胞沉淀重新以 DMEM/F-12 悬起。非连续 Per-
coll密度梯度离心分选法和选择性贴壁法分离纯化
生殖细胞:组 A 为两次差速贴壁法纯化;组 B 为非
连续 Pecoll密度梯度离心法纯化;组 C 为一次差速
贴壁后非连续 Pecoll 密度梯度离心法纯化;组 D 为
非连续 Pecoll 密度梯度离心后一次差速贴壁法
纯化。
1. 4 性原细胞的培养
将性原细胞悬液调整密度为 1 × 106个 /mL 接
种在无支持细胞饲养层的培养皿中。于 37℃、5%
CO2、饱和湿度培养箱中用含不同血清的培养基
(2. 0%，5%及 10% FBS)培养。将性原细胞悬液调
整密度为 1 × 105个 /mL 接种于不同支持细胞密度
(2 × 105个 /mL，5 × 105个 /mL及 1 × 106个 /mL)的饲
养层上，于 5%CO2、37℃下培养，待性原细胞全部贴
壁后更换新鲜培养基(2. 0%，5%及 10% FBS)培养。
将性原细胞悬液调整密度为 1 × 105个 /mL 接种于
不同支持细胞密度的饲养层上，于 5% CO2、37℃下
培养，待性原细胞全部贴壁后更换无血清培养基
培养。
1. 5 细胞及细胞集落鉴定
取纯化后的性原细胞，做成细胞涂片，进行
AKP染色、C-Kit 免疫组化鉴定。挑取培养所得细
胞集落，接种到 96 孔培养板中，添加培养基，至集落
贴壁生长后，进行 AKP染色、OCT-4 免疫荧光染色，
C-Kit免疫组化鉴定。
2 结果
2. 1 新生犊牛性原细胞体外培养特性
2. 1. 1 新生犊牛睾丸生殖细胞鉴定与纯化 性原
细胞 AKP染色和 C-Kit免疫组化呈阳性。差速贴壁
培养进行纯化，非连续 Pecoll 密度梯度离心法进行
纯化，并两者结合使用纯化细胞(图 1-A) ，AKP染色
计算阳性率(表 1)。
A．纯化后的生殖细胞;B．类 EG细胞集落;C．类 EG细胞集落 AKP染色;D．接种 1 d后贴壁生长的集落;E．类 EG细胞集落 OCT-4
免疫荧光染色
图 1 细胞涂片观察结果
表 1 纯化性原细胞结果(n =6)
组 A 组 B 组 C 组 D
细胞总数
(× 106个 /mL)
0. 19 ±0. 06 0. 18 ±0. 10 0. 12 ±0. 05 0. 13 ±0. 07
AKP阳性率
(%)
55. 2 ± 2. 7 55. 6 ± 3. 4 83. 5 ± 3. 1 84. 2 ± 2. 2
细胞活率
(%)
90. 6 ± 2. 1 87. 6 ± 2. 3 79. 8 ± 3. 3 75. 9 ± 2. 6
2. 1. 2 性原细胞的培养 12 h 后支持细胞全部贴
壁，生出伪足，铺展生长。48 h 后前精原细胞全部
贴附在支持细胞上，并可见少量 2 － 4 个细胞的细胞
团;继续培养 1 － 2 d，不同培养体系中出现不同数量
量的隆突状集落;继续培养 1 － 2 d，集落生长成岛
状，无支持细胞饲养层培养的前精原细胞培养 12 h
后 3 － 4 个细胞一起聚集成团，极少量细胞贴壁生
长，不生成集落。无血清培养基饲养的性原细胞贴
附支持细胞生长，无集落生成，培养 5 － 6 d 后逐渐
消失。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 7 期
2. 1. 3 血清浓度及支持细胞密度对类 EG 细胞集
落形成的影响 无血清培养液培养的细胞和无支持
细胞饲养层的细胞皆无类 EG 细胞集落生成，不同
的支持细胞密度和血清浓度获得的类 EG 集落数及
持续时间，见表 2。
表 2 不同支持细胞密度及血清浓度获得的细胞集落数(n =15)
N(× 105 mL －1)
培养天数(d)
2. 5 5 10
A B C A B C A B C
3 0 0 3. 6 ± 0. 34 2. 7 ± 0. 29 3. 3 ± 0. 58 5. 8 ± 0. 63 2. 9 ± 0. 43 3. 7 ± 0. 27 6. 2 ± 0. 64
4 0 3. 6 ± 0. 31 8. 7 ± 0. 69 6. 2 ± 0. 86 8. 1 ± 0. 97 11. 4 ± 1. 23 6. 8 ± 0. 57 8. 7 ± 0. 64 11. 2 ± 1. 65
5 2. 3 ± 0. 32 7. 8 ± 0. 67 12. 3 ± 1. 32 13. 4 ± 1. 35 16. 5 ± 1. 49 18. 6 ± 1. 57 12. 7 ± 1. 44 13. 3 ± 1. 25 8. 4 ± 0. 53
6 5. 3 ± 0. 43 9. 9 ± 0. 75 18. 4 ± 1. 28 16. 6 ± 1. 43 19. 6 ± 1. 63 18. 4 ± 1. 49 7. 7 ± 0. 64 6. 2 ± 0. 76 3. 6 ± 0. 44
7 5. 2 ± 0. 47 9. 3 ± 0. 68 15. 4 ± 1. 64 15. 6 ± 1. 22 17. 4 ± 1. 24 13. 2 ± 1. 37 5. 1 ± 0. 46 2. 6 ± 0. 34 0
8 6. 2 ± 0. 24 10. 7 ± 0. 88 9. 5 ± 0. 49 10. 7 ± 1. 36 15. 6 ± 1. 44 9. 4 ± 1. 22 0 0 0
N为支持细胞密度;A、B、C为培养基血清 FBS浓度分别为 2%，5%，10%
2. 2 类 EG细胞集落的获得及鉴定
经培养所得类 EG细胞集落细胞多层密集堆积
成岛状生长形态(图 1-B) ，细胞间界限不清楚，黏连
性强。AKP染色处理集落及周边少量细胞显示深
蓝紫色染色(图 1-C)。挑出集落接种到 96 孔板中，
8 h后贴壁生长(图 1-D) ，OCT-4 免疫荧光染色(图
1-E)和 C-KIT免疫组化染色呈阳性。
3 分析与讨论
3. 1 支持细胞密度与血清浓度对集落形成的影响
支持细胞被认为是生精细胞的支架，直接和精原
细胞接触，通过内部因子和外部影响因子调控睾丸的
微环境，通过细胞之间的相互作用间接调控生精细胞
的基因表达。支持细胞还为生精细胞提供必需的营
养物质，它能够分泌 100 余种不同的蛋白质，多种生
长因子，尤其支持细胞分泌的胶质细胞源性神经营养
因子(glial cell-line derived neurotrophic factor，GD-
NF)是调节生殖细胞增殖的关键因子之一［4］。由于
本试验采用的是犊牛睾丸的支持细胞，并非成熟的
支持细胞，其在含高浓度血清(10%以上)的培养基
中增殖速度极快，若不调整密度后与性原细胞共培
养，不但起不到促进类 EG细胞集落形成的作用，反
而对集落的形成有阻碍作用。血清对支持细胞和
性原细胞都有促进增殖的作用，但在高浓度血清
下支持细胞增殖过快，与性原细胞争夺生长空间，
不利于类 EG细胞集落生成，而在低浓度血清下性
原细胞增殖过慢，同样不易生成类 EG 细胞集落，
因此需要调整培养基中血清至适当的浓度。
3. 2 类 EG细胞集落的鉴定
EG细胞集落可从形态观察，AKP 染色，OCT-4
表达产物，表面抗原(SSEA-1)几方面进行鉴定，由
于 EG 细胞具有分化潜能，也可根据这一特点进行
鉴定。本试验得到的细胞集落形态上与 EG 细胞集
落极为相似，都是呈岛状生长形态，细胞间界限不清
楚，黏连性强。睾丸中管周肌样细胞经 AKP 染色同
样呈阳性表达，因此，AKP染色的类 EG细胞集落及
周边一些细胞都呈阳性，但 c-kit 免疫组化染色和
OCT-4 免疫荧光染色都只有类 EG 细胞集落呈阳
性，可证明集落不是管周肌样细胞集落。Izadyar
等［5］报道，在 3 月龄小牛睾丸中，性原细胞(gono-
cyte)是生精上皮内唯一存在的生精细胞，本试验以
出生不超过 3 h的犊牛睾丸为试验材料，因此，得到
的细胞集落应为类 EG细胞集落。
4 结论
支持细胞的密度及培养基中血清浓度影响生精
细胞的体外增殖与集落的形成，本试验条件下，当血
清浓度为 5. 0%，支持细胞密度为 5 × 105个 /mL 时，
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2010 年第 7 期 李冬旭等:新生犊牛睾丸细胞体外培养获取类 EGC集落
集落较多，集落维持时间最长。细胞集落为类 EG
细胞集落，与 EG细胞集落近乎相同。
参 考 文 献
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