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生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 10期
三角褐指藻Δ6脂肪酸延长酶基因的克隆与序列分析
李运涛　付春华　栗茂腾　余龙江
(华中科技大学生命科学与技术学院资源生物学与生物技术研究所 ,武汉 430074)
　　摘 　要 : 　多不饱和脂肪酸具有重要的生理和保健功能。利用基因工程手段在植物和微生物中生产多不饱和脂肪酸是
研究的热点。Δ6脂肪酸延长酶是多不饱和脂肪酸合成中的关键酶 ,克隆了三角褐指藻的Δ6脂肪酸延长酶基因的 cDNA和
DNA序列 ,并对该基因的基因结构、翻译后修饰及起源进化进行了分析。结果显示 ,三角褐指藻的Δ6脂肪酸延长酶基因有两
个内含子 ,该酶属于 ELO系列延长酶 ,具有磷酸化及 N2乙酰葡萄糖胺 (O2GlcNAc)修饰等翻译后修饰。BLAST结果表明 ,在三
角褐指藻中很有可能存在两个Δ6脂肪酸延长酶基因。
关键词 : 　多不饱和脂肪酸 　三角褐指藻 　Δ6脂肪酸延长酶 　序列分析
Clon ing and Sequence Analysis ofΔ6 Fatty Acid
Elongase Gene from Phaeodactylum tricornu tum
L i Yuntao　Fu Chunhua　L i Maoteng　Yu Longjiang
( Institute of R esource B iology and B iotechnology, College of L ife Science and Technology,
Huazhong University of Science and Technology, W uhan 430074)
　　Abs trac t: 　Polyunsaturated fatty acids p lay an important role in human physiological and health. Producing polyunsaturated fatty
acids in p lant and m icrobe by genetic manipulation is being the focus of current research. TheΔ6 fatty acid elongase is a key enzyme in
the biosynthetic pathway of polyunsaturated fatty acids. The cDNA and DNA sequence ofΔ6 fatty acid elongase from Phaeodacty lum tri2
cornutum were cloned and the gene structure, translation modification, and evolution of the gene were analyzed. The results showed that
theΔ6 fatty acid elongase of Phaeodacty lum tricornutum that have two introns belongs to the ELO gene fam ilies. The gene has phospho2
rylation, O2GlcNAc and other modifications. The results of BLAST showed that there may be twoΔ6 fatty acid elongase genes in Phaeo2
dacty lum tricornutum.
Key wo rds: 　Polyunsaturated fatty acids　Phaeodactylum tricornutum 　Δ6 fatty acid elongase　Sequence analysis
收稿日期 : 2009207206
基金项目 :国家“863”高技术计划 (2007AA10Z120, 2007AA100402)
作者简介 :李运涛 (19792) ,博士研究生 ,研究方向 :植物基因工程 ; E2mail: liyuntao023@1631com
通讯作者 :栗茂腾 ,副教授 ,从事植物分子生物学研究 ; E2mail: limaoteng426@163. com
余龙江 ,教授 ,从事资源生物学与生物技术研究 ; E2mail: yulj@ hust1edu1cn　　多不饱和脂肪酸 ( polyunsaturated fatty acids,PUFA s) ,指含有 2个或 2个以上双键 ,碳原子数为16至 22的长链脂肪酸。PUFA s具有重要的营养价值及生理作用。研究表明 PUFA s可以转化为前列腺素类化合物和白三烯等 ,这些物质具有免疫应答作用 [ 1 ] ,同时还有维持细胞膜的结构和功能 [ 2 ]、促进脑和视网膜的发育、调节血压 [ 3 ]、抗炎 [ 4 ]等作用。PUFA s通常来源于高等植物、动物内脏和鱼油。随着人们对 PUFA s生物活性认识的不断提高 ,市场对 PUFA s的需求也日益增强 ,目前的各种来源已不能满足要求。为此 ,人们积极研究寻求替代的生物资源 ,如油料作物的遗传改良及低等生物的综合利用等。Δ6延长酶催化γ2亚麻酸到双高γ2亚麻酸以及SDA (18: 4Δ6, 9, 12, 15 )到 ETA ( 20: 4Δ8, 11, 14, 17 )的反应 ,是花生四烯酸 (AA )和二十碳五烯酸 ( EPA )合成中的重要酶 ,有研究表明 ,Δ6延长步骤是高山被孢霉AA合成中的限速步骤 [ 5 ]。因此 ,对Δ6延长酶的研
2009年第 10期 李运涛等 :三角褐指藻Δ6脂肪酸延长酶基因的克隆与序列分析
究具有重要意义。三角褐指藻 ( Phaeodacty lum tri2
cornu tum )的多不饱和脂肪酸含量很高 ,是进行多不
饱和脂肪酸研究的理想材料 ,也是理想的基因来源
资源。克隆了三角褐指藻Δ6延长酶基因 ( P tE6)的
cDNA序列和 DNA序列 ,并对该基因的结构与推导
的蛋白质序列进行了分析 ,为进一步利用该基因奠
定了基础。
1　材料与方法
111　质粒、菌株、酶及主要试剂
三角褐指藻购自中科院武汉水生所。大肠杆菌
( Escherich ia coli)菌株 DH10B由华中农业大学作物
遗传改良国家重点实验室陶增博士提供。克隆载体
pMD182T Simp le购自宝生物工程 (大连 )有限公司。
cDNA第一链合成试剂盒、pfu DNA聚合酶购自 Fer2
mentas公司。引物合成与测序均由赛百盛生物工程
公司完成。
112　总 DNA及总 RNA的提取
处于对数生长期的三角褐指藻经离心收集后用
于总 DNA和总 RNA提取。总 RNA提取采用一种
文献报道的方法 [ 6 ]。总 DNA提取采用 CTAB法 ,参
照已报道的文献 [ 7 ]。
113　Δ6脂肪酸延长酶基因的扩增
根据已报道的 Δ6 脂肪酸延长酶基因序列
( Phaeodacty lum tricornu tum delta262elongase mRNA,
AY746355)设计引物。
上游引物 : PtE6F: 5′2ATGATGGTACCTTCAAGT2
TATGA23′
下游引物 : PtE6R: 5′2TTAAGCTGTCTTCTTCTTCTT2
CGG23′
以提取的总 RNA 为模板合成第一链 cDNA。
使用 PtE6F /PtE6R引物、pfu DNA聚合酶 ,以合成的
cDNA以及提取的总 DNA为模板进行 PCR扩增 ,条
件为 94℃ 3 m in, 94℃ 30 s, 54℃ 1 m in 30 s, 72℃
3 m in, 35个循环 ,最后 72℃延伸 10 m in。PCR产物
经回收及加 A处理后连入载体 pMD182T Simp le,连接
产物转化大肠杆菌 DH10B。在含有 Amp /X2Gal/
IPTG的 LB (1%蛋白胨 , 015%酵母提取物 , 015%氯化
钠 , 115% 琼脂粉 )平板上筛选阳性克隆。筛选到的
阳性克隆经 PCR及酶切鉴定后进行测序验证。
114　生物信息学分析
序列比对、ORF翻译等分析在 Vector NTI Ad2
vance 910上进行 ; BLAST在 NCB I( http: / /www1ncbi1
nlm1nih1gov/ )上进行 ;推导的蛋白质的结构预测则
在 ExPASy (www1expasy1org)提供连接的软件平台
上进行。
2　结果与分析
211　Δ6脂肪酸延长酶基因的克隆
cDNA扩增的凝胶电泳检测得到 1条与预期相
符的约 850 bp的条带 , DNA扩增的凝胶电泳检测得
到 1条约 1 000 bp的条带 (图 1)。测序后的实际长
度分别为 837 bp和 1 001 bp。 cDNA的大小与已经
报道的序列大小一致 ,序列比对表明两者的序列也
一致。DNA序列的序列比对和 BLAST表明它就是
三角褐指藻的Δ6脂肪酸延长酶基因 ,因为它在外
显子区与全长 cDNA序列完全一致。这些结果表明
成功克隆了三角褐指藻Δ6脂肪酸延长酶基因。三
角褐指藻Δ6脂肪酸延长酶基因的 DNA序列还没
有报道 ,因此将得到的 DNA 序列提交到 GenBank
(登录号为 EF541114)。
图 1　PtE6的全长 cD NA扩增和基因
组序列扩增的凝胶电泳检测
212　序列分析
三角褐指藻 Δ6脂肪酸延长酶基因 DNA 序列
与 cDNA序列的比对结果及 NCB I Sp idey分析表明
该基因具有 2 个内含子 ,分别位于 DNA 序列的
106～192 bp、284～360 bp处 ,它们把整个基因分为
3个外显子。内含子符合 GT2AG的内含子剪切位
点边界序列特征。对推导的氨基酸序列的预测表
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
明 ,序列中不存在酪氨酸的硫酸化 ( tyrosine sulfa2
tion)位点 , REP搜索也没有在 PtE6中发现显著的
重复结构。使用 B ig2P I Predictp r[ 8 ]搜索没有发现
GP I2modification位点。NetPhos 210[ 9 ]预测 PtE6上
有 9个磷酸化位点 ,其中 3个丝氨酸磷酸化位点、5
个苏氨酸磷酸化位点、1 个酪氨酸磷酸化位点。
YinOYang 112[ 10 ]预测 PtE6中存在 O2GlcNAc糖基
化位点 ,位置在第 244个氨基酸残基。NetPhosK预
测 PtE6在 S268位置有 PKC位点。Phobius预测该
蛋白含有 7个跨膜结构域 ,其位置分别位于 45～65、
77～98、118～141、153～169、175～195、216～238、
250～270位氨基酸残基之间 (图 2)。PSORT[ 11 ]的预
测表明该延长酶是一种膜结合蛋白 ,预测的细胞定位
结果如表 1所示。
图 2　PtE6的跨膜结构示意图
表 1　PSO RT预测细胞定位结果
细胞定位 可能性 ( % )
质膜　　 60
高尔基体 40
内质网　 30
微粒体　 30
SOPMA [ 12 ]分析显示该延长酶的二级结构只有
3种形式 , 分别为 α螺旋 ( 48156% )、随机卷曲
(30194% )和延伸链 (17127% ) ,这 3种二级结构在
总体上穿插排列。
213　进化分析
脂肪酸的延长步骤已知有两种类型 :一种是植
物类似的类型 ,在该类型中 ,起始反应由β2酮酰辅
酶 A合成酶 ( KCS)催化 ,另一种类型是基于 ELO的
步骤。两种类型的区别在于起始的缩合反应 [ 13 ]。
分析表明 ,三角褐指藻Δ6脂肪酸延长酶属于 ELO
类型。用推导的 PtE6氨基酸序列在 NCB I上进行
BLAST,生成的进化树 (图 3)显示 , PtE6与已报道的
其他三角褐指藻Δ6脂肪酸延长酶聚在一起 ,属于
硅藻属 ,硅藻再与绿藻、真菌以及苔藓聚成一个大
类 ,显示藻类与真菌及苔藓的脂肪酸延长酶具有较
近的亲缘关系。它们与鸟类、硬骨鱼的延长酶的亲
缘关系较远。
214　基因组 BLAST
由于三角褐指藻的基因组序测序已经完成 [ 14 ] ,
因此用 PtE6的 DNA序列与三角褐指藻的基因组序
列进行 BLAST,结果发现在三角褐指藻的基因组序
列中除了一段与已得到的 DNA序列一致的序列外 ,
还有一段序列与 P tE6 DNA序列的 353～994 bp有
非常高的相似性 ( 90% ) ; 另外该段序列与 P tE6
DNA序列的 188～226 bp以及 248～289 bp也有非
常高的相似性 ,分别为 92%和 95% ,显示该段序列
极有可能是一个Δ6脂肪酸延长酶基因。
3　讨论
三角褐指藻是研究多不饱和脂肪酸合成的良好
材料 ,其Δ6脂肪酸延长酶基因 ( P tE6 )序列虽然已
经报道 ,但是没有进行分析及研究。研究结果表明 ,
该基因存在内含子 ,是一个典型的真核基因。藻类
中多不饱和脂肪酸的合成位于细胞质中 ,对 P tE6细
胞定位的预测表明 ,它是一种膜结合蛋白 ,具有较多
的跨膜结构。
三角褐指藻的 EPA含量非常高 ,因此它的合成
途径效率应该很高 ,有报道表明在三角褐指藻中存
在两个Δ5脂肪酸脱氢酶基因。分析表明 ,在三角
褐指藻中很有可能存在至少两个Δ6脂肪酸延长酶
基因 ,这有助于解释三角褐指藻的 EPA合成效率高
的原因。Δ6延长步骤是 EPA和 AA合成中的限速
步骤 ,若是具有两个Δ6脂肪酸延长酶基因 ,就可以
大大提高该步骤的效率 ,从而促进 EPA的合成。
脂肪酸延长包括 4个不同的反应 ,催化这 4步
反应的是 4个独立的酶 ,组成一个多亚基的复合酶 ,
通常包括 :缩合酶 (β2酮酰辅酶 A合成酶 ,β2ketoacyl
CoA synntase, KCS) ,β2酮酰辅酶 A还原酶 (β2keto2
acyl CoA reductase, KCR) ,β2羟酰辅酶 A脱水酶 (β2
hydroxyacyl CoA dehydarse) ,反式 222烯酰基辅酶 A
还原酶 ( trans222enoyl CoA reductase)。负责底物特
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2009年第 10期 李运涛等 :三角褐指藻Δ6脂肪酸延长酶基因的克隆与序列分析
异性及启动复合酶反应的是缩合酶 [ 15 ]。来自于植物
的缩合酶 (被命名为 KCS或 FAE)与酵母的缩合酶
(ELO )的同源性非常低 ,是两种不同的类型。PtE6
是一种多不饱和脂肪酸延长酶 ,属于 ELO系列 , PtE6
与其他藻类、真菌及苔藓的延长酶具有很近的亲缘关
系 ,这与这些物种本身的亲缘关系较近是一致的。
图 3　应用氨基酸序列比对生成的进化树 (截取部分 )
参 考 文 献
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