全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第5期
收稿日期:2008-03-06
作者简介:隋聪颖(1981-),女,硕士研究生,研究方向:农业微生物学;E-mail:suicongying@163.com
通讯作者:顾金刚,副研究员,E-mail:jggu@caas.ac.cn;徐凤花,研究生导师
脂肪酶(Lipase,EC3.1.1.3,甘油酯水解酶)是分解脂肪的酶[1],是最早研究的酶类之一,被广泛应用于
油脂、食品、医药、化妆品、洗涤剂、香料和其它有机合成领域中[2]。木霉菌属于半知菌亚门、丝孢纲、丝孢
目,粘孢菌类,是一类普遍存在的真菌,能产生多种具有生物活性的酶系,如纤维素酶、几丁质、木聚糖酶、
葡聚糖酶等。自然界中能够产生脂肪酶的微生物很多,但是木霉产生脂肪酶的报道尚不多见。Kashmiri等[3]
报导分离出产脂肪酶的绿色木霉,其脂肪酶酶活为 7.3U/ml。PaulDiby等[4]分离出了一株产脂肪酶的木霉菌
种。从木霉属真菌的种类多样性以及对环境、生态多样性着手,分离、筛选、鉴定产脂肪酶的木霉菌种,并研
究其产脂肪酶的能力及酶学性质,为木霉菌种多样性的相关研究提供一些参考。
1 材料与方法
1.1 菌株
从北京、河北任丘、保定、张家口、新疆、内蒙古和云南等地采集的土样中分离出一批木霉菌株,供筛选用。
1.2 产脂肪酶菌株的筛选
产脂肪酶木霉菌株的筛选鉴定及酶学性质研究
隋聪颖 1,2 顾金刚 2 徐凤花 1 姜瑞波 2
(1东北农业大学资源与环境学院,哈尔滨 150030;2中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 /
中国农业微生物菌保藏管理中心,北京 100081)
摘 要: 筛选到4株可产生脂肪酶的真菌菌株,分别是153-1、13-2、30425和西 1-1,经形态观察、ITS序列测方法
鉴定,30425、153-1鉴定为Trichodermaharzianum,西1-1、13-2鉴定T.longibrachiatum。研究了脂肪酶的基本酶学性质,
153-1、13-2、30425和西1-1酶的最适作用温度为 45℃、40℃、20℃、20℃,最适 pH为9.5、10.0、7.5、9.5,金属离子对153-1、
13-2、30425和西1-1酶活的影响存在差异,其中 Mn2+、Cu2+、Pb2+对 4株菌株的酶活均为抑制作用,而Ba2+对 4株菌株的
酶活均为不同程度的激活作用。
关键词: 木霉 脂肪酶 酶学性质
ScreeningandIdentificationoftheLipaseProducing
TrichodermaandStudiesontheEnzymaticCharacter
SuiCongying1,2 GuJingang2 XuFenghua1 JiangRuibo2
(1ColegeofResourcesandEnvironmentalSciences,NortheastAgriculturalUniversity,Harbin150030;2Instituteof
AgriculturalResourcesandRegionalPlanning,CAAS,AgriculturalCultureColectionofChina,Beijing100081)
Abstract: Fourlipase-producingfungistrainswereisolatedfrom soilsamples,namedas153-1,13-2,30425,Xi1-1.
WiththeobservationandsequencingofITS,153-1and30425wereidentifiedasTrichodermaharzianum and13-2and
Xi1-1wereidentifiedasT.longibrachiatum.Thelipasebasicenzymaticpropertieswerestudiedindetail.Theoptimal
temperatureofthelipasefrom153-1,13-2,30425andXi1-1were45℃,40℃,20℃,20℃ andpHwere9.5,10.0,7.5and
9.5,respectively.Theactivityofthelipasewereafecteddiferentlybymetalions,buttheywerealrestrainedgreatlyby
Mn2+,Cu2+,Pb2+,andactiviatedbyBa2+,tosomeexent.
Keywords: Trichodermasp.LipasesEnzymaticproperties
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
1.2.1 活化 将斜面保存的菌种转接至 PDA平板培养基上 28℃培养 3～5d,收集孢子。
1.2.2 初筛 将木霉孢子用无菌水稀释涂布于初筛培养基[5](以橄榄油为惟一碳源,添加氮源和无机离子)
上,28℃培养 3～6d。选择长势好的菌株,摇瓶发酵复筛。
1.2.3 复筛 三丁酸甘油酯平板透明圈法[6]、RhodamineB橄榄油平板筛选法[7]。
1.3 酶活的测定
以橄榄油为底物,采用 NaOH滴定法[8]。酶活力单位定义:40℃,pH7.5条件下,以每分钟产生 1μmol脂
肪酸所需的酶量定义为 1个活力单位(μmolPmin·ml)以 U表示。
1.4 菌株的鉴定
1.4.1 菌落形态特征鉴定 菌株接到 PDA培养基上,28℃培养 7d,观察菌落形态,颜色,有无色素产生,显
微观察测量分生孢子的颜色形状、分生孢子梗生长方式和菌丝生长速度等特征。
1.4.2 菌株的分子生物学鉴定 DNA的提取采用试剂盒法(天泽基因工程有限公司植物 DNAout),略有改
进,在 PDA培养基上覆玻璃纸接种培养成熟,挑选适量菌丝加少许聚乙烯基吡咯烷酮(PVP),在研钵中加
液氮充分研磨后移入离心管,其余各步参照说明书。
PCR扩增反应,以提取的菌株 DNA为模板,ITS1、ITS4[9]引物,采用常规方法进行,引物合成与序列测
定均由英骏生物技术有限公司完成。将序列与 Genbank数据库(htp:/www.ncbi.nlm.nih.gov/)中已有的 ITS
序列进行相似性比较分析。选取与供试菌株相似度高的序列,利用软件 ClustalX1.83、MEGA3.1建立系统进
化树,更直观的反观菌株间的亲缘关系。
1.5 酶学性质研究
酶活力的测定采用 pNPP法[10,11]。
1.5.1 温度对脂肪酶活性的影响 调节恒温分浴锅,分别设定温度为 15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、
45℃和 50℃,底物浓度 3mg/ml,pH为 8.0,反应时间为 15min,在不同温度条件下测酶的活力。
1.5.2 pH对脂肪酶活性的影响 分别配制 pH为 5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0和 10.5
的磷酸钠盐底物缓冲液,使酶在不同的 pH缓冲液中,在 37℃条件下进行酶-底物的反应,测酶的活力。
1.5.3 金属离子对脂肪酶活性的影响 配制含 FeSO4、CaCl2、MgSO4、KCl、MnSO4、CuSO4、BaSO4、LiSO4和 Pb
(CH3COO)2的底物溶液(1%底物浓度),使各金属离子终浓度为 0.1mmol/L,对照组不加任何金属离子,以
其酶活为 100,在 37℃、pH8.0条件下进行酶-底物反应,测酶的活力。
2 结果与讨论
2.1 产脂肪酶木霉菌株的筛选
对分离得到 114株菌株,初筛出 43株产脂肪酶菌株,经摇瓶复筛菌株 10株(表 1),根据其产生的透明
圈与荧光圈的大小,发现 4株产酶能力较强,其原始编号分别为:153-1、13-2、30425、西 1-1。
表 1 产脂肪酶木霉菌复筛结果
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2.2 酶活的测定
参照文献[8],以发酵液为粗酶液,进行酶活力的测定,反应时间为 15min,温度为 40℃(表 2)。
在筛选出的 4株产脂肪酶木霉中,30425
酶活力最高,其次是 153-1、西 1-1、13-2。菌株
30425表现出对橄榄油极好的分解作用。
2.3 菌种的鉴定
2.3.1 菌落形态及显微形态观察 各菌株在
平板上的生长情况及菌落形态与显微形态
(图 1)。
菌株 153-1菌丝白色绒毛状,菌落成熟时
暗绿色,有色素产生。分生孢子梗呈对分枝,
分生孢子绿色圆形光滑。菌株 30425菌丝白
色,菌落边缘整齐,老熟时暗绿色,培养基正
反颜色不同,有色素产生。孢子梗呈对分枝,
孢子球形。二者的菌丝生长速度很快,3d后均
布满平板,符合有关哈茨木霉[12~20]的报道。
菌株 13-2菌丝白色絮状,生长速度较快,
培养 3d后即开始产孢子,培养颜色前后不一
致,有色素产生,在马丁氏培养上成熟后为黄绿色。分生孢子倒卵形光滑,瓶梗着生在次级分枝上。菌株西
1-1菌丝白色,在 PDA培养上产生绿色孢子,在马丁氏培养上呈黄绿色,产生黄色的扩散性色素,孢子梗以
众多小丛束分布于菌落表面,瓶梗单生,分生孢子光滑椭圆形。亦与文献中长枝木霉[21,23]的描述相符。
2.3.2 ITS测序测定 菌株的 ITS基因序列与 Genbank中相似性较高序列的系统发育树(图 2),可知 153-
1与模式菌株 AY605713T.harzianum、13-2与
模式菌株 Z31019T.longibrachiatum、30425与
EF191304T.harzianum、 西 1-1与 X93929T.
longibrachiatum的亲缘关系最近,可归为一群。
2.4 脂肪酶的性质
2.4.1 温度对脂肪酶活性的影响 在 pH8.0
条件下,测定 15℃～50℃温度范围酶活力与温
度的关系(图 3)。
如图 3所示,153-1产生的脂肪酶在温度
为 45℃时酶相对活力达到最高,为最适反应温
度,在 15℃～40℃范围内酶活变化不明显;13-2
酶的最适反应温度出现在 40℃;30425和西 1-
1酶的最适反应温度均为 20℃,有开发低温酶
的潜力。
2.4.2 pH对脂肪酶活性的影响 测定了 pH在 5.0～10.5范围内脂肪酶的相对酶活(图 4)。
如图 4所示,153-1产生的脂肪酶活在 pH9.5时达最大,为最适 pH值;13-2酶的最适反应 pH为 10.0;
30425脂肪酶在 pH为 7.5时达到高峰;西 1-1酶活在 pH为 9.5时达最高,为最适 pH值。
2.4.3 金属离子对脂肪酶活性的影响 将 0.1mol/L金属离子加入到反应体系中,在最适条件下反应测其
表 2 4株菌产生脂肪酶的酶活
图 1 菌株培养 7d后的菌落形态及显微照片
图 2 系统进化树
隋聪颖等:产脂肪酶木霉菌株的筛选鉴定及酶学性质研究 191
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第5期
酶活(以未处理的酶活力为 1计算比酶活)(表 3)。
由表 4可知,Mn2+、Cu2+、Pb2+对 4株菌脂肪酶均有不同程度的抑制作用,而 Ba2+则对 4株菌的脂肪酶有
激活作用。另外,Ca2+、Mg2+对 153-1、13-2和西 1-1为抑制作用,对 30425为激活作用,K+对 13-2和 30425的
激活作用效果显著,Ca2+对 153-1和西 1-1的抑制作用效果显著。可见,金属离子对不同的菌株产生的脂肪
酶的影响是不同的。
3 结论
通过对菌株的菌落及显微观察、ITS序列测定,结果显示原始编号为 153-1、13-2、30425、西 1-1的 4株
菌分别归属于 T.harzianum、T.longibrachiatum、T.harzianum和 T.longibrachiatum。其中,153-1和 13-2产生
的脂肪酶最适温度为 45、40℃,但 13-2在低温范围内亦表现出较高的酶活,二者的最适 pH值分别为 9.5
和 10.0,为碱性脂肪酶;30425和西 1-1为低温脂肪酶,最适温度为 20℃,30425产生的脂肪酶最高酶活值
出现在 pH7.5,西 1-1在 pH9.5时达最高酶活,为碱性低温脂肪酶。金属离子对 153-1、13-2、30425和西 1-1
酶活的影响存在差异,Mn2+、Cu2+、Pb2+对 4株菌株的酶活均为抑制作用,Pb2+的作用效果最为明显,而 Ba2+对
4株菌株的酶活均有不同程度的激活作用,并且作用显著;由于菌株的脂肪酶活均不高,但是具备低温碱
性范围内反应的特性,13-2和西 1-1两株长枝木霉有着更大的研究价值与潜力。
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图 4 pH对酶活的影响图 3 温度对酶活的影响
表 3 金属离子对脂肪酶活性的影响
(下转第197页)
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(上接第192页)
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