全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第4期
收稿日期:2008-01-08
基金项目:上海浦江人才计划项目(05PJ14086);上海市教委优势(重点)学科资助项目(Y1101)
作者简介:赵素芬(1970-),女,河北栾城人,博士研究生,主要从事海藻生物技术的研究
通讯作者:何培民,男,Tel:021-65710364,E-mail:pmhe@shfu.edu.cn
随机扩增 DNA多态性(randomamplifiedpolymorphicDNA,RAPD)标记技术是以人工合成的各种寡脱
氧核苷酸为引物(通常为 10个核苷酸),通过 PCR技术扩增 DNA片段,用电泳分离各种不同引物引导产
生的各种长度的 DNA后,根据生物产生的 DNA多态性进行分析和鉴定的技术[1]。该技术具有操作技术简
便,DNA样品需求量少等特点,已在遗传多样性研究、种质资源鉴定、品种纯度鉴定和杂交育种和遗传图谱
构建等方面广泛应用[2]。但是 RAPD技术的再现性差,不同的物种其反应条件需要各自优化,以提高 RAPD
的重复性和稳定性。长心卡帕藻是用于生产 κ-卡拉胶的一种热带经济红藻。早在 20世纪 70年代,开始进
行商业栽培[3],重复的营养繁殖使藻体的遗传变异性减少,这可能是导致藻体的生长速度下降,卡拉胶产量
和凝胶强度降低,病害增加的原因[4]。有关紫菜属[5~7]、石花菜[8,9]、Furcelarialumbricalis[10]和江蓠属[11,12]红藻
RAPD扩增方面的研究曾见报道,但至今国内有关卡帕藻和麒麟菜 RAPD的研究还未见报道。先通过单因
长心卡帕藻RAPD-PCR反应体系的正交优化研究
赵素芬 1,2 张婷 1 应成琦 1 何培民 1
(1上海水产大学生命科学与技术学院,上海 200090;2广东海洋大学水产学院,湛江 524025)
摘 要: 采用SDS(十二烷基硫酸钠,20%)法提取了大型海藻长心卡帕藻(Kappaphycusalvarezi)基因组DNA。通
过单因子梯度试验,确定了影响随机扩增 DNA多态性(RAPD)扩增结果的模板、Mg2+、dNTPs、S22引物、Taq的适宜浓
度、退火温度和反应的最佳循环次数;利用正交试验优化了模板、Mg2+、dNTPs、S22引物、Taq的配比浓度。结果表明,在进
行长心卡帕藻的RAPD扩增时,在总体积为25μl的反应体系中,模板、Mg2+、dNTPs、S22引物、Taq的最佳浓度分别为
15ng、2.0mmol/L、0.2mmol/L、0.25μmol/L、2.5U;退火温度为37℃。反应程序为 94℃预变性5min,然后经94℃变性 30s、
37℃退火1min,72℃延伸2min,进行30次循环,最后在72℃再延伸10min。
关键词: 长心卡帕藻 DNA提取 随机扩增DNA多态性 反应体系
StudyonOptimizationofRAPD-PCRReactionSystem for
KappaphycusalvarezibyOrthogonalDesign
ZhaoSufen1,2 ZhangTing1 YingChengqi1 HePeimin1
(1ColegeofAqua-lifeScienceandTechnology,ShanghaiFisheriesUniversity,Shanghai200090;2FisheriesColege,
GuangdongOceanUniversity,Zhanjiang524025)
Abstract: ThegenomicDNAoftheseaweedKappaphycusalvareziwasextractedbySDS(20%)method.The
template,Mg2+,dNTPs,S22primer,Taqconcentrations,andannealingtemperatureandthebestcycletimeswereoptimized
forRAPD-PCR reactionsystem inK.alvareziwithsingle-factorandorthogonaldesignexperiment.In25μlRAPD-
PCR reactionsystemofK.alvarezi,themostsuitableconcentrationoftemplate,Mg2+、dNTPs、S22primer、Taqpolymerase
were15ng,2.0mmol/L,0.2mmol/L,0.25μmol/Land2.5U,respectively.AndthePCR program forRAPD was5min
initialdenaturationat94℃,thenfolowedby30cyclesof30secondsat94℃(denaturation),60secondsat37℃
(annealing),120secondsat72℃(extension),andafinal10minutesextensionat72℃.
Keywords: Kappaphycusalvarezi DNAextraction RAPD-PCR Optimization
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
素试验确定各因素的适宜浓度范围,再应用正交试验法分析了在长心帕藻的 RAPD扩增中模板、Mg2+、
dNTPs、S22引物、Taq的最适浓度和最佳循环次数等,以期为进一步研究卡帕藻的分子标记和遗传育种等
奠定基础,为指导生产提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
长心卡帕藻 Kappaphycusalvarezi取自海南陵水海区养殖筏上,取编号为 L3的样品进行试验;Taq购
自宝生物工程(大连)有限公司,S22随机引物由上海生物工程公司合成;使用 EppendorfAuthorizedThermal
Cycler进行扩增。
1.2 方法
藻体总 DNA的提取采用 20%SDS(十二烷基硫酸钠)法[13],醇洗后溶解为 30μl,并于 4℃保存备用。总
DNA稀释 12倍后经 EppendorfBiophotometer(Germany)测定其吸光度。各种实验设 2个平行。
1.2.1 基本反应条件 PCR反应体系总体积为 25μl,其中 10×bufer2.5μl,Mg2+2μl(2.0mmol/L),dNTPs2μl
(0.2mmol/L),引物 S220.1μl(0.2μmol/L),Taq0.3μl(1.5U),其余部分用无菌超纯水补平。反应参数为 94℃
预变性 5min,然后经 94℃变性 30s、38℃退火 1min,72℃延伸 2min,进行 35次循环,最后在 72℃再延伸
10min。扩增完毕,在 1.2%琼脂糖凝胶上 (含 EB0.5μg/ml)电泳分离,以 pBR322DNA/AluIMarker,20
(#SM0121)指示 DNA片段的大小。
1.2.2 单因素试验 在基本反应条件中其它因子保持不变的情况下,改变其中的某单一因子,确定适合
RAPD扩增所要求的各个因素的浓度范围(表 1)。
表 1 RAPD扩增反应体系中各因素的单因素梯度试验
1.2.3 正交试验 通过单因素试验结果,确定模板、Mg2+、dNTPs、引物 S22和 Taq的适宜浓度范围,采用 5
因素 4水平的正交试验方法[14],根据 L16(45)正交表[15],进行 RAPD扩增影响因素的正交试验。
2 结果与讨论
2.1 长心卡帕藻总 DNA的提取
从长心卡帕藻体中提取高质量的 DNA是进行其分子遗传学研究的基础。应用纯净的 DNA能提高
RAPD的准确性。采用 20%SDS(十二烷基硫酸钠)法提取 DNA,并且在提取时尽可能地采用新鲜的藻体,
获得了纯度较高的 DNA。用 0.8%的琼脂糖电泳检测(图 1),均呈现一条带,并且样品的 D260nm/D280nm值均在
1.7~1.9之间(表 2),说明所提取的 DNA具有良好的完整性,且纯度较高,可作为 RAPD的模板使用。
2.2 DNA模板量对 RAPD扩增的影响
模板量太少时,“真正”靶序列与引物的结合效率低,扩增时会产生假的条带,而模板量太多会导致错
误配对。不同的模板浓度,RAPD扩增的结果有差异(图 2)。在 10~80ng之间都能扩出较多而清晰的条带,
其中,20~60ng之间条带最清晰;模板浓度为 100ng时,条带少且不清晰。为了节省材料,在该反应体系中用
20ng的模板 DNA较为适宜。重复试验发现其重复性较好。
162
2008年第4期
2.3 Mg2+浓度对 RAPD扩增的影响
反应混合物中的 Mg2+浓度对 RAPD反应的特异性和扩增效率都有影响,过高会使非特异性扩增物增
加,过低会使扩增产物减少。Mg2+是 DNA聚合酶的激活剂,Mg2+不足时,DNA聚合酶的作用效率低;dNTPs
也竞争 Mg2+,Mg2+的总量受 dNTPs总量影响。因此,反应体系中 Mg2+的浓度显得非常重要。试验结果见图 3,
从图中可以看出,Mg2+在 1.0~2.5mmol/L的范围内都能扩增出多而清晰的条带,其中 2.0mmol/L的条带最清
晰,对照和 3.0~3.5mmol/L范围条带数少或无。重复试验发现其重复性较好。
2.4 dNTPs浓度对 RAPD扩增的影响
dNTPs是 RAPD反应的底物,当 dNTPs的量不足时,扩增产物减少;当 dNTPs的量过高时,会增加碱基
的错掺率,并且还同 DNA聚合酶竞争 Mg2+,从而影响 DNA聚合酶的作用效率。改变 dNTPs浓度对 RAPD
扩增的影响见图 4。从图中可以看出,在 0.30~0.35mmol/L的浓度范围内,都扩增出非特异性条带;0.15~
0.25mmol/L的浓度范围内条带多而清晰,并且条带数一致,按从俭原则,确定在 RAPD的反应体系中,以加
入 0.15mmol/LdNTPs为宜。重复试验发现其重复性较好。
表 2 部分提取的 DNA纯度与浓度
图 1 长心卡帕藻基因组 DNA电泳图谱
图 2 模板量对 RAPD扩增的影响
泳道 1~6:长心卡帕藻(L3)基因组 DNA
M:Marker;泳道 0~6:模板量分别为 0、
10、20、40、60、80、100ng
图 3 Mg2+的浓度对 RAPD扩增的影响 图 4 dNTP浓度对 RAPD扩增的影响
M:Marker;泳道 0~6:Mg2+的浓度分别为
0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5mmol/L
M:Marker;泳道 0~6:dNTP的浓度分别为
0、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35mmol/L
2.5 引物浓度对 RAPD扩增的影响
RAPD反应开始时,必须使双链 DNA解离为单链并使之与引物相结合,然后在 DNA聚合酶的作用下
以引物为复制起点进行 DNA链的延伸。如果引物的浓度过低,引物与模板的结合机率降低;而引物的浓度
赵素芬等:长心卡帕藻RAPD-PCR反应体系的正交优化研究 163
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第4期
过高,错配和非特异性扩增机率增高,并且可增加引物之间形成二聚体或多聚体的机会。改变引物浓度对
RAPD扩增的影响见图 5。从图中可以看出,在 0.05~0.15μmol/L范围内出现弱带,而在 0.2~0.3μmol/L扩增
结果基本一致。为降低费用,确定在 RAPD的反应体系中,以加入 0.2μmol/L引物为宜。重复试验发现其重
复性较好。
2.6 Taq对 RAPD扩增的影响
Taq是一种能催化 DNA的合成和修复的生物大分子。在 PCR反应中,Taq以单链 DNA为模板并利用
反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的 DNA互补链,其含量低时扩增产物少,含量过高则容易
出现非特异性条带。改变 Taq浓度对 RAPD反应的影响见图 6。从图中可以看出,Taq浓度在 l.5U～3.0U时
扩增出较多且清晰的 DNA条带。从扩增效果和经济效率考虑,认为 Taq浓度以 2.0U为宜。重复试验发现
其重复性较好。
图 5 引物浓度对 RAPD扩增的影响 图 6 Taq浓度对 RAPD扩增的影响
M:Marker;泳道 0~6:引物的浓度分别为 0、0.05、
0.1、0.15、0.2、0.25、0.3mmol/L
M:Marker;泳道 0~6:Taq的浓度分别为 0、0.5、
1.0、1.5、2.0、2.5、3.0U
2.7 退火温度和时间对 RAPD扩增的影响
复性温度决定着 PCR的特异性,复性时间太长会增加非特异的复性。从改变退火温度和时间进行扩
增的结果(图 7)来看,36℃/30s和 36℃/1min的扩增效果最差,条带少而不清晰;37℃/1min条件下扩增的
条带最清晰,其他退火温度和时间条件下有弱带。重复试验发现其重复性较好。
2.8 循环次数对 RAPD扩增的影响
循环数决定着扩增程度。循环数太少,扩增产物量就会极低,过多的循环会增加非特异扩增产物的数
量和复杂性。改变循环次数时 RAPD扩增的结果见图 8。45次循环时出现非特异条带,25次循环时条带少
而弱,30~40次条带数相同且清晰。为了提高实验效率,认为循环次数以 30次为宜。重复试验发现其重复
性较好。
图 7 退火温度和时间对 RAPD扩增的影响 图 8 循环次数对 RAPD扩增的影响
M:Marker;泳道 1~7:35℃/1min、36℃/30s、36℃/
1min、37℃/30s、37℃/1min、38℃/30s、38℃/1min
M:Marker;1~5:循环次数分别为
25、30、35、40、45次
2.9 RAPD-PCR反应体系的正交优化
通过单因素试验结果,确定了模板、Mg2+、dNTPs、引物 S22和 Taq的适宜浓度范围(表 2),依此建立
L16(45)正交表(表 4),进行 RAPD扩增影响因素的正交优化试验(图 9)。由图可见第 3组扩增条带多而清
164
2008年第4期
晰,效果最好;4、5、6和 9组
出现非特异性条带;其他组条
带少且条带不清晰。所以确定
长心卡帕藻 RAPD扩增中模
板、Mg2+、dNTPs、引物 S22和
Taq的最佳浓度分别为 15ng、
2.0mmol/L、0.2mmol/L、
0.25μmol/L和 2.5U,重复试
验发现其重复性较好。
3 结论
采用 20%SDS法可从长
心卡帕藻的新鲜藻体中提取
出完整和高纯度的 DNA;在
进行长心卡帕藻的 RAPD分
析时,在 25μl的反应体系中,
加 入 DNA 模 板 15ng,Mg2+
2.0mmol/L,dNTPs0.2mmol/L,
引 物 0.25μmol/L,Taq2.5U,
反 应 程 序 为 94℃预 变 性
5min,然后经 94℃变性 30s、
37℃ 退 火 1min,72℃ 延 伸
2min,进行 30次循环,最后在 72℃再延伸 10min。
参考 文献
1 徐洵.海洋生物基因工程实验指南.北京:海洋出版社,2004,173.
2 周延清.DNA分子标记技术在植物研究中的应用.北京:化学工业出版
社,2005,94.
3 HayashiL,YokoyaNS,KikuchiDM,etal.JApplPhycol,2007,(Online)
DOI10.1007/s/0811-007-9234-2.
4 贾建航,王萍,金德敏,等.植物学报,2000,42(4):403~407.
5 DutcherJA,KapraunDF.JournalofPhycology,1994,6:267~273.
6 Mizukami1Y,Kito1H,KunimotoM,etal.JournalofAppliedPhycology,1998,10:23~29.
7 PatwayMU,vanderMeerJP.JournalofAppliedPhycology,1994,30:91~97.
8 BouzaN,Caujape-CastelsJ,Gonzalez-perezMA,etal.JournalofPhycology,2006,42:304~311.
9 SimonasV,AntaM,TapaniYM.Phycologia,39:109~117.
10 李文红,胡自民,覃志彪,等.海洋学报,2004,26(6):89~95.
11 SimMC,LimPE,GanSY,etal.JournalofAppliedPhycology,2007,19:763~769.
12 WatierRA,ProdohlPA,MaggsCA.PlantMolecularBiologyReporter,2000,18:275~281.
13 蔡一林,岳永生.水产生物统计,北京:中国农业出版社,2004,218~220.
14 蔡一林,岳永生.水产生物统计,北京:中国农业出版社,2004,278~279.
表 3 RAPD扩增反应体系中各因素的正交水平表
表 4 影响 RAPD扩增因素的正交试验组合
图 9 RAPD-PCR扩增的正交优化
M:Marker;泳道 1~16:表 4中的试验编号
赵素芬等:长心卡帕藻RAPD-PCR反应体系的正交优化研究 165