全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第5期
收稿日期:2008-03-31
基金项目:国家863项目(2006AA04Z343);国家自然科学基金(30770568)
作者简介:霍丹群(1965-),女,博士,研究方向:微生物资源开发;Tel:023-65112673,E-mail:huodq@cqu.edu.cn
细胞电融合技术因其具备对细胞无毒害、操作简单快速、融合同步性高、及时观察等特点,在单克隆抗
体、抗肿瘤疫苗及动物远缘杂交育种、植物菌株选育及绘制基因图谱等方面应用十分广泛[1~3]。由于微生物
细胞体积较小,一般在 1μm左右,而融合电极相对较大,电脉冲的作用位点不易控制,融合效率低,这成为
微生物细胞电融合的一个难题,甚至有人认为电融合技术不是很适用于微生物细胞[4]。到目前为止,微生物
细胞电融合与动植物细胞电融合相比发展较慢,寻找一种高效可控的融合技术是解决该问题的关键。目
前,利用微流控芯片技术来实现微纳米范围内的细胞融合,使微小尺寸电极施加脉冲直接作用于小体积细
胞,已成为电融合技术的主要发展方向,但许多构想还只停留在理论层次[5~8]。
本实验室研制出的基于微流控芯片的电融合系统,通过在微电极上施加一定的正弦信号产生电介质
电泳力,精确处理目标细胞,使细胞按照预先设计的方向及速度移动,成串紧密排列在电极表面,并施加适
当的电脉冲精确作用细胞接触部位,使细胞可逆击穿,辅以维持电场促进细胞融合过程的顺利进行,可实
现微小尺度下微生物细胞的电融合。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株 产生物表面活性剂酵母菌株(BS-34)由本实验室筛选获得。
1.1.2 试剂 酶液,磷酸高渗缓冲液 (PB)[9]中加入 1%蜗牛酶 (Snailase)(北京鼎国);细胞融合缓冲液
基于微电极阵列的微生物电融合
霍丹群 1 姜志忠 1 曹毅 1,2 康红燕 1 侯长军 1 杨军 1
(1重庆大学生物工程学院,重庆 400044;2重庆城市管理职业学院电子信息工程系,重庆 400055)
摘 要: 利用自主研制的梳状交叉微电极阵列细胞电融合芯片系统,研究微生物电融合。在酶解浓度1.5%、酶解温
度33℃、酶解时间3h、酶解pH值6.0、0.8mol/L山梨醇的渗透压条件下,获得生成率和再生率分别为95.2%和8.9%的微生
物细胞原生质体。在脉冲峰值电压50V、持续时间80μs、8个脉冲、间隔1s的电融合条件下,该原生质体通过电融合获得
一株菌株其乳化性能从62%提高到85%。
关键词: 电融合 微电极阵列 原生质体
MicroelectrodeArraysforMicrobialElectrofusion
HuoDanqun1 JiangZhizhong1 CaoYi1,2 KangHongyan1 HouChangjun1 YangJun1
(1BioengineeringDepartment,ChongqingUniversity,Chongqing400044;2DepartmentofElectronicEngineering,Chongqing
CityManagementColege,Chongqing400055)
Abstract: Microbialelectrofusionwasstudiedwithanelectrofusionsystem,whichwasdevelopedbasedonan
interdigitalandpectinatemicroelectrodearays.Theresultsshowedthattheformationrateofprotoplastswas95.2%and
generationratewas8.9%attheoptimum conditionsof1.5%snailaseat33℃ for3h,pH 6.0,and0.8mol/LD-sorbitolas
osmoticstabilizer.Anewstrainwasobtainedthroughelectrofusionsystem atintensityof50V,8electrofusionplusesand
intervalof80μs.Comparedwithparents,theemulsibilityofthenewwasincreasedfrom62%to85%.
Keywords: Electrofusion Microelectrode-aray Protoplast
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(PM),山梨醇 0.8mol/L,CaCl20.2mmol/L,MgCl20.2mmol/L,去离子水配制;预处理液[9];煤油。
1.1.3 培养基 完全培养基(CM),YPD培养基;高渗完全培养基(HCM),完全培养基加入 0.8mol/L山梨
醇;再生培养基,融合子再生培养基[9]加入 0.8mol/L山梨醇。
1.1.4 仪器 自主研制的基于梳状交叉微电极阵列结构的细胞电融合系统。融合实验平台(图 1)主要包
括 4个部分:(1)融合芯片及控制平台,(2)外围电路系统,(3)显微镜(OLYMPUSBX51M/MoticAE31)及视
频采集系统(MoticcooledMoticam3000type101M),(4)计算机控制及分析系统。整个融合实验建立在一个
长宽为 1cm的芯片上(图 2),融合小池的尺寸只有几十个微米,电极间距小,所需外加电场强度低,作用位
点精确、可控。
1.2 方法
1.2.1 菌株乳化性能测定 菌株上清液 3ml,加入 3ml煤油,水浴锅预热到 65℃,细胞超声破碎器于 80w
乳化 40s,室温静置 30min后,出现清晰的油-水界面,根据油水界面的位置测出剩余煤油的体积,由下式计
算出生物表面活性剂溶液对煤油的乳化力:
乳化力=已乳化煤油体积
乳化前煤油体积
=已乳化煤油的高度
乳化前煤油的高度
=乳化前煤油的高度-乳化后煤油的高度
乳化前煤油的高度
(1)
1.2.2 原生质体制备[9,10] 将培养到对数生长期的细胞(调到 107个/cm),离心(4000r/min,15min)洗涤 2
次加磷酸盐缓冲液,32℃预处理液处理 10min,酶液振荡(50r/min)酶解,随时取样镜检。酶解完成后用 PM
液制成原生质体悬液备用。用无菌水梯度稀释倒入 CM培养基计数,用 PB液梯度稀释倒入 HCM培养基计
数。原生质体生成率和再生率分别按下式计算:
X1=
A-B
A
×100%
X2=
C-B
A-B
×100%
其中,X1:生成率;X2:再生率;A:未经酶处理的总菌落数;B:酶处理后剩余菌落数;C:再生平板上的总
菌落数。
1.2.3 试验电信号及融合子筛选 将制得的原生质体悬浮于 PM液中,用微量注射器注入微电极芯片,先
施加 5V排队电压,使原生质体成串珠状排列,再加 8个、50V、持续时间 80μs、间隔 1s的脉冲,融合完成后
静置 15min,转入再生培养基中。由于芯片腔道体积在微米级别,只需要极少量的亲本细胞,筛选的工作量
较小,因此直接挑取生长速度快且大的单菌落,测定其生物学性状是否改变。
2 结果和分析
2.1 BS-34菌株原生质体制备条件的研究
由于细胞越小所需穿孔电压就越大,而外加高电脉冲能耗大,对设备要求高,用酶法去除细胞壁障碍
后,使用较低电脉冲即可有效作用细胞膜,同时也更有利于细胞间的物质交换。本试验对影响原生质体制
(2)
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备的酶浓度、酶解时间、酶解温度和 pH以及渗透压稳定这 5个主要因素作了系统研究。
2.1.1 酶浓度的影响 采用质量百分比浓度分别为 1.00%、1.25%、1.50%、1.75%和 2.00%的蜗牛酶,以
0.8mol/L山梨醇作为渗透压稳定剂,32℃酶解 3h,pH为 7.0,考察其对原生质体形成的影响。随着酶浓度的
增加,菌株生成率和再生率都有所上升,酶浓度在 1.5%时再生率达到最高(8.9%),1.75%时生成率达到最
高(95.7%),其后随着酶浓度的增加,两者都降低(图 3)。
蜗牛酶是一种混合酶,酶中往往含有一些对原生质体有害酶类(如过氧化物酶、核糖核酸酶等)。随着
酶量的增加,杂酶浓度也相应增加,当达到浓度阈值时,必然会影响原生质体的活性。同时酶浓度过高,使
细胞脱壁太彻底,可能会失去原生质体再生时合成细胞壁的引物,并易引起菌体凝聚,使中间菌体对酶接
触不均匀。酶量过低,细胞壁脱壁不充分,一些未脱落的菌体成分也可能会对原生质体的再生起抑制作用,
这可能也是生成率从 79.8%提高到 95.2%时,再生率也从 7.8%提高到 8.9%的原因之一[4,11,12]。综上所述,
确定 1.5%为最佳浓度参数。
2.1.2 酶解时间的影响 酶解时间研究选用 1h、2h、3h、4h和 5h5个梯度,考察其对原生质体形成的影
响。由图 4所示,酶解在 2~4h范围内,原生质体都有高生成率,再生率则随着酶解时间的延长而增高,在酶
解时间 3h时,达到最高的再生率 8.9%,其后再生率随着酶浓度的增高而降低。
酶解时间过短,原生质体去壁不充分,影响原生质体的生成。酶解时间过长,细胞脱壁太彻底,失去了
原生质体再生的引物;而且时间越长蜗牛酶中杂酶对原生质体的损害越强,降低了原生质体的活性。其次,
加长酶解时间可以导致早期所形成的原生质体变性。再次,时间过长菌体聚集粘连程度加重,不利于原生
质体分离[4,12]。故确定 3h为最佳时间参数。
图 3 酶浓度比对原生质体产量的影响 图 4 酶解时间对原生质体数量的影响
2.1.3 酶解温度的影响 选用 30、31、32、33、34℃5个酶解温度梯度,考察酶解温度对原生质体形成的影
响。随着温度的上升生成率和再生率都有所提高,到 33℃时达到最高的再生率 8.9%,温度再上升则再生率
不升反降(图 5)。
过高的温度已经导致酶失活与原生质体再生率的明显下降,还可导致在分离的原生质体中某些细胞
器的聚集,这样温度下的原生质体不适用于融合与代谢的研究。而过低的温度可能影响到原生质体膜的稳
定性与酶的活性,原生质体的制备率和再生率都不高[4,12]。综合考虑,确定 33℃为最佳温度参数,此时的生
成率和再生率分别为 95.2%和 8.9%。
2.1.4 pH的影响 考察了 5种不同 pH值(5、6、7、8、9)条件对原生质体形成的影响。随着 pH值的升高,
生成率和再生率都有先上升再下降的现象(图 6)。
可能 pH值关系到去壁酶的解离基团的状态和活性基团的作用,只有在合适的 pH值条件下,酶才能
最大的发挥它的效能,原生质体的生产率和再生率最高。如超此限度,酶的活性将会大大降低,甚至失活。
综上所述,确定 pH值 6为制备原生质体的最佳参数,此时的生产率和再生率分别为 95.2%和 8.9%。
霍丹群等:基于微电极阵列的微生物电融合 195
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2.1.5 渗透压稳定剂的影响 选取有机盐(如山梨醇、甘露醇和蔗糖)和无机盐(如氯化钙)作为渗透压稳
定剂,设定 0.7mol/L、0.8mol/L和 0.9mol/L3个浓度梯度。如图 7所示,在 0.8mol/L的山梨醇参数下获得
8.9%的最大再生率。可能山梨醇比起其它试剂来性状温和,更适合保护原生质体的渗透压环境。
2.2 BS-34菌株电融合
2.2.1 BS-34菌株电融合率 将细胞浓度调到 105个/cm,脉冲间隔设为 1s,持续 8个脉冲,观察脉冲峰值
电压在 40V、50V和 60V时的细胞在显微镜下的融合率。
由表 1可知,脉冲峰值电压过高和过低都没有很好的融合率,峰值电压在 50V时融合率较高。脉冲电
压 40V时,可能大部分细胞还未达到可逆击穿,细胞只是排列在
一起,没有相互的物质交换和融合;而脉冲电压 60V时,可能有
些细胞已经被不可逆击穿,细胞膜无法复原,同样无法融合[13]。
2.2.2 细胞融合前后乳化性能比较 从融合细胞中筛选出一株
菌株,乳化力从 62%增大到 85%(图 8)。该结果与其他学者得出
的,细胞融合可能使重组的原生质体的结构和成分发生改变、刺
激酶活力、增强对培养基中各成分的吸收而使菌株生长旺盛等的结论一致[13~15]。
图 5 酶解温度对原生质体数量的影响 图 6 pH值对原生质体生成率和再生率的影响
表 1 脉冲峰值电压对融合率的影响
图 8 菌株电融合前后乳化力比较图 7 渗透压稳定剂对原生质体的影响
3 结论
BS-34菌株原生质体最佳制备参数为酶浓度 1.5%、酶解温度 33℃、酶解时间 3h、pH值 6.0、0.8mol/L
山梨醇为渗透压稳定剂,此时生产率为 95.2%,再生率为 8.9%。在细胞浓度 105个/cm,8个脉冲峰值电压
50V、持续时间 80、间隔 1s的条件下,达到 8%的融合率。试验结果表明,基于梳状交叉微电极阵列结构的
细胞电融合技术可实现微生物菌株电融合,融合后的菌株其乳化力从 62%提高到 85%。
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(上接第192页)
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