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Advances in Nitric Oxide Biology of Plants

植物一氧化氮生物学的研究进展



全 文 :植物学通报 2005, 22 (6): 723~737
Chinese Bulletin of Botany
①中国科学院知识创新工程重要方向性项目 (KSCX2-SW-117)、国家自然科学基金 (30470183)、中国科学院
“百人计划” 和科技部国家科技基础条件平台项目 (2004DKA30430) 资助。
②通讯作者。Author for correspondence. E-mail: sqsong@xtbg.org.cn
收稿日期: 2005-01-07 接受日期: 2005-07-12 责任编辑: 孙冬花
专 题 介 绍
植物一氧化氮生物学的研究进展①
1程红焱 2宋松泉②
1 (中国科学院植物研究所 北京 100093) 2 (中国科学院西双版纳热带植物园 云南勐腊 666303)
摘要 一氧化氮 (NO) 是植物中的一种关键的信号分子。在植物中, NO的潜在来源包括一氧化氮合
成酶、硝酸还原酶、黄嘌呤氧化还原酶和非酶促途径。NO能促进植物生长, 延缓叶片、花和果实衰
老, 促进休眠和需光种子的萌发, 能与植物激素相互作用调节气孔运动, 诱导程序性细胞死亡和防御相
关基因的表达, 并在逆境中作为一种抗氧化剂起作用。 NO的细胞内信号反应包括环鸟苷酸、环腺苷二
磷酸核糖的产生和细胞质Ca2+浓度的增加, 其信号转导途径及其生物化学和细胞学本质还不十分清楚。
关键词 一氧化氮, 生物合成, 生长与发育, 植物激素, 程序性细胞死亡, 胁迫, 信号转导
Advances in Nitric Oxide Biology of Plants
1CHENG Hong-Yan 2SONG Song-Quan②
1 (Institute of Botany, the Chinese Academy of Sciences, Beijing 100093)
2 (Xishuangbanna Tropical Botanical Garden, the Chinese Academy of Sciences, Mengla, Yunnan 666303)
Abstract Nitric oxide (NO) is a key signaling molecule in plants. The potential sources of NO in
plants include nitric oxide synthase, nitrate reductase, xanthine oxidoreductase and the nonen-
zymatic pathway. NO can enhance plant growth; delay senescence of leaves, flowers and fruits;
stimulate germination of seeds that are dormancy and/or light-requiring seeds for germination;
and interact with phytohormones to mediate stomatal movement. Programmed cell death and
expression of defence-related genes can also be induced by NO. NO can serve an antioxidant
function during various stresses. Intracellular signaling responses to NO involve generation of
cyclic guanosine monophosphate, cyclic ADP-ribose and elevation of cytosolic calcium, but the
knowledge of the NO signal transduction pathway and its biochemical and cellular nature is yet
to be revealed.
Key words Nitric oxide, Nitric oxide biosynthesis, Growth and development, Phytohormone,
Programmed cell death, Stress, Signaling transduction
一氧化氮 (nitric oxide, NO) 是一种具有水
溶性和脂溶性的气体小分子, 近年来被认为是
一种在植物中普遍存在的关键信号分子
(Durner and Klessig, 1999; Wendehenne et al.,
724 22(6)
2004)。早在1979年就发现植物能释放NO, 并
影响其生长 (Anderson and Mansfield, 1979),
但此后关于 NO对植物生长发育影响的研究
仅局限在少数的几个实验室 (Leshem and
Haramaty, 1996; Laxalt et al., 1997)。直到
1998年, 两篇具有里程碑作用的论文 (Delled-
onne et al., 1998; Durner et al., 1998) 提出NO
是植物的防御信号后, NO的植物生物学研究
才迅速展开。
关于植物 NO的信号分子作用已经有很
好的综述 (Durner and Klessig, 1999; Beligni
and Lamattina, 2001; Wendehenne et al., 2001;
Neill et al., 2002b, 2003)。本文主要综述NO
的生物合成, NO对植物生长发育的作用, NO
与环境胁迫和程序性细胞死亡 (programmed
cell death, PCD) 的关系。
1 NO的生物合成
NO是一种气体自由基, 在p2轨道上具有
未配对电子, 但能保持电荷中性。由于它的
自由基性质, 容易得到或失去一个电子, 因而
能以一氧化氮自由基 (NO·)、亚硝酸正离子
(nitrosonium cation, NO+)和硝酰自由基
( n i t r o x y l r a d i c a l , N O-) 3 种形式存在
(Wojtaszek, 2000)。NO 微溶于水 (0.047 cm3.
cm-3 H2O, 20 °C, 1 atm), 铁盐能增强其水溶性,
无论是在细胞的水溶性的原生质还是在脂溶性
的膜系统, 都能扩散移动 (Anderson and
Mansfield, 1979)。因此, NO一旦产生, 就容易
在细胞内和细胞间扩散。但是, 作为一种活性
自由基, NO的半衰期只有几秒钟。NO能与O2
快速反应生成NO2, 然后快速降解为硝酸根离
子和亚硝酸根离子。NO的作用范围主要是产
生NO的细胞和邻近的细胞 (Neill et al., 2003)。
在植物中有几条潜在的产生 NO的途径
(图 1), 包括一氧化氮合成酶 (nitric oxide
s y n t h a s e , N O S )、硝酸还原酶 ( n i r e a t e
reductase, NR)、黄嘌呤氧化还原酶 (xanthine
oxidoreductase, XOR) 和非酶促反应途径。
这些途径对 NO产生的贡献取决于物种、细
胞 /组织、植株的生长条件以及在专一条件
下信号途径的活性。表1总结了植物体内NO
的来源以及对专一条件的反应。
1.1 一氧化氮合成酶
在哺乳动物中, 有3个基因编码NOS, 其
中在各种细胞中存在的内皮NOS (endothelial
NOS, eNOS) 和最初从神经组织中鉴定的 nNOS
(neuronal NOS) 均为组成型表达; 而 iNOS
(inducible NOS, 也称为mNOS) 是一种诱导酶,
在脂多糖和干扰素存在时增量表达。nNOS
的分子量较大, 约为160 kD; 其次为eNOS, 约
为 135 kD; iNOS的分子量较小, 约为130 kD
(Furchgott, 1995)。
在体内, 所有 NOS似乎都以同型二聚体
的形式存在, 每个亚基含有3个明显不同的结
构域, 即氧化酶结构域、还原酶结构域和钙
调素 (calmodulin, CaM) 结合位点。氧化酶结
构域含有血红素 (haem) 和四氢生物蝶呤
(tetrahydrobiopterin) 的结合位点。还原酶结
构域含有 FAD和NADPH的结合位点。CaM
结合位点位于氧化酶和还原酶结构域之间。
iNOS不依赖于Ca2+, 并持久地与CaM结合; 而
nNOS和eNOS依赖于Ca2+, CaM作为调节组
件。NOS催化L-精氨酸 (L-arginine) 生成L-
瓜氨酸 (L-citrulline) 和 NO, 在此反应中
NADPH和分子氧是必须的, 精氨酸首先被转
变成为羟基精氨酸 (hydroxyarginine), 一种非
释放的中间产物 , 然后生成瓜氨酸和 N O
(Furchgott, 1995)。
Ninnemann和Maier (1996) 利用精氨酸类
似物Nw-硝基-L-精氨酸 (Nw-nitro-L-arginine,
L-NAA) 和Nw-硝基-L-精氨酸甲基酯 (Nw-ni-
tro-L-arginine methylester, L-NAME) 的抑制
作用和放射性标记的瓜氨酸的生成作为证据,
首次证明在高等植物中存在 N O S 活性。
Ribeiro等 (1999) 利用老鼠 iNOS抗体和兔
7252005 程红焱等: 植物一氧化氮生物学的研究进展
nNOS抗体进行免疫印迹实验, 发现玉米(Zea
mays)根和幼叶的可溶性部分含有166 kD的蛋
白带; 此外, NOS酶提取液可以将14C-精氨酸
转变为 14C-瓜氨酸。这些证据表明在玉米中
存在 NOS。
抗体杂交试验表明, NOS蛋白定位在细胞
质, 但能转移至细胞核, 这种转移取决于细胞
的生长时期 (Ribeiro et al., 1999)。利用精氨
酸-瓜氨酸分析 (arginine-citrulline assay), 发
现一种依赖于 Ca2+ 的 NOS活性存在于豌豆
(Pisum sativum)叶的过氧化物中, 而且被NOS
抑制剂氨基胍 (aminoguanidine) 抑制 (Barroso
et al., 1999)。
在大豆(Glycine max)细胞悬浮培养物中,
细菌侵染迅速诱导NO的产生, NOS的抑制剂
L-NNA能够减少细菌诱导的NO生成 (Delled-
onne et al., 1998)。用烟草花叶病毒 (tobacco
mosaic virus, TMV) 感染烟草(Nicotiana
tabacum)植株也导致 NOS产生的增加, 此效
应被 NOS抑制剂抑制 (Durner et al., 1998)。
在白羽扇豆 (Lupinus albus) 的根和根瘤中已
检测到NOS的活性, 但这种活性被NOS抑制
剂 NG-甲基 -L-精氨酸 (NG-monomethyl-L-
arginine, L-NMMA) 抑制 (Cueto et al., 1996)。
在拟南芥(Arabidopsis thaliana)中, 机械刺
激诱导 NO的产生, 以及被 L-NMMA抑制
图1 植物体内一氧化氮的产生
在植物中有几条潜在的 NO来源, 包括一氧化氮合酶 (NOS)、硝酸还原酶 (NR)、黄嘌呤氧化还原
酶和非酶促来源。NO一旦产生就能够诱导各种反应, 或者与活性氧反应产生过亚硝酸。值得注意
的是, NO可能以 3种形式存在, 虽然此图仅表明NO自由基具有生物学活性, 但NO+和NO-也具有生
物学活性
Fig. 1 The production of nitric oxide in plant
There is evidence for several potential sources of NO in plants, including nitric oxide synthase (NOS),
nitrate reductase (NR), xanthine oxidoreductase or nonenzymatic sources. Once generated, NO can induce
various effects, or react with reactive oxygen species to generate peroxynitrite. It should be noted that NO
can exist in three forms, and although it is implied here that only the radical is biologically active, both the
NO+ and NO- may have biological effects (Neill et al., 2003)
726 22(6)
(Garcês et al., 2001)。
最近, 已经从植物中鉴定了两组类NOS,
一组是来自拟南芥和烟草由病原菌诱导的
NOS (iNOS, Chandok et al., 2003), 另一组是来
自拟南芥由激素活化的NOS (AtNOS1, Guo et
al., 2003)。病原菌诱导的NOS是一组不同的
甘氨酸脱羧酶复合体 (glycine decarboxylase
complex) 的P蛋白 (P protein) (Chandok et al.,
2003); 它表现出典型的NOS活性, 需要类似于
哺乳动物 NOS的辅因子。根据蜗牛 (Helix
pomatia) 中与 NO合成有关的蛋白质的序列
同源性, 已经克隆了激素活化的NOS (Guo et
al., 2003)。AtNOS1与哺乳动物的NOS和植
物的 iNOS不具有序列同源性, 但AtNOS1显
示出黄素、亚铁血红素和不依赖于四氢生物
蝶呤的NOS活性 (Wendehenne et al., 2004)。
在对ABA的反应中, AtNOS1 涉及NO的产生
(Guo et al., 2003)。
尽管越来越多的证据表明在植物中存在
NOS, 但也有相反的报道。例如, NOS抑制剂
表 1 植物一氧化氮的来源
Table 1 Sources of nitric oxide in various plants (Neill et al., 2003)
NO的来源 证 据 物 种 评 论
一氧化氮合 在提取物中存在活性 豌豆; 玉米; 烟草; 大豆; 在豌豆中ABA诱导的NO合成和气孔关
酶 (NOS) 白羽扇豆; Mucuna 闭被 NOS抑制剂抑制; 在拟南芥中机械
hassjoo 胁迫诱导 NO的产生; 在植物中还未证
实类NOS序列, 且在植物中NOS的定位
是不清楚的
NOS活性被哺乳动物 烟草; 大豆; 豌豆;
NOS抑制剂抑制 白羽扇豆
NO的释放被 NOS抑制 大豆; 烟草; 豌豆;
剂减少 拟南芥
抗 -NOS的抗体被利用 豌豆; 小麦; 玉米
来鉴定植物蛋白
抗 -NOS的抗体抑制此 豌豆
酶的活性
NO的释放不被 NOS抑 拟南芥; 向日葵; 雷氏衣
制剂抑制 藻; 斜生栅藻
硝酸还原酶(NR) NR催化 NO的体外产生 玉米 在拟南芥中, ABA-诱导的气孔关闭需要
NR-调节的 NO合成
NR催化 NO的体内产生 向日葵; 菠菜; 拟南芥 对决定细胞内亚硝酸和硝酸浓度是重要
的; NR的亚细胞定位需要被确定; 需要
测定处理后 NR活性的变化
与野生型植株相比, NR 大豆; 拟南芥;雷氏衣藻
缺乏的突变体减少 NO
的产生
黄嘌呤氧化还原 在体外低氧分压下, 哺乳 尽管许多植物组织在厌氧条件下具有此
酶 (XOR) 动物的 XOR产生 NO 酶的活性, 但在植物中没有 XOR 产生
NO的报道
亚硝酸: NO- 亚硝酸还原活性导致 烟草 一种需要进一步鉴定的潜在重要酶
还原酶 NO的产生
非酶促来源 类胡萝卜素转化 NO2 需要低 pH和一种还原剂, 例如抗坏血酸
成为 NO
亚硝酸转化成 NO; NO2 大麦糊粉层非原生质体
转化成 NO
7272005 程红焱等: 植物一氧化氮生物学的研究进展
对叶片提取物和完整组织中的NO合成没有影
响 (Rockel et al., 2002)。在被细菌感染的拟
南芥细胞中, NOS的抑制剂对NO的释放没有
作用 (Clarke et al . , 2000)。在雷氏衣藻
(Chlamydomonas reinhardtii) 中, NOS抑制剂
不影响依赖亚硝酸的NO产生, L-精氨酸 (已
知的 N O S 底物 )的添加不诱导酶的活性
(Sakihama et al., 2002)。这些结果说明植物
中还存在其他的 NO合成途径。
1.2 硝酸还原酶
硝酸还原酶 (nitrate reductase, NR) 也是
植物产生NO的来源 (表 1)。NR是高等植物
中同化硝酸盐的关键酶, 其催化的反应为限速
反应 (Lea, 1999)。NR利用NAD(P)H作为电
子供体, 催化硝酸盐转变为亚硝酸盐 (Lea,
1999), 在体外 (Yamasaki and Sakihama, 2000)
和体内 (Rockel et al., 2002) 都能产生NO, 并
利用钼辅因子 (molybdenum cofactor, MoCo)
作为催化位点(Harrison, 2002)。
钨酸盐作为一种钼的类似物, 预处理细胞
能降低NR的活性。植物中NR活性的降低是
由于失活的钨蛋白 (tungstoprotein) 的形成引
起的 (Neill et al., 2003)。在拟南芥保卫细胞
中ABA诱导的NO合成, 以及伴随的ABA诱
导的气孔关闭被钨酸盐抑制, 但这些ABA的
效应不被NOS抑制剂L-NAME抑制。在拟南
芥中, 钨酸盐不抑制由NO、H2O2或者黑暗诱
导的气孔关闭, 表明钨酸盐的作用是对NO合
成专一的。
大豆的 NR缺陷型突变体不能像野生型
植株一样释放NO, 表明NR是一种潜在的产生
NO的酶 (表1)。大豆NR的活性依赖于NAD
(P)H, 最适 pH为 6.75, 对氰化物敏感。在拟
南芥NR缺陷型和NR突变体 (nia1和 nia2)
中都证明了NR在ABA诱导NO形成过程中
所起的作用 (Neill et al., 2003)。Sakihama
等(2002) 用雷氏衣藻为材料, 也发现NR是
NO的来源。
1.3 NO的其他酶促来源
表 1还描述了 NO的其他酶促来源。例
如, Stohr等 (2001) 发现烟草根具有亚硝酸还
原活性, 能导致NO的产生。Harrison (2002)
发现XOR具有产生NO的能力。与NR一样,
XOR也是一个以钼为辅因子的氧化还原酶; 在
低氧张力下, XOR将亚硝酸转变为NO; 在有氧
存在时, 会形成超氧化物; 超氧化物随后与NO
反应形成过亚硝酸 (peroxynitrite) (Godber et
al., 2000a, 2000b)。因此, XOR具有产生2种
信号分子的能力, 当氧张力高时, 产生超氧化
物 (超氧化物可以歧化为 H 2O2) 和活性氧
(ROS); 当氧张力低时, 产生NO。当植物组织
如根暂时处于缺氧状态时, 氧分子的可利用性
则成为XOR产生信号分子的调节因子。已经
在植物过氧化物体中发现了 X O R 的活性
(Corpas et al., 2001)。迄今为止, XOR在植物
信号转导中的作用研究还很少。
1.4 NO的非酶促合成途径
在酸性或者还原条件下, 亚硝酸的还原将
产生 NO。亚硝酸能够与抗坏血酸反应形成
脱氢抗坏血酸 (dehydroascorbic acid) 和 NO
(Weitzberg and Lundberg, 1998)。在培养介
质中添加亚硝酸盐时, 大麦糊粉层细胞能迅速
产生NO。NO的产生需要酸性的质外体环境,
介质中的酚类化合物能够提高NO的产生速率
(Bethke et al., 2004)。此外, 赤霉素和 ABA
处理后可观察到质外体的非酶促NO合成, 这
两种激素能迅速地酸化质外体介质 (Wende-
henne et al., 2004)。目前, 这种非酶促NO产
生的生理意义还不清楚。
1.5 NO的测定
N O 的测定可以采用气相色谱 ( g a s
chromatography) 和质谱 (mass spectrometry)
法(Magalhaes et al. , 2000)、化学发光法
(chemiluminescence) (Wildt et al., 1997) 以及
激光光 -声波谱仪法 (laser photo-acoustic
spectroscopy) (Leshem and Pinchasov,
728 22(6)
2000)。溶液中的NO可用NO电极、也可以
通过NO与血红蛋白反应来测定 (Murphy and
Noack, 1994), 但血红蛋白还能与活性氧发生反
应。荧光染料 DAF-2DA (4,5-diaminofluo-
rescein diacetate) 可以渗透进入细胞, 只有与
NO发生反应后才呈现荧光, 因而可利用荧光
显微镜 (fluorescence microscopy) 和激光共聚
焦显微镜 (laser confocal microscopy) 监测细
胞内 NO的含量 (Kojima et al., 1998), 而且
DAF-2DA不与活性氧发生反应 (Foissner et
al. , 2000)。电子自旋共振 (electron spin
resonance, EPR) 也可以用于测定植物细胞内
NO的含量 (Pagnussat et al., 2002)。
2 NO对植物生长发育的作用
在研究中常用的 N O 供体是硝普钠
(sodium nitroprusside, SNP), 在进入细胞后产
生NO+; 其他的NO供体包括S-亚硝基谷胱甘
肽 (S-nitrosoglutathione, GSNO), S-亚硝基-N-
乙酰青霉胺 (S-nitroso-N-acerylpenicillamine,
SNAP) (Durner et al., 1998; Hogg, 2000) 等。
常用的NO清除剂有PTIO (2-phenel-4,4,5,5-
tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxide) 和
cPTIO (carboxy PTIO) (Neill et al., 2003)。
2.1 NO与植物生长
植物在正常生长条件下会释放 NO。野
生豌豆叶片中NO的含量为160 nmol.g-1 FW
(Leshem and Haramaty, 1996)。野生型拟南
芥的NO释放量为500 nL.g-1 FW (Magalhaes
et al., 2000)。在病原体侵染后, 拟南芥细胞
的 NO 释放速率为 180 nmol.g-1 FW.h-1
(Clarke et al. , 2000)。生长素处理后黄瓜
(Cucumis sativus)根部的内源 NO含量为 55
nmol.g-1 FW (Pagnussat et al., 2002)。
NO 对植物生长的影响与其浓度有关。
高浓度的 NO (400~800 nL.L-1) 抑制番茄
(Lycopersicon esculentum)的生长, 低浓度
(0~200 nL.L-1) 时促进生长 (Anderson and
Mansfield, 1979); 对莴苣(Lactuca sativa)
(Hufton et al., 1996) 和豌豆 (Leshem and
Haramaty, 1996) 生长的影响也表现出类似的
结果。Takahashi和Yamasaki (2002) 证明在
叶绿体内 N O 能够可逆地抑制电子传递和
A T P 的合成。
NO供体能抑制马铃薯(Solanum tuber-
osum)、莴苣和拟南芥下胚轴的生长, 促进去
黄化和提高叶绿素的含量 ( B e l i g n i a n d
Lamattina, 2000)。Pagnussat等 (2002) 也发
现施加NO供体SNP和SNAP可以促进黄瓜不
定根的发育。生长素诱导的根的生长和侧根
的形成能够被 N O 的清除剂 c P T I O 阻断
(Pagnussat et al., 2002)。
2.2 NO延缓植物衰老
NO能增加豌豆叶片、尤其是保卫细胞
中叶绿素的含量 (Leshem et al., 1997); 延缓
Phytophthora infestants侵染的马铃薯叶片中
叶绿素的降解 (Laxalt et al., 1997)。Graziano
等 (2002) 表明NO能改善铁的可利用性。缺
铁引起的缺绿是由于叶绿体的发育受到抑制;
NO处理抑制玉米缺绿, 施加NO能逆转玉米
黄条纹(yellow stripe)突变体的铁缺乏。0.05,
0.1和0.2 mmol.L-1 SNP处理能降低小麦叶片
中H2O2和丙二醛 (malondialdehyde, MDA) 的
含量, 而0.5 mmol.L-1 SNP处理则增加其含量
(Tu et al., 2003)。
N O 具有抗衰老作用。L e s h e m 和
Haramaty (1996) 发现在促进衰老的条件下, 施
加NO供体可以降低豌豆叶片中乙烯的产生;
随后的研究发现 N O 抑制乙烯的生物合成
(Leshem, 2001)。Leshem (2001) 还发现NO供
体能够延长几种切花的寿命。在香蕉(Musa
nana)和草莓(Fragaria ananassa)果实的成熟
过程中乙烯含量增加, 同时 NO的释放量减
少。对蔬菜和水果施加 NO同样可以延缓其
衰老, 延长其采后寿命 (Leshem and Pinchasov,
2000; Leshem, 2001)。
7292005 程红焱等: 植物一氧化氮生物学的研究进展
2.3 NO促进种子萌发
NO能够促进许多植物种子的萌发,特别
是光敏感种子的萌发 (Giba et al., 2003)。外
源NO供体能够打破莴苣种子的暗休眠,但能
被 NO 的清除剂 PTIO 逆转 (Bel igni and
Lamattina, 2000)。这种效应能够解释由含有
NO的烟诱导的加州小懈树 (Emmenanthe
penduliflora) 休眠种子的萌发 (Keeley and
Fotheringham, 1997)。Giba等 (1998) 利用各
种NO供体和相应的失活化合物, 证明了光敏
色素控制的皇后树 (empress tree) 种子的萌发
受 NO的调节。在低 pH条件下, 亚硝酸转变
为NO (Giba et al., 1998)。因此, 一些由亚硝
酸促进种子萌发的早期报道能够用 NO的作
用来解释。
山红树 (Pellacalyx yunnanensis) 是云南
的特有种, 已被列为国家三级重点保护植物。
在黑暗条件下, 无论是恒温 (15、20、25、
30、35和 40 °C) 还是变温 (15 °C/10 °C、20
°C/10 °C、25 °C/10 °C、30 °C/10 °C、35
°C/10 °C和40 °C/10 °C), 种子吸胀44 天时, 萌
发率几乎为零; 变光 (14 小时光照/10 小时黑
暗) 显著地增加种子的萌发率和萌发速率; 有
趣的是0.01~0.1 mmol.L-1 SNP能代替光照, 明
显地增加种子的萌发率和萌发速率(Cheng et
al., 2006)。硝酸和亚硝酸处理也能代替光照
促进山红树种子的萌发(待发表资料)。
2.4 NO与植物激素
细胞分裂素可以诱导烟草和拟南芥细胞
培养物的 NO合成 (Tun et al., 2001)。一些
细胞分裂素的效应能够被NO模拟, NO供体
诱导苋幼苗中betalaine的积累, 细胞分裂素诱
导的 beta la ine 的积累被 NOS 抑制剂抑制
(Scherer and Holk, 2000)。这些结果表明NO
可能具有调节细胞分裂素的作用。
在豌豆保卫细胞和其他表皮细胞中ABA
诱导NO的迅速合成 (Neill et al., 2002a)。在
拟南芥 (Desikan et al., 2002) 和蚕豆 (Garcia-
Mata and Lamattina, 2002) 中也发现了同样的
现象。在拟南芥悬浮培养物中, ABA不能诱
导NO的合成 (Tun et al., 2001), 说明ABA诱
导的 NO 合成具有组织特异性。在豌豆中,
ABA诱导的保卫细胞NO的合成是气孔关闭
所需要的, 当用清除剂PTIO去除NO时, ABA
诱导的气孔关闭则被显著地抑制。药理学证
据表明NOS作为一种NO的来源, ABA诱导的
气孔关闭和NO的合成都被L-NAME抑制, 但
不被钨酸盐抑制 (Neill et al., 2002a)。
Pagnussat等 (2002) 报道生长素能够诱导
黄瓜根合成NO, 虽然NO的合成途径还没有
确定 , 但黄瓜根的生长和侧根的形成需要
N O。
2.5 NO延期植物开花
外源SNP处理拟南芥植株促进其营养生
长, 延期开花的效应与处理剂量有关 (He et al.,
2004)。nox1突变体 (表现出内源NO水平增
加) 比野生型植株开花晚 (He et al., 2004), 而
atnos1突变体 (NOS mutant) 具有较低的NO
水平, 在密闭系统中开花较早 (Crawford and
Guo, 2005)。
3 NO与环境胁迫
3.1 NO在非生物胁迫中的作用
干旱、低温和高温、紫外线和臭氧等逆
境诱导 ROS的形成 (Neill et al. , 2002b;
Vranova et al., 2002)。ROS引起氧化伤害, 同
时也触发不同的信号途径 (Neill et al., 2002b;
Vranova et al., 2002)。NO以不同的方式与
ROS相互作用, 在不同的胁迫中可能作为一种
抗氧化剂起作用 (Beligni and Lamattina,
1999)。NO调节超氧化物的形成 (Caro and
Puntarulo, 1998) 和抑制脂质过氧化 (Boveris
et al., 2000) 也说明其潜在的抗氧化作用。此
外, 过量的NO会导致亚硝化胁迫(nitrosative
stress), 因此, ROS/NO的平衡是非常重要的。
Mata和Lamattina (2001) 的研究表明, 在
730 22(6)
干旱2和3小时后, 用150 mmol.L-1 SNP预处
理的离体小麦叶片的水分保持能力比用水或
者NO2-/NO3-预处理的高 15%。在受到干旱
胁迫 7天后的小麦幼苗中也观察到SNP处理
提高保水能力的效应。这些结果与SNP处理
的离体小麦叶片中蒸腾速率降低 20% 相一
致。N O 也能诱导紫露草 ( T r a d e s c a n t i a
sp.)、Salpichroa organifolia和蚕豆的气孔
分别关闭 35%、30% 和 65% (Mata and
Lamattina, 2001)。膨压丧失后, ABA被诱导
合成以及ABA刺激保卫细胞NO的合成, 但脱
水对 NO产生的影响还不清楚。Leshem和
Haramaty (1996) 报道萎蔫增加豌豆植株的NO
释放量, 但对拟南芥却相反 (Magalhaes et al.,
2000)。这可能是由于种间差异, 也可能是由
于水分胁迫的强度不同。然而, 施加NO供体
确实能使几种植物气孔的孔径减小, 从而降低
植物的蒸腾。有证据表明NO与ROS相互作
用, 诱导 ABA的生物合成。在小麦(Triticum
aestivum)幼苗对干旱胁迫的反应中, 类 NOS
活性增加, ABA的积累被NOS抑制剂所抑制
(Zhao et al., 2001)。已经提出 NO也是ABA
诱导的气孔关闭的一种信号组分; NO的合成
对于 ABA诱导的气孔关闭是需要的, 此外,
ABA促进保卫细胞中NO的合成 (Neill et al.,
2002a; Mata and Lamattina, 2003)。
短期热胁迫引起苜蓿(Medicago sativa)
NO产生的增加 (Leshem, 2001)。施加NO可
调节番茄、小麦和玉米的冷耐性 (Lamattina
et al., 2001)。这些效应可能与 NO的抗氧化
性质有关, 在经历冷和热胁迫后, NO抑制ROS
积累到较高的水平 (Neill et al., 2002b)。
Zhao等 (2004) 的研究表明, 在两种生态
类型的芦苇 (Phragmites communis) 愈伤组织
中, 外源SNP降低Na的程度与SNP的浓度有
关, 并增加Ca和K/Na比例; Nw-硝基 -L-精氨
酸 (Nw-nitro-L-arginine, NOS的抑制剂) 和1-
烃氧基 -2-苯基 -3-氧-4,4,5,5-四甲基-咪唑啉
(2-phenyl-4,4,5,5-tetramethyl-imidazoline-1-
oxyl-3-oxyde, 专一的NO清除剂) 能拮抗NO
的效应, 增加Na含量, 降低Ca含量和K/Na比
例。NO通过促进质膜 H+-ATPase活性的表
达和增加K/Na比例诱导盐耐性 (Zhao et al.,
2004)。
Mackerness等 (2001) 利用 NO供体和
NOS抑制剂, 表明 UV-B诱导的查耳酮合酶
(chalcone synthase, CHS) 的基因表达是通过
一种类NOS起作用。在UV-B辐射前, 用NO
供体处理马铃薯块茎, 健康叶片的数量比未用
NO预处理的植株高 50% (Lamattina et al.,
2001)。
与 NO相互作用的大气污染物可能是臭
氧。在拟南芥植株中 , 臭氧处理在水杨酸
(salicylic acid, SA) 积累和细胞死亡之前诱导
NOS活性 (Rao and Davis, 2001)。NO诱导
烟草合成 SA (Durner et al., 1998)。NO处理
增加臭氧诱导的乙烯产生量和增加叶片的伤
害 (Rao and Davis, 2001)。
3.2 NO与生物相互作用
用无毒的 Pseudomonas syringae pv
glycinea处理大豆培养物诱导 NO的迅速合
成, 类似于H2O2产生的动力学 (Delledonne et
al., 1998)。此外, NO供体诱导细胞的死亡, 以
及苯丙氨酸解氨酶 ( p h e n y l a l a n i n e
ammonialyase, PAL) 和CHS基因的表达。细
菌诱导的细胞死亡和PAL基因的表达被NOS
的抑制剂阻断, 以及在大豆的细胞质中鉴定出
组成性NOS的活性。在拟南芥叶片中, 由 P.
s y r i n g a e p v g l y c i n e a 诱导的超敏反应
(hypersensitive response, HR) 被NOS抑制剂
降低。这些结果表明病原体诱导的经NOS产
生的 NO与 H2O2相互作用, 调节 HR。
Durner等 (1998) 也提供了令人信服的证
据, 表明NO在植物防御反应中的作用。用具
有诱导 HR的 TMV品种感染烟草植株诱导
NOS活性, 但这种诱导的NOS活性被NOS抑
7312005 程红焱等: 植物一氧化氮生物学的研究进展
制剂抑制。NO也诱导SA的合成和防御相关
基因PR-1的表达。SA是一种防御信号分子,
与系统性获得抗性 ( s y s t e m i c a q u i r e d
resistance, SAR) 有关 (Draper, 1997)。SA处
理导致NO产生的增加, 在HR和SAR过程中,
H2O2、NO与SA之间存在着复杂的信号关系
(Song and Goodman, 2001)。
在病原体侵染的过程中 , 植物抗毒素
(phytoalexin) 的积累是另一个与HR有关的现
象。用 NO供体处理马铃薯块茎增加植物抗
毒素的积累 (Noritake et al., 1996)。NO的这
种调节效应被 NO清除剂 PTIO所抑制。NO
处理大豆子叶触发植物抗毒素的生物合成
(Modolo et al., 2002)。此外, 诱导物 (elicitor)
引起的植物抗毒素的形成被NOS抑制剂抑制,
暗示 NOS在这个途径中作为 NO的来源。
NO也在细菌与豆科植物的共生过程中起
作用。Mathieu等 (1998) 用EPR发现了大豆
根瘤中存在NO, Herouart等 (2002) 用激光共
聚焦显微镜也发现了苜蓿根瘤中存在 NO。
已经在羽扇豆属的根瘤中检测到了NOS的免
疫活性 (Cueto et al., 1996)。然而, NO在共
生过程中的确切功能还很不明了。
4 NO与程序性细胞死亡
PCD是一种由遗传决定的且受代谢指导
的细胞自杀性事件。NO诱导的细胞死亡也
具有PCD的特征, 如染色质浓缩, 需要基因表
达和类 caspase级联的活化。在拟南芥细胞
中, 半胱氨酸蛋白酶 (cysteine protease) 的过
量表达抑制病原菌和 NO诱导的细胞死亡。
Delledonne等 (2001) 证明NO和ROS之
间的相互作用决定PCD是否发生; NO本身不
能引起大豆细胞培养物发生PCD, 但NO与超
氧化物的比值可能决定PCD; 当超氧化物的水
平高于NO时, NO与超氧化物反应生成过亚硝
酸, 过亚硝酸不引起PCD; 当NO的量大于超
氧化物时, NO与超氧化物歧化作用生成的
H2O2反应, 引起细胞死亡。de Pinto等 (2002)
证明了H2O2和NO与抗氧化剂含量之间的相
互作用。在烟草BY-2细胞中, 低浓度的NO或
H2O2单独作用不能引起PCD, 对PAL活性也
没有影响; 但H2O2和NO共同处理诱导大量增
加具有 PCD特征的细胞死亡以及PAL活性。
此外, H2O2和NO共同处理也增加还原抗坏血
酸和谷胱甘肽的酶活性。
在大麦糊粉层细胞中, GA诱导的PCD被
NO延迟, 这种现象与过氧化氢酶 (catalase) 和
超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase) 活性
丧失被延迟有关 (Beligni et al., 2002)。然而,
NO不抑制GA诱导的a-淀粉酶的表达及其活
性, 这说明NO对细胞代谢不具有普遍的作用,
而是作为PCD的一种专一的内源调节分子起
作用 (Beligni et al., 2002)。
机械胁迫引起的PCD也可能涉及NO。在
大叶落地生根 (Kalanchoe daigremontiana)
中, 叶片和愈伤组织离心诱导NO的产生以及
随后的DNA断裂和细胞死亡 (Pedroso et al.,
2000)。Garc ê s等 (2001) 也表明拟南芥组织
的机械胁迫也通过类 NOS诱导 NO的产生。
PCD与线粒体功能的改变和NO的作用有
关。在哺乳动物细胞中, 短期暴露于NO通过
复合物 (complex)Ⅳ的可逆抑制来降低线粒体
的呼吸作用。延长在 NO中的暴露时间导致
复合物Ⅰ的逐渐的和持续的抑制, 同时降低了
细胞内谷胱甘肽的浓度, 最终导致细胞的死亡
(Clementi et al., 1998)。在植物细胞中, NO通
过抑制细胞色素氧化酶的活性抑制线粒体的
ATP的合成 (Yamasaki et al., 2001)。线粒体
活性的改变促进植物细胞的PCD。在拟南芥
细胞中, NO通过呼吸作用的抑制和线粒体细
胞色素 c的释放诱导 PCD的发生 (Zottini et
al., 2002)。用 NO处理甜橙(Citrus sinensis)
培养物诱导具有PCD特征的细胞死亡 (Saviani
et al., 2002)。环孢霉素 A (cyclosporine A)
是一种线粒体渗透转变孔 (permeability tran-
732 22(6)
sition pore, PTP) 形成的抑制剂, 抑制 NO诱
导的PCD以及线粒体的膜电势 (Saviani et al.,
2002)。
5 NO的信号转导
作为有效的信号分子, 当需要时它必须迅
速和高效率地产生, 在细胞内诱导特定的反应;
当不再需要时, 迅速和高效率地消除。NO具
有典型的信号分子作用。例如, 持续的NO合
成是其他信号途径运转所必须的, 清除NO将抑
制一些信号途径。另一种可能的潜在效应是
组成型产生的NO抑制某些专一的细胞过程。
NO也能与其他的潜在的信号分子起作
用, 例如超氧化物阴离子自由基 (·O2-)( Pryor
and Squadrito, 1995)。在植物中, 超氧化物的
来源包括线粒体和叶绿体的电子漏 , 以及
NADPH氧化酶 (Neill et al., 2002b, 2002c)。
实际上, 如果超氧化物一旦产生, H2O2的存在
是不可避免的。在植物中, 超氧化物和 H2O2
被认为是信号分子 (Neill et al., 2002b)。如
果NO与超氧化物或者H2O2起反应, 这可能潜
在地清除超氧化物或者H2O2信号。超氧化物
和NO自由基, 或者H2O2和NO+之间的反应产
物是过氧化亚硝酸离子, 本身是一种具有活性
的破坏性化合物。NO也能与蛋白质, 特别是
巯基起反应 (Neill et al., 2003)。
图 2 NO的信号转导
MAPKs. 分裂素活化的蛋白激酶
Fig. 2 NO signaling transduction
MAPKs. Mitogen activated protein kinase (Neill et al., 2003)
—— 已确定的途径 Confirmed pathway
------ 可能的途径 Supposed pathway
7332005 程红焱等: 植物一氧化氮生物学的研究进展
NO是一种可扩散的简单小分子, 因此, 不
可能存在NO的专一性受体。然而, 植物细胞
确实能感受 NO, 且许多细胞活性被 NO 调
节。已知NO具备与多种靶分子反应的能力,
所以可能有几种细胞内“NO感受器”。到目
前为止, 有关植物NO信号转导途径的知识还
知之甚少, 动物细胞NO信号的研究进展已大
大促进了该领域的研究。Wendehenne 等
(2001) 比较研究了哺乳动物和植物系统中的
NO信号, 尽管在哺乳动物细胞中有不依赖环
鸟苷酸 (cyclic guanosine monophosphate,
cGMP) 的途径, 但 NO 的细胞内信号包括
cGMP和环腺苷二磷酸核糖 (cyclic ADP-ribose)
的产生以及细胞质 Ca2+ 浓度的增加。图 2描
述了植物细胞中可能的 NO信号转导途径。
6 结语
NO作为一种信号分子, 调节植物生长发
育的各个方面。近年来, 关于NO在植物中的
作用和信号转导机制的研究迅速增加, 已经确
认NO是内源代谢物, 但NO的生物合成还不
完全清楚。NO可以通过NR从亚硝酸盐合成,
也可以通过 NOS、XOR和非酶促途径合成,
但类似于哺乳动物的NOS至今还没有在植物
中证实; 这些途径在NO合成中的份额, 以及
对不同逆境因子的响应也不清楚。因此, NO
生物合成酶及其编码基因的鉴定和随后的转
基因操作应作为研究重点。
在植物中, NO能够诱导 PCD、气孔关
闭、种子萌发和根的生长等不同的生理过
程。在细胞内 NO以几种不同的氧化还原形
式存在, 每种形式都能激活专一的细胞事件, 以
及不同的NO供体产生不同形式的NO。利用
不同的NO供体, 确定不同形式的NO及其所
激活的专一细胞事件也是非常重要的。
细胞内对 NO 反应的信号包括 cGMP、
cADPR和细胞质Ca2+浓度的增加, 但在许多
情况下, 这些反应的精确的生物化学和细胞生
物学本质还不清楚 (Neill et al., 2003)。需要
鉴定和定量植物细胞中的cGMP和cADPR, 克
隆合成或降解 cGMP和 cADPR需要的基因。
同样, 被NO活化或抑制的蛋白激酶和蛋白磷
酸酶、转录因子、离子通道以及其他信号蛋
白也需要鉴定和描述。
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