全 文 ：植物细胞培养生产重组蛋白
张晓勇1 王海林1 高向阳1* 林壁润2 徐凤彩1
( 1华南农业大学生命科学院,广州 510642; 2广东省农业科学院植保所,广州 510640)
摘 要: 用植物细胞培养生产重组蛋白, 集合了微生物发酵的快速性、动物细胞培养产物的多样性和完整植
株培养系统的安全性,近年来引起了广泛的关注。虽然还未有用植物细胞培养来进行重组蛋白的商业生产 ,但是
它的生产原则较规范,下游处理过程较简单, 具有潜在商业生产的可行性。
关键词: 植物细胞培养 重组蛋白 宿主细胞 基因逃逸
Producing Recombinant Proteins with Plant Cell Cultures
Zhang Xiaoyong
1 Wang Hailin1 Gao Xiangyang 1* Lin Birun2 Xu Fengcai1
( 1 C ol le ge of L i f e Sc ienc e, S ou th China Ag ri cu ltural Univ er si t y , G uang zh ou 510642;
2 P lant Pr otec tion Re search I nsti tu te , Guangd ong Academy of A g ri cul tr al S ci ence , Guang z hou 510640)
Abstract: It has received a gr eat deal of attent ion r ecently to pr oducing r ecombinant pr oteins w ith plant cell
cultur es, which combines t he speed of microbial cell cultur es with producto rs diversification o f animal cell cultures
and safet y of who le-plant sy st ems. A lthough no r ecombinant pr oteins have yet been produced commer ically using
plant cell cultur es, such production sy stems w it h no rmativ e producing principles and easily dow nstr esm processing
are potentially commerical feasibilit y.
Key words: Plant cell cultures Recombinant pr oteins H ost cell Gene dr ift
植物细胞培养的历史起源于 20 世纪初, 30 年
代迅速发展, 它包括植物器官、组织、细胞、原生质
体、胚以及植株的培养。植物细胞培养的应用主要
有以下三个方面,即用于有用物质的生产、快速繁殖
以及植物细胞遗传、生理、生化和病毒方面的研究。
而植物细胞培养技术应用于重组蛋白的研究却是在
最近 20多年来才发展起来的。自从 1990年 [ 1]第一
个重组蛋白在植物细胞培养合成以来, 已有 20多种
重组蛋白在植物细胞培养中得以生产, 它们包括抗
体、酶、激素、生长因子和细胞分裂素[ 2]。
1 植物细胞培养的优势
植物细胞培养作为重组蛋白的生产系统, 集合
了微生物发酵、动物细胞培养和完整植株培养系统
的很多优点 [ 3]。植物悬浮细胞既能像微生物一样能
在简单的培养基中较快地生长, 培养基不需要做特
殊处理,不需要太昂贵的生产设备;也能像动物细胞
培养一样合成较复杂的多聚体蛋白和糖蛋白,如免
疫球蛋白和白细胞介素,而且不携带人类病原菌,不
产生内毒素;它还能像完整植物培养系统一样进行
转入后的修饰、翻译后的糖基化。Gomord 等人[ 4]
在 2004年报道: 用植物细胞培养合成的重组人体
糖蛋白相对于用酵母、细菌和丝状真菌合成的重组
人体糖蛋白具有同天然人体糖蛋白更大的相似性。
与田间完整植株培养不一样,植物细胞培养生产重
组蛋白不受气候、土壤质量、季节、除草剂和杀虫剂
等因素的影响。更重要的是它具有较简单易行的产
物分离纯化过程, 特别是当目的重组蛋白能分泌于
悬浮细胞培养液中时。所有的这些优势是整个生产
过程的 GMP标准化的前提条件。
2 生产原则
2. 1 宿主细胞的选择
植物细胞培养的方法主要包括发根、茎瘤状物、
收稿日期: 2005-06-10
作者简介:张晓勇( 1978- ) ,男,硕士研究生,主修生化与分子生物学专业, E-m ail : 1978zxy@ 163. com
通讯作者:高向阳( 1966- ) ,女,副教授, 020-85281283, E-m ail : gaoxy@ 126. com
生物技术通报
技术与方法 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2005年第 6期
固定细胞和悬浮细胞的培养, 其中悬浮细胞较容易
地用生物反应器来进行 GMP 生产。悬浮细胞的选
择,也就是宿主细胞的取材主要来自于拟南芥[ 5] 、紫
杉[ 6]、烟草、紫花苜蓿、水稻、番茄和大豆等。烟草细
胞株 BY-2和 NT-1是应用最为广泛,因为它们的细
胞易于转化和繁殖, 有较好的生长特性。但是近来
的研究 [ 7~ 10]表明:水稻、番茄和大豆细胞株是比烟草
细胞株更为合适的宿主细胞,因为水稻、番茄和大豆
本身可以食用, 可调控性好, 表达水平较高, 能有效
地分泌蛋白, 而且蛋白含量较高。植物悬浮细胞可
由摇瓶培养愈伤组织或发酵形成单细胞和细胞聚集
体而得到。愈伤组织不同于在土壤种植中的培养
株,因为培养株包含有不同状态的细胞和组织结构,
而愈伤组织只具有一种未分化的单一细胞。如果用
转基因植物作为悬浮细胞培养的材料, 那么就没必
要再对培养的悬浮细胞进行基因调控。如果用的是
非转基因植物作为愈伤组织的材料, 那么就得把重
组的质粒转入到植物细胞中, 再对植物细胞进行筛
选确定重组好的细胞株, 最后进行悬浮细胞的培养。
2. 2 重组蛋白的构建
除了宿主细胞的选择外, 重组蛋白的构建也相
当重要,它是决定重组蛋白产量的重要因素。构建
的原则主要有以下两点: 一是启动子的有效选择,它
通过决定转录水平的高低来影响重组蛋白的产量。
用得较多的组成型启动子是花椰菜花叶病毒
( CaMV) 35s的启动子及其高级启动子和( ocs) 3mas
混合启动子;用得较多的诱导型启动子是 -淀粉酶
Ramy3D的启动子。二是前导肽的构建, 前导肽的
有无或构建的好坏直接影响到重组蛋白的分泌途
径。植物和非植物的前导肽都可适用, 有些人体分
泌蛋白用它们的内源前导肽已经在植物细胞中获得
表达[ 10] 。分子量不到 30kDa 的蛋白质一般分泌在
植物悬浮细胞培养液中, 而更大分子量的蛋白质则
留在细胞内。另外, 蛋白质的电荷性和亲水性也是
决定蛋白质是否分泌于植物细胞培养液中的重要因
素, 如分子量较大的抗体也是分泌在植物悬浮细胞
培养液中的。
2. 3 植物悬浮细胞培养速率和摄氧速率
植物悬浮细胞的生长速率为 0. 019/ h~ 0. 028/
h, 微生物细胞培养的生长速率为 0. 1/ h~ 1/ h, 虽然
它们的生长速率相差较大 [ 11] ,生长曲线也不一样,但
是植物悬浮细胞的培养原则仍也可参照微生物发酵
的原则。Nagata 等人 [ 12] 在 1992 年报道, 烟草细胞
株BY-2的悬浮细胞培养生长速率为 0. 044/ h , 并且
尼古丁含量很低的。另外, 植物细胞培养的摄氧速
率也较低,为 1~ 3. 5mmol/ l h, 而细菌的摄氧速率
为 5~ 90mmo l/ l h, 尽管它们的摄氧速率相差较
大, 但传统的发酵策略经过一定的修整仍可应用于
植物悬浮细胞的培养并能获得预期的效果。
3 下游过程和重组蛋白产量的提升
3. 1 重组蛋白的分离纯化
下游过程是每种生物制品生产过程不可或缺的
组成部分,也是提高重组蛋白产率的主要部分,其主
要过程是重组蛋白从培养液中或悬浮细胞中的分离
与纯化过程。用在该过程的资金占整个生产过程资
金的 80%以上。尽管针对于每一种重组蛋白都需要
一种特定的分离纯化过程,但仍有一些共同的分离
纯化标准和步骤。如用于临床的重组蛋白需要的要
求最高,它的整个分离纯化过程必须达到生物医药
产物系统的标准, 包括质量安全和质量控制等严格
的规则。对于一般用处的重组蛋白, 其分离纯化的
可以用如下的方法处理。
如果重组蛋白是分泌蛋白, 它的活性和稳定性
一般在植物悬浮细胞生长的指数期达到最高, 确定
了植物细胞的生长曲线就可很容易获取分离的最佳
时机。分离后的下一步就是运用层析技术纯化所需
要的目的蛋白。该过程的粗产物体积较大, 如果能
尽可能地浓缩和选择有效的吸附材料, 那么用层析
技术来纯化目的蛋白的前景就会更大。
如果重组蛋白是胞内蛋白, 它们的分离过程与
从转基因植物中分离目的蛋白的过程很相似。先是
通过过滤得到悬浮细胞, 并进行细胞壁、细胞膜的破
碎。其主要的方法有湿样研磨、超声波处理和高压
均质化和酶处理法。因为植物悬浮细胞是生长一致
的单细胞, 比起植物组织, 悬浮细胞的破碎更会有
效。接着是抽提,尽管这一步要除去一些细胞碎片,
但它的优势在于起始材料的体积很小, 目的蛋白的
浓度较大。第三步是应用层析技术对目的蛋白进行
更进一步的纯化。
44 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2005年第 6期
3. 2 重组蛋白产量的提升
用植物细胞培养生产重组蛋白, 其产率的范围
变化很大,表示方法也不很一致。用重组蛋白占培
养液中可溶性蛋白的比率表示, 其范围在 0. 0064%
~ 4%之间;用单位体积培养液中含重组蛋白的质量
表示,其范围在 0. 5g/ L~ 200mg/ L 之间[ 12] 。在很
多情况下, 重组蛋白的产量与重组蛋白是否分泌于
植物细胞培养液或是否很容易分离纯化密切相关。
植物细胞培养液中的杂蛋白较少, 便于重组蛋白的
分离; 而且培养的植物细胞从培养液的分离过程比
微生物从其发酵液中分离的过程简单得多了,一般
只需要通过直接的过滤即可得到。2001 年, Huang
等人[ 10] 用 -淀粉酶 Ramy3D 的可诱导型启动子在
水稻细胞内表达重组蛋白 -1 抗胰蛋白, 重组蛋白
含量达到了 200mg/ L ; 2002 年, Sm ith 等人 [ 13] 用
( ocs) 3mas启动子在大豆细胞内表达 HbsAg, 重组
蛋白的含量达到了 22mg/ L ; 2003年, Kw an等人[ 14]
用高级 CaMV 35s启动子在烟草细胞内表达 IL-12,
重组蛋白的含量达到了了 800g / L。2004年, Yano
等人[ 15] 用 CaMV 35s 的启动子在烟草细胞株 BY-2
内表达 HbsAg 的单克隆抗体,其重组蛋白的含量达
到了 15 mg/ L。重组蛋白产量的提高还可以通过优
化培养条件或培养液的组成来实现。应用于微生物
发酵的主要策略都可应用植物细胞培养, 如间歇发
酵、补料分批培养、罐流培养等。随着基因工程和蛋
白质下游技术的迅速发展和研究的不断深入,重组
蛋白的产量将会逐步得到提升。
4 有待解决的问题
4. 1 重组蛋白在生产中的稳定性
重组蛋白在植物细胞培养生产过程中的稳定性
是科研工作者面临的一个巨大挑战。虽然有很多宿
主细胞用来作为表达重组蛋白已经有很多年的历
史,但至今为止,还没有建立起宿主细胞株的特性库
以达到 GMP 生产的要求。细胞株特性库的建立是
工业生产不可缺少的要素,因为它限定了生产的起
始材料和生产过程的具体路线, 并决定了重组蛋白
是否能达到稳定性和一致性。另外, 重组蛋白在悬
浮培养液中很容易分解。2002 年, Do ran等人[ 16] 报
道,纯化的重组鼠蛋白 IgG 1加入到无菌的 MS培养
基中,在 2h内该蛋白有 80%分解掉了。主要的原因
是重组蛋白被水解、聚集和一些未知的因素。
4. 2 外源基因的逃逸
稳定整合在植物基因组中的外源 DNA 将与植
物基因组 DNA 一起参与几乎所有的遗传学行为,因
此,这些外源 DNA 不仅仅存在于该转基因植物的后
代, 也有可能随该植物细胞培养过程中向环境中漂
移或者引起基因的沉默 [ 17]。外源基因漂移或沉默
后,目的重组蛋白的产量就下降了。
5 结束语
随着基因工程和蛋白质下游技术的迅速发展,
用植物细胞培养来进行重组蛋白的商业化生产是很
多科研工作者近年来研究的热点。但如何建立起宿
主细胞的特性库以达到 GMP 生产材料的要求;如何
更快速有效地分离纯化目的重组蛋白; 如何解决植
物细胞培养过程中由基因漂移或者基因沉默带来产
物的不稳定性等问题, 仍是我们面临的挑战。这些
问题的顺利解决, 将会加快用植物细胞培养生产重
组蛋白的商业化进程。
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