全 文 ： 生物技术通报
技术与方法 BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2006年第 2期
包涵体蛋白的层析复性技术研究进展
高飞1 范清林2 邹文艺2 宋礼华3*
( 1安徽大学生命科学院,合肥 230039; 2安徽安科生物工程股份有限公司,合肥 230088 ; 3安徽省生物研究所,合肥 230088)
摘 要: 包涵体蛋白的复性是生物工程下游技术中的一个重要难题。层析法用于蛋白质复性是一种较新
的、适用于大多数蛋白的方法。其原理是将层析技术应用于蛋白质复性和纯化, 使变性蛋白质在层析柱上重折叠
为正确的空间构象,在洗脱的同时实现部分纯化。本文详细介绍了蛋白质在 5 种层析柱上的复性方法、原理、应用
及研究的新进展,为层析法对蛋白质复性的进一步应用提供依据。
关键词: 包涵体 蛋白质复性 层析复性 重折叠
Progress in Renaturation of Inclusion Body Proteinsby
Chromatographic Procedures
Gao Fei
1 Fan Qinglin2 Zou Wenyi2 Song Lihua3*
( 1 School of li f e sci ence , A nhui Univ ersi t y , H e f ei 230039, China;
2 A nke biote chnolog y Co. , L T D, H ef ei 230088, China ;
3 Biology Inst i tut e of Anhu i Pr ovince , H ef ei 230088 )
Abstract: Inclusion body protein r enatur ation is a impor tant pro cedure in the bio technolog y. P ro tein r efolding
by chromato gr aphy is a new and universal technolog y. The unfolded protein cor rectly refo lded to the nativ e confo r-
mation through the column, and was partly pur ified dur ing t he elution pro cess. The method, pr inciple, recent de-
velopment for renatur ation of pr oteins by fiv e kinds of chr omatog r aphy, hydr ophobic inter act ion chr omatog raphy,
ion exchange chromatog raphy, size exclusion chromatog raphy, affinit y chromatog raphy and expanded bed adsorption
chr omatog raphy w ere intr oduced in details. The new method may be used for r esear ching the renatur ation of pr o-
teins in preparative, ev en in productive scales in industr y.
Key words: Inclusion body Protein renaturation Chromato gr aphy renat ur ation Refo lding
在原核细胞表达外源基因, 尤其是以大肠杆菌
为宿主菌高效表达外源基因时, 表达蛋白常常在细
胞质内聚集,形成包涵体( inclusion body)。以包涵
体形式存在的蛋白质分子不具有正确的天然三维结
构,表达蛋白不具有生物活性,因此需要通过复性操
作以得到具有预期生物活性的蛋白质。目前上市的
重组多肽蛋白药物中, 90%以上以大肠杆菌作为表
达系统,而大肠杆菌表达蛋白有一半形成包涵体。
因此,包涵体蛋白质的复性就成为制约基因工程产
品产业化的关键因素之一, 也是整个包涵体蛋白质
生产过程的关键。
在实验室中少量蛋白需要复性时, 一般采用传
统的稀释和透析复性, 复性时蛋白质初浓度为 10~
100 g / ml或更低,但工业上采用此复性方法需要
很多的容器及大量的复性缓冲液, 同时复性蛋白回
收困难。层析技术不仅是一种得到广泛应用的蛋白
质分离纯化方法, 近年来作为一种新型的蛋白质复
性技术更是日益备受关注。自 1991年耿信笃等首
先提出使用 HIC( Hydrophobic interact ion chroma
tog raphy )作为蛋白质的复性工具[ 1] 以来, 在1994
收稿日期: 2005-12-21
作者简介:高飞( 1982- ) ,女,汉,山东省淄博市人,安徽大学生物化学与分子生物学专业,在读硕士研究生
通讯作者:宋礼华,男,研究员,博士生导师 Songlh@ ankebio. com
年,捷克、日本和美国的科学家分别用 IEC ( Ion ex-
change chromatography ) [ 2] 、AFC ( af f inity chroma-
to graphy ) [ 3] 和 SEC ( size-exclusion chromatogra-
phy)
[ 4]成功地对变性蛋白进行了复性。目前, 用于
蛋白质复性的层析折叠复性法主要有体积排阻复性
( SEC) ,或称凝胶过滤层析复性( g el f iltrat ion chro-
mato graphy GFC)、疏水相互作用层析复性( H IC)、
离子交换层析复性( IEC)、亲和层析复性( AFC)及
新近出现的扩张床吸附复性( expanded bed adsor p-
t ion chromatog raphy EBA)。根据促进复性机制的
不同,可以把层析复性过程分为两种:吸附型层析复
性和凝胶过滤层析复性[ 5]。本文将围绕这两类方法
结合自己的实践经验, 对近年来层析复性技术的发
展作一介绍。
1 吸附型层析复性
离子交换、疏水层析、亲和层析和扩张床层析均
属于吸附层析, 其基本复性原理是柱平衡后, 将变性
蛋白上样并吸附在凝胶介质上, 然后用清洗缓冲液
洗掉未吸附的变性剂和杂蛋白, 最后用复性缓冲液
将吸附的蛋白洗脱下来, 在洗脱过程中完成复性。
1. 1 离子交换层析复性( IEC)
捷克科学家 J. Sut tnar 等首次使用了强阴离子
交换法对 HPV 16E7M S2融合蛋白成功地实现了
复性[ 2] 。由于变性蛋白质与固定相之间所带电荷不
同,使得变性蛋白质吸附于固定相表面,这可以避免
复性过程中蛋白质的聚集作用。在用复性液洗脱的
过程中,变性蛋白质进行吸附-解吸附-再吸附的复
性过程。IEC 含盐的缓冲流动相系统十分类似于蛋
白质稳定存在的生理液条件, 有利于增加其活性回
收率。其固定相基体主要是亲水共聚物。
Hamaker 将 DEAE-纤维素卷成柱状装入层析
柱中,使用等浓度洗脱,对重组白细胞分泌抑制因子
成功的进行了复性和纯化, 与传统的稀释法相比其
蛋白质浓度提高了 6. 4倍,且 46%的蛋白质可以获
得复性, 质量回收率为 96%, 而时间只用了 5 分
钟[ 6]。孙强明等[ 7] 利用 Q Sepharo se H . P. 离子交
换柱在 8 mol/ L 尿素变性条件下对 rhuGM-CSF-
IL-6融合蛋白进行初步纯化, 然后再利用 Sepha-
r ose S-200 分子筛柱层析复性及纯化, 纯度达到
95% ,复性率达到 80%以上。Creighton 等[ 8] 利用
离子交换层析介质作为固定相复性脲变性的蛋白
质,通过梯度改变溶液的成分, 进行蛋白质的复性,
最后把复性的蛋白质洗脱出来。
然而, 有时单纯使用变性浓度梯度不能使蛋白
成功复性。这可能是由于复性中间物或蛋白质聚集
体紧密结合于基质上, 很难从柱上洗脱下来。为防
止未洗脱蛋白的聚集, 在 8 M 尿素存在下样品结合
到离子交换柱上, 尿素浓度递减同时伴随离子强度
的逐渐增加,使蛋白质向柱下端迁移过程中同时发
生结构重排,这种方法使分子间相互作用减少, 避免
形成聚集体,促使蛋白质向一个天然的,有生物活性
的形式转变。
1. 2 疏水相互作用层析复性( H IC)
这是基于蛋白质与介质的疏水性相互结合,实
现蛋白质与极性变性剂的分离而促使蛋白质复性的
方法。当变性蛋白质、变性剂和杂蛋白进入疏水层
析柱后,变性蛋白质被固定相吸附的同时除去以水
合状态附着在蛋白质表面和固定相表面接触区域的
水分子,使水化的变性蛋白质瞬间失水,并形成局部
疏水环境以利于蛋白质分子形成疏水核, 并从疏水
核开始折叠。随着流动相的不断变化, 变性蛋白质
逐渐被复性, 最后被洗脱液洗脱下来。一些结合力
强的修饰试剂添加到复性缓冲液中可降低疏水相互
作用并促进复性。添加剂可对天然的、变性的或处
于中间态的蛋白质的溶解性和稳定性产生影响。与
其他的层析复性法相比, 疏水层析的固定相促进变
性蛋白质疏水核心的形成,所以疏水层析比其他层
析法更利于复性, 并获得较高的活性回收率。
耿信笃等首次用 HIC 对重组人干扰素-
( r hIFN-) 和 rhIFN-分别在复性的同时进行了纯
化[ 1 ] ,并对其复性机理进行了详细论述。r hIFN-
的 Gu-HCl提取液在 40min内使用一次层析过程就
可以使其纯度达到 85 % ,活性回收率为稀释法的 2-
3倍。郭立安将 rhIFN-的 Gu-HCl提取液进行复
性,一步就可以达到 30%以上的纯度 [ 9]。1997年,
美国 Du-Pout-M erck 药业公司将 HIC 用于多个
HIV 蛋白酶突变体的复性和纯化[ 10] 。关怡新等首
次在疏水层析中使用等尿素梯度和线性尿素梯度对
rhIFN-包涵体进行复性, 其蛋白活性收率比稀释
复性提高 6. 5倍[ 11] 。
572006年第 2期 高飞等:包涵体蛋白的层析复性技术研究进展
1. 3 亲和层析复性( AFC)
AFC 是利用固定相中的配体与目标蛋白质之
间特异性的吸附作用, 使得目标蛋白质可以保留在
固定相中,蛋白与变性剂分离,而后在洗脱过程中进
行复性。依其 AFC柱端基的不同, 可将其分为: 固
定化金属亲和层析、分子伴侣亲和层析和脂质体亲
和层析。由于配体与目标蛋白质间的作用特异性
强,而且不同配体与蛋白质间的作用差别较大,所以
AFC 作为蛋白质复性的机理比较复杂。
1. 3. 1 固定化金属离子鳌和层析 金属鳌合层析
复性主要是针对具有 Hist ine tag 的基因工程蛋白
质。目前最常用的亲和层析复性柱为: N i2+ 亲和层
析柱。这种固定化金属亲和层析柱的端基可以与未
端标记有组氨酸的蛋白质分子有特异的亲合作用,
蛋白被结合在色谱柱上, 避免了分子间的疏水作用,
具有分子伴侣的功能。多聚 His 标签与固定化的
二价金属离子甚至在高浓度变性剂存在下, 仍可形
成高亲和力复合物, 利于标签蛋白的分离和复性。
Rog l[ 12]将两种在大肠杆菌包涵体中构建表达的膜
蛋白 T oc75及 LHC2通过标记的组氨酸用金属鳌
合的层析柱一步实现了分离纯化与复性。Sm ith 等
通过 Ni亲合层析柱上复性办法, 从 1L 的培养基里
能获得 15mg 的丙酮二酸/ 苹果酸转运蛋白, 从而
有足够的蛋白来进行结晶实验 [ 13]。
1. 3. 2 分子伴侣亲和层析 分子伴侣亲和层析介
导蛋白质的复性同它在溶液中的作用一致, 与 HIC
有相似性之处。分子伴侣在复性蛋白质时, 为变性
的蛋白质提供一个疏水性的中空环状疏水腔, 当变
性蛋白质进入空腔后, 可部分避免或完全消除变性
蛋白质分子间的相互聚集作用, 使蛋白质在疏水环
境下进行结合 释放 再结合的循环过程, 直到
其恢复到天然的构象状态。一些分子伴侣如: Gro-
EL 和 Gr oES对复性的促进作用也与亲和作用复性
相类似。将分子伴侣固定化在凝胶介质上避免了在
溶液中直接添加分子伴侣所产生的后期纯化问题和
无法回收所带来的高成本。孙彦等人将固定化的
Gr oEL 柱子用于溶菌酶的复性中[ 14] , 收到较好效
果。Altam irano 等[ 15] 将分子伴侣/ DSBA/ PPI-琼脂
糖键合到填料上,合成了一种三组分的亲和层析介
质,将其用于还原变性的蝎子毒素 Cn5的复性, 其
质量回收率为 87% ,活性回收率达到 100%。
1. 3. 3 脂质体亲和层析 根据脂质体可以帮助溶
液中的蛋白质复性的特点,可以将脂质体作为配体
共价结合到层析介质上。脂质体可作为一种双水相
系统,有人工分子伴侣的功能。它对不同浓度变性
剂变性的具有不同分子构象的蛋白有高度的选择
性,而不同分子构象的蛋白在柱子上的存留与局部
疏水性( local hydrophobicity )相关。在蛋白复性过
程中,脂质体层析柱能够键合蛋白折叠中间体, 抑制
其发生分子间的聚集反应, 从而提高活性产量。
Yoshimoto
[ 16]用固定化脂质体层析柱( Immobilized
liposome chromatography )对碳酸醉酶、溶菌酶和核
糖核酸酶 A 的复性进行了研究, 取得了较好的效
果。
1. 4 扩张床吸附复性( EBA)
扩张床吸附复性是新出现的复性方法。英国剑
桥大学的 Chase 等[ 17] 在研究流化床吸附( FBA)的
基础上,发展了能在床层膨松状态下实现平推流的
扩张床吸附技术。该技术是利用扩张床吸附层析直
接从细菌裂解变性液中捕获并复性目标蛋白。其过
程是将细菌破碎液直接加入高浓度的变性剂,然后
上样到扩张好的柱床上,在上样过程中,细胞碎片和
不吸附的杂质流穿掉, 而变性蛋白被吸附在凝胶上,
然后用含变性剂的缓冲液清洗掉剩余杂质,再用不
含变性剂的缓冲液洗掉变性剂, 将扩张床沉降后,用
洗脱缓冲液将目标蛋白洗脱下来,而通过吸附、清洗
和洗脱的过程,变性蛋白得以复性并获得初步纯化,
这一技术节省了细菌破碎液的澄清过程, 将澄清、捕
获、纯化、复性结合为一体,是很有潜力的纯化和复
性技术。
Lee等利用此技术将 rhGH-GST 和 rhIFN --
2a 直接从细菌破碎液中提取出来并得以复性 [ 18] ,变
性的 rhGH-GST 包涵体蛋白被吸附到 ST REAM-
LINE DEAE 树脂上, 随着上样量的提高,复性得率
在下降。降低上样量不但可以提高复性率,也可以
提高产品纯度。
2 凝胶过滤层析复性
凝胶过滤层析复性又称体积排阻复性( SEC) ,
是一种广泛应用的层析技术。1994年,美国科学家
M . H . Werner等首次实现了用 SEC对 E. co li inte-
58 生物技术通报 Biotechnology Bullet in 2006年第 2期
g rat ion ho st facto r, Rnase A, rhETS-1 和 Rho-
danese 的复性 [ 4]。与常用的稀释复性法相比, 凝胶
过滤层析复性能在高的起始蛋白浓度下对蛋白进行
复性,活性回收率较高,同时又能使目标蛋白得到一
定程度的纯化。
凝胶过滤复性时,除了蛋白质在胶粒中的传质
和扩散外,蛋白质与介质之间并不发生其它任何作
用。复性过程始终发生在溶液中。蛋白质在伸展状
态中,每个蛋白质分子的伸展状态都会有差别,而不
同伸展状态的蛋白质分子在凝胶颗粒内部扩散所受
到的限制也不相同, 有的会扩散入颗粒内部深一些,
有的会浅一些, 这使不同伸展状态的蛋白质分子达
到一定程度的分离,这样蛋白质分子间相互作用的
机会就大大减少,从而起到一定抑制凝集的作用; 即
使发生了部分凝集, 凝集的蛋白质会附着在胶粒上,
而不随着溶液向下运动, 这样后面的变性剂可以赶
上凝集的蛋白质,使其重新溶解并变性;并且在凝胶
过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢,这对有些蛋白
质的复性是有利的。
在普通凝胶过滤中, 变性剂和还原剂的脱除虽
较稀释复性慢, 但变性蛋白质仍会经历变性剂浓度
突然变化的过程。为了克服这一缺陷, 谷振宇等人
实现了脲梯度凝胶过滤复性, 获得了很好的效
果[ 19]。脲梯度复性是样品上柱前用复性缓冲液平
衡柱子,接着使变性剂浓度递减(如从 6M 盐酸胍或
8M 尿素下降到复性缓冲液中预先确定的变性剂的
浓度)。此法为蛋白质复性提供了一个较温和的环
境,实现了线性去除变性剂,对高浓度变性蛋白质的
复性效果十分显著。对初始浓度为 17mg/ m l的还
原变性溶菌酶, 在 40m in内可以得到高达 90%的活
性回收率。此外他们在脲梯度 SEC 的基础上发展
了 pH 和脲浓度双梯度 SEC法用于蛋白复性, 效果
很好。
Schleg l等 [ 20]在 SEC复性的基础上设计了一种
连续基质辅助蛋白复性系统, 该系统能使变性蛋白
定量地转换成复性的天然态蛋白。此复性方法能够
将复性过程中产生的蛋白聚集体再次复性, 使蛋白
最大程度地得到回收。Liu等 [ 21]提出的伴侣溶剂塞
( Chaper on so lvent plug) SEC 复性法在一定程度上
解决了变性蛋白进入柱顶端之前发生沉淀这一问
题。此外,抗体、小分子添加剂如 L-精氨酸和环糊
精等共价结合到 SEC 固定相上也可能会提高某些
蛋白的复性效率, 同时又能使这些物质得以重复利
用,降低生产成本。
3 小结与展望
以上几种层析法的共同之处是可以通过线性洗
脱使变性剂的浓度逐渐降低,复性条件比较温和,层
析介质的隔离,降低了蛋白相互作用产生的聚集,可
同时实现蛋白的复性和纯化, 耗时少。虽然层析复
性技术与常规的复性方法相比具有较高的复性率,
但由于复性过程中变性蛋白质分子间的聚集所形成
的沉淀会引起层析柱反压增高, 柱子易报废。Chu
等采用扩张床吸附技术, 使这一问题得到了较好的
解决[ 22] , 但目前这一技术只能应用于离子交换层析
复性。
蛋白质层析折叠复性是一种处于发展阶段的方
法,不仅需要从理论方面对复性的机理进行深入研
究,而且应该关注合成高性能 (对蛋白质复性和分
离效果好 )价格比的层析介质的研究。无论如何,
层析方法在蛋白质复性方面已发挥着越来越大的作
用,尤其是操作简单的 SEC 复性蛋白质技术, 已被
许多厂家大规模地应用于工业化生产。蛋白质折叠
和聚集的机制尚不十分清楚,每种蛋白质都有自己
特有的折叠方式和途径, 因此对某种蛋白质的复性
必须进行反复试验, 利用折叠和聚集的知识建立相
对优化、适合生产规模的方法。
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592006年第 2期 高飞等:包涵体蛋白的层析复性技术研究进展
病人血清里蛋白质的图谱, 通过对质谱仪的训练
之后,它就能够根据人体血清中的特异变化, 灵敏地
辨别出测试的对象是否感染了 SARS 病毒。这种
检测方法经北京天坛医院临床检测, 阳性率接近
95% ,特异性将近 96%, 能在病人发烧的第一天即
可以得出满意的检测结果。只需要一滴血, 将采集
到的病人血样现场直接放到 9mol 浓度的尿素里,
病毒可以迅速溶解灭活, 这样在一般医院的化验室
里即可实现安全操作, 从而防止交叉感染。有专家
称蛋白质指纹图谱技术标志着一种划时代的诊断模
式的诞生。
8 结论与展望
综上所述, 病原的检测方法多种多样,各种方法
都有其优缺点, 为了弥补各自的不足,进一步提高灵
敏度和特异性, 可以采用多种方法联合使用的策略。
选择检测方法应考虑到自身所拥有的条件, 检测所
要求达到的灵敏度,而提高灵敏度和去除假阳性是
检测方法发展的趋势。
近年来,随着计算机技术的不断发展,临床病原
菌检测将向着高度自动化和开发简便的快速检测技
术两个方向发展。分子生物学技术通过自动化仪器
的使用,将在病原菌诊断、鉴定和耐药基因检测方面
逐步应用于临床。生物芯片技术的发展和应用, 最
终将彻底改变临床病原菌检验的现状和传统观念,
实现高效、高质和廉价的统一。随着各学科的交叉
发展,会出现越来越多的新的检测技术。
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