全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第 19卷 第 3期
2007年 6月
Vol. 19, No. 3
Jun., 2007
收稿日期：2007-03-01
基金项目：国家自然科学基金项目(20675083)
作者简介：张维冰(196 4 －)，男，博士，教授；张玉奎( 1 9 4 2 －)，男，研究员，博士生导师，中国科学院院士，
*通讯作者，E-mail: ykzhang@dicp.ac.cn
文章编号 ：1004-0374(2007)03-0281-08
蛋白质组研究中分离新技术与新方法
张维冰，张丽华，张玉奎*
(中国科学院大连化学物理研究所，大连 116023)
摘　要：对于蛋白质组的研究离不开分析技术的支撑。由于样品及其基质的复杂性，为了实现蛋白质
的高通量、高灵敏度、快速分析鉴定，必须发展与之匹配的新技术与新方法。多维高效液相色谱 / 毛
细管电泳技术，部分弥补了传统 2D PAGE的不足，近年来，在蛋白质分离鉴定方面取得了最令人瞩
目的成绩。本文分别从多维液相色谱分离技术、多维毛细管电泳蛋白质分离平台、微柱液相 - 毛细管
电泳联用技术、极端 pH蛋白质的分离分析和蛋白质的在线富集技术等方面对蛋白质组学研究中在新技
术与新方法方面近期取得的成果加以系统阐述。
关键词：蛋白质组；多维分离；高效液相色谱；毛细管电泳
中图分类号：Q503; Q816　　文献标识码：A
New technology and method for proteomics research
ZHANG Weibing, ZHANG Lihua, ZHANG Yukui*
(Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China)
Abstract: There is indispensable analysis technology for proteomics research. Because of the complexity of
sample and matrix, for high throughput, high sensitivity and rapid identification in proteomics research, we need
develop new technology and method to match this demand. Multidimensional HPLC/CE technology, partly
supply the limitation of traditional 2D PAGE. Recently, they gained notable achievements in protein separation
and identification. In this paper, we comprehensively elaborate the achievements from new technology and
method for proteomics research as follows: Multi-dimensional HPLC; Multi-dimensional CE; mHPLC-CE; ex-
treme PH protein analysis and on-line protein concentration technology.
Key words: proteomics; multi- dimension; HPLC; capillary electrophoresis
随着人类基因组计划的完成，人类的全基因草
图已成为人们进一步揭示人体奥秘的新起点。在基
因序列测定技术、蛋白质分离技术、质谱技术以及
生物信息学日益发展和完善的基础上，蛋白质的电
泳和色谱分离、质谱鉴定以及DNA和蛋白质序列数
据库检索已经发展成为一种较为可靠的蛋白质分析
方法，理论上，人们已经具有了研究人体内所有蛋
白质的可能。
对于蛋白质组的研究离不开分析技术的支撑。
在最初的研究中，采用的主要分离技术是二维聚丙
烯酰胺凝胶电泳(2D PAGE)。迄今为止，2D-PAGE
凭借无法比拟的高分辨率而在蛋白质组研究中仍占据
着重要地位。同时它也分离检测低丰度蛋白、极端
酸碱性蛋白、疏水蛋白等方面存在一些难以克服的
282 生命科学 第19卷
缺陷。近年来，多维高 - 效液相色谱 /毛细管电泳
技术的应用部分弥补了 2D PAGE的不足，在蛋白质
分离鉴定方面取得了最令人瞩目的成绩[1]。对蛋白质
序列和结构的鉴定是蛋白质组学研究中的一大难点。
质谱仪在技术上的创新降低了蛋白质鉴定的难度[2-3]。
目前，通过串联质谱与计算机分析的方法已经能够
从一条单一的肽序列通常就能够识别出一种蛋白质。
尽管蛋白质组研究分析技术与手段已经得到较
大发展，然而由于样品及其基质的复杂性，要实现
蛋白质的高通量、高灵敏度、快速分析鉴定，仍
有诸多问题有待解决。本文将对我们课题组近年来
在蛋白质组学研究中分析新技术与新方法方面的成
果加以系统阐述。
1　多维液相色谱分离技术
现代色谱法已成为分析化学中复杂体系组分分
离和分析的强有力工具。对于复杂样品的分离，使
用一种分离模式往往不能提供足够的分辨率；而组
合不同的分离模式构建多维系统是解决这一问题的
有效途径。自 1984年Giddings[4]提出多维分离的概
念以来，随着控制和微加工技术的发展，多维分离
技术得到较快的发展，并已在生命科学、环境科
学、聚合物科学等诸多领域得到应用[5-6]。
根据正交分离的机理[4-6]，可用于构建二维液
相色谱的模式包括高效液相色谱、电色谱、电泳等
模式，其中前者有反相色谱(RP)、正相色谱(NP)、
体积排阻色谱(SEC)、亲和色谱(AC)、离子交换色
谱(IEC)等；后两者有毛细管电色谱(CEC)、等电聚
焦(CIEF)、胶束电动色谱(MEKC)、毛细管区带电
泳(CZE)、凝胶电泳(GE)等。对于不同分离模式的
组合，不仅要考虑色谱模式之间的匹配，如流动相
匹配、流量匹配等，还要考虑色谱分离选择性、分
辨率、峰容量、柱容量、分析速度等因素。对于
生物样品的分离，样品回收率、活性等因素也可能
非常重要。在实际二维分离系统的构建过程中，必
须综合考虑这些因素的影响，选择合理的分离模式
和柱系统。
多维液相色谱实现的关键技术是样品在两种分
离模式之间的转换。二维液相色谱大多使用两支或
更多支色谱柱，通过一定的切换接口实现样品的柱
间转移。切换中根据切割组分是否全部进入第二维
中，二维系统分为部分和整体切换两种模式。二维
液相色谱系统主要由进样系统、分离系统、接口切
换系统、分流及馏分收集系统、检测系统以及软件
控制系统等六大部分组成，如图 1所示。在近年蛋
白质组研究的二维液相色谱中，基于不同色谱模式
分离机理的特性，SEC常用于样品的预处理，AC
较多用于同位素亲和标记技术(ICAT)中特定组分的
分离，而常用的是 IEC、RP模式之间的偶联组合，
如 2D SCX/RP、2D WAX/RP等。
Regnier等[7]认为，由于细胞组成的复杂性，针
对全部蛋白质的分离，采用一维电泳或液相色谱的分
离模式不可能达到理想的分离效果。多维液相色谱技
术，因便于组合不同的色谱模式，可以实现对样品
分子尺寸大小差异较大的蛋白质、低丰度的蛋白质以
及疏水性蛋白质等的分析。同时，易与质谱连接，
具有高灵敏度、分析速度快、自动化程度高等优
点。因此，二维液相色谱作为 2D-GE技术的一个重
要补充，在蛋白质组研究中发挥着重要的作用。
图1　二维液相色谱系统组成
283第3期 张维冰，等：蛋白质组研究中分离新技术与新方法
基于不同的分离模式组合以及切换技术，我们
已经构建了多种二维液相色谱系统[8-10]。图 2为利用
自动进样器实现切换构建的全自动简易二维液相色
谱分离平台。图 3是采用图 2的平台分离 5种蛋白
质酶解产物的结果。由该图可见，由自动进样器输
送盐梯度构建的全自动二维分离平台，可以很好地
用于蛋白质酶解产物的分离。
采用这一系统也对人肺癌细胞分泌蛋白质进行
分离鉴定。经二维液相色谱 -电喷雾质谱分离鉴定
所得到的数据用sequest软件搜索并匹配IPI HUMAN
数据库，共鉴定出 263种蛋白质，采用 secretomep
server 2.0和 signal peptide predictor和跨膜序列搜索
数据库对其中部分蛋白进行预测，其中51种蛋白具
有一个信号肽或至少一个跨膜区，可以认为是分泌
蛋白。
2　膜接口二维毛细管电泳蛋白质分离平台
毛细管电泳(CE)技术是一类操作简便、易于实
现自动化的分离方法，是分离和分析蛋白质、多肽
的有力工具。CE的各种模式都已在蛋白质的分离
和分析中得到应用，显示出极高的分离效率。不同
的 CE模式基于不同的原理来处理被分析物质，它
们各具特色并有不同的适应对象。为了发挥不同模
式CE的优势并避免其局限，探索不同CE模式的联
用，构建二维，乃至多维电泳分离系统已经成为分
析复杂生物样品的重要选择。尝试多模式 C E 之
间、或 CE与其他分离方法(如 LC)的联用，并将这
图3　5种蛋白质酶解产物的分离结果
图2　全自动简易二维液相色谱分离平台
样的联用技术应用于蛋白质的分离具有非常重要的
实用价值和广阔的应用前景。
在线二维 CIEF-CGE联用模式的关键技术是接
口的设计和制作，Yang等[11]利用一段中空纤维连接
二维CE构建了在线二维CE分离系统，如图4所示。
中空纤维具有半通透性，允许溶剂和小分子溶质自
由通过，蛋白质则只能在通道中移动，这样既保证
图4　微透析接口
注：1 高聚物板；2 毛细管；3 Tef lon 管；4 中空纤维膜；
5缓冲溶液池
284 生命科学 第19卷
了蛋白质在 2D CE系统中的分离，又可以方便地改
变分离环境，实现不同 CE 模式的联用。
毛细管等电聚焦(CIEF)具有很高的分离效率及
样品浓缩能力，最高浓缩倍数超过 500倍。当在二
维系统中使用长度相当或第二维略短的毛细管时，
这样的压缩区带完全适应 CZE、CGE、MECC及
CEC对进样长度的严格要求，因此，CIEF非常适
合作为 2D CE系统的第一维分离模式，可以大大提
高第二维的检测灵敏度。CIEF基于两性物质的等电
点进行分离，毛细管凝胶电泳(CGE)基于分子量或
尺寸分离化合物，等电聚焦与凝胶电泳同时也是
2D PAGE的基础，二维 CIEF-CGE联用，则相当于
2D PAGE的立体化，具备 CE操作简单、方便、快
速、易于实现自动化的优点。
中空纤维连接的二维 CIEF-CGE系统巧妙地解
决了溶质的输运问题。血红蛋白是一个复杂体系，
据认为可能包含上千个异构体，选择其作为样品考
察二维 CIEF-CGE 联用系统的分离能力，结果在图
5中给出。显然，这种分离系统可以用于蛋白质精
细结构研究。
采用中空纤维膜接口将毛细管连接需要精细的
技术，且死体积依旧无法避免，对细内径毛细管柱
而言，这种死体积对分离的影响可能相当大。刘和
春等[12]设计并制作了一种零死体积的“多孔膜接
口”(图 6)，并用其实现了毛细管等电聚焦(CIEF)与
毛细管区带电泳(CZE)两种分离模式的在线联接。
利用毛细管柱上原位蚀刻而成的多孔膜接口，
构建了毛细管等电聚焦 /毛细管区带电泳二维(2D-
CIEF-CZE)蛋白质分离技术平台。选用肌球蛋白和
血红蛋白的混合物为代表考察多孔膜接口在二维CE
分离系统中的可行性及分离性能。所选的蛋白混合
物包含有多种不同等电点的异构体，这些异构体的
pI主要有 6.8、7.05、7.15、7.2、7.3和 7.5。二
维分离所用的毛细管柱总长为 50 cm，将第一维分
离的组分分成 5段引入到第二维分离柱中，结果在
图 7中给出，整个二维分离在 1h内快速完成。实
验结果证实了多孔膜接口用于构建二维CE联用系统
的可行性，同时也展示以无死体积接口所构建的二
维 CE 分离平台具有较高的柱效和高的分离性能。
与文献报道的构建 2D-CE 系统所使用的接口(如四
通[13]、阀 /环[14]等)相比较，柱上原位蚀刻而成的
多孔玻璃膜接口的最大优点是真正具有额外无死体
积的接口，因而尤其适合于基于毛细管柱的二维及
多维联用系统。
图5　血红蛋白异构体的二维CIEF-CGE谱图
注：图中不同的峰分别对应于不同的异构体
图6　蚀刻后的多孔膜接口厚度和多孔膜表面孔径大小扫描电镜图
285第3期 张维冰，等：蛋白质组研究中分离新技术与新方法
围，其分子总是荷正电并一直向负极泳动，在此情
况下不会发生静态聚焦现象(图 8a)。处于毛细管相
同截面的不同蛋白质分子荷电量不一样，它们将以
不同的速度向负极泳动，其中荷 /质比大的蛋白质
运动速度更快(图 8b)。又因为样品塞前方的 pH 值
比后面高，所以样品塞中尾随粒子比先导粒子带更
多的正电荷，整个样品塞的移动速度是前慢后快，
在移动过程中必然呈现出一种区带压缩的状态，这
导致 PGDE 过程具有具有 IEF的浓缩效应。在向负
极泳动的过程中，两个宽蛋白质区带逐渐被压缩成
窄的区带，如果迁移时间 /距离足够长，两个蛋白
质区带最终会完全分开(图 8c)。两性溶质区带在 pH
梯度中的迁移是一个逐步失去静电荷、淌度不断变
化的一个过程。
图 9是鸡卵清蛋白溶液的 PGDE-CIEF 电泳图，
A和 B 分别是负极迁移和正极迁移的结果。从中可
以看出，当进行负极迁移时，在聚焦完成之前有几
个小峰出现(1－ 3 min)，这是一些等电点较高的碱
3　极端pH蛋白质的分离分析
二维聚丙烯酰胺凝胶电泳采用商品化 CAs或
IPG胶条，在实施等电聚焦的过程中，等电点低于
CAs或者 IPG胶条 pH范围的酸性蛋白质，在聚焦
过程中向正极端移动并最终离开凝胶；而等电点高
于所用pH梯度范围的碱性蛋白质从负极端离开，导
致极端(极高、极低)等电点蛋白质的丢失，使用窄
梯度胶条时尤其如此。即使是宽范围的 CAs或 IPG
胶条，其 pH范围也不能涵盖所有蛋白质的等电点，
因此，在 2D PAGE中，极端等电点蛋白质的丢失
往往难以避免。利用 CIEF作为第一维的 2D CE分
离系统，也有可能发生极端酸(碱)性蛋白质的丢
失；但由于 2D CE的在线特征，使得在聚焦过程
中从接口端离开的蛋白质均可以进入第二维，因此
有可能(部分地)避免极端等电点蛋白质的流失。
Yang等[15]在毛细管内合成具有 pH梯度的连续
床层分离介质(PGDE)，并进行蛋白质的单用分离研
究。图 8考察两种碱性蛋白质在 pH 梯度中的运动
情况的PGDE示意图。当混合样品呈塞状处于pH 梯
度中时，由于蛋白质的等电点高于整个 pH 梯度范
图7　肌球蛋白和血红蛋白混合物2D-CIEF-CZE分离谱图
注：试验条件：CIEF毛细管长度：33cm；CZE 毛细管长
度：17/10cm；CZE运行缓冲溶液：1.0%(v/v)HAc；UV：
280nm
图8　PGDE示意图
图9　PGDE-CIEF应用
注：( A)阳离子迁移；( B )阴离子迁移。进样时间：1 0 sec
286 生命科学 第19卷
性组分。在聚焦进行过程当中，这些碱性组分在pH
梯度中一直荷负电，不能聚焦(停留)在毛细管中的
任何一点，又因为它们本身由不同的组分构成，在
往负极迁移的过程中被压缩成不同的区带，经过检
测窗口时就给出不同谱峰。正极迁移的谱图与负极
迁移相似，但有两点区别：(1)聚焦完成之前未出
现谱峰，说明溶液中不含极端酸性的组分，或者其
含量低于检测限；(2)在聚焦完成后的迁移过程中，
没有出现负极迁移中极端碱性组分的谱峰，说明在
聚焦过程当中造成了组分丢失。极端酸性、碱性的
组分只能在聚焦过程当中，而不是聚焦完成之后进
行检测，通过分别实施正、负极迁移，可以确定
样品中是否含有极酸、碱性组分。
4　在线酶解技术
固定化酶反应器是20世纪70年代开始开展起来
的一种新兴的技术。蛋白酶在进行固定化后，可以
方便地从底物体系中分离，消除酶对样品鉴定的干
扰；同时，可以使蛋白酶的稳定性得到显著提高，
增加蛋白质对有机溶剂和高盐溶液的抵抗能力，在
结合使用合适的固载方法后，能够有效增加蛋白酶
在基质上的固载量，提高酶解反应的速度和效率。
目前，蛋白水解酶反应器主要有颗粒填充反应
器和整体基质反应器两大类。制备颗粒填充反应器
时，一般需要先对颗粒载体表面进行活化和修饰，
再填入反应器中。在填充柱中，液流主要通过填料
之间的空隙，流动相与固定化酶之间的传质过程主
要由扩散速率决定，依赖于填料、孔的大小以及流
速和底物的扩散系数。由于蛋白质分子底物的扩散
系数小，在反应器中的传质效率较低，限制了蛋白
质在反应器中的反应效率。同时，由于填充柱中填
料之间存在大量的空隙，即使使用均匀大小的球
体，也仍然存在较大的空隙，蛋白酶的固载量较
低，所以此类反应器的活性不高。
多孔整体反应器是近年来发展起来的一种新型
的反应器。首先，整体基质可以通过改变优化合成
的条件，同时得到可用于对流的大孔以及用于扩散
的小孔，其孔的直径分布在 700－ 2 000纳米范围
内。在整体基质反应器中，可以允许底物溶液在其
孔内进行对流，传质得到显著提高，适合在较高的
流速下工作，特别是在底物是蛋白质这样扩散系数
小的大分子时，更加适用。在大孔的整体基质固定
化蛋白酶反应器中，较快的传质将使得底物可以较
容易与酶的活性部位接近，可大大提高酶解反应的
速度。其次，使用聚合物整体基质作为蛋白酶的载
体，具有渗透性好、溶质在填料孔道内的扩散及传
质速率高以及高柱容量等优点，尤其适用于生物大
分子物质的快速分离分析。
使用甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)为单体制得
的整体柱基质已经被广泛的用于离子交换色谱、亲
和色谱整体柱和酶反应器载体的制备。Petro等[16]
分别在甲基丙烯酸缩水甘油酯为单体制得的棒和球
体上固定了胰蛋白酶，比较了在两种模式下，蛋白
酶的活性，发现棒状的酶反应器具有更高的活性，
而在用固定了胰蛋白酶的填充柱中，酶的活性降
低，说明了在整体柱中得到的酶反应器具有较高的
活性，也表明了整体柱用作固定化酶载体的优势。
Duan等[17]制备了GMA-丙烯酰胺复合基质的固
定化酶解柱。由于在基质中引入丙烯酰胺可以对其
骨架的亲水性进行调节更加适合于蛋白酶的固载，
在较高流速下也可以快速水解蛋白质，具有实现高
通量蛋白质分析、鉴定的潜力。采用反相微住液相
色谱结合在线酶解对小鼠肝脏蛋白质组加以研究，
图 10 为质谱检测结果，在 130min梯度下得到 169
个蛋白，在 19 0mi n梯度下得到 1 57 个蛋白，在
250min梯度下得到 111个蛋白。
5　多磷酸化肽的质谱检测技术
蛋白质翻译后修饰是生物体内普遍存在的现
象，它包括酶催化下使分子个体与蛋白质结合(乙
酰化、糖基化和磷酸化)、蛋白质分子间的交联(半
胱氨酸 -半胱氨酸之间的二硫键结合)以及对蛋白质
的裁剪(信号肽的切除)。这些修饰保证了生物体内
蛋白质的完整性，同时影响着蛋白质的活性及其相
互作用，也对细胞膜内外间的信号传导起着调控作
用。在这些修饰中，蛋白磷酸化尤为重要，在蛋
白质特定氨基酸残基上的可逆磷酸化修饰是细胞中
的主要调控机制，对细胞的整个生理过程(细胞的
成长、分裂和分化)、信号传导、基因调控和代谢
过程都十分重要。
近几年，质谱已经成为分析和鉴定磷酸化蛋白
和多肽以及确定磷酸化位点的主要手段。目前主要
采用的方法是利用亲和技术(包括免疫亲和、固定
化金属亲和以及金属氧化物亲和)对磷酸化蛋白或磷
酸化肽进行富集和纯化，然后进入质谱进行分析。
在使用电喷雾质谱对磷酸化肽段进行分析时，由于
磷酸根的存在，使多肽分子不容易结合质子形成正
离子，严重地抑制了磷酸化肽在质谱中的响应信
287第3期 张维冰，等：蛋白质组研究中分离新技术与新方法
图11　部分去磷酸化的质谱鉴定结果
注：(A)180min；(B)240min；(C)420min
实验条件：LC：3µm C18，250µm×50mm；缓冲溶液：A：0.1% 乙酸，B：CAN中加入 0.1% 乙酸；梯度条件：0min
(5%)－ 20min(65%)－ 35min(65%) ；流速：5mL/min；MS(喷雾电压) ：2kV；m/z=400－ 2 000
图10　小鼠肝脏蛋白质在线酶解结果
288 生命科学 第19卷
号，即使通过富集和纯化，也仅能提高单磷酸肽和
二磷酸化肽的检出率，而对于多磷酸化位点的检测
和鉴定仍然无能为力。Thompson等[18]使用 β-消除
反应和二亚胺缩合反应对磷酸根进行修饰，用于改
善磷酸化肽的质谱检测。该类方法能够有效地增强
多磷酸化肽的电离，但操作复杂，使用范围有限。
王辉等[19]用 TiO2捕集柱对 β-casein中的磷酸化
肽进行富集，并用碱性磷酸酶对富集后的产物进行
处理。通过控制反应条件，部分去除多磷酸化肽上
的磷酸基团，并结合 LC-MS/ MS对多磷酸化肽的
位点进行研究。通过连续监测发现，加入碱性磷酸
酶反应 5min时，已开始有去磷酸化作用发生。图
11为经过碱性磷酸酶处理180min、240min和420min
的样品进行microLC-ESI-MS分析得到的总离子流
图。该图中可以发现，在两个位置出现了质荷比为
1 442.5的色谱峰，而该质荷比与四磷酸化肽去掉三
个磷酸基团后的单磷酸化肽的质荷比相一致。该结
果说明：在经过部分去磷酸化处理后的样品中可能
存在两条氨基酸序列相同，但磷酸化位点在两个不
同位置的单磷酸化肽段。通过数据库检索及文献信
息，也证明二磷酸化肽的磷酸位点在 18S、19S位置。
6　结论
蛋白质组研究的突破，首先应该是技术与方法
上的突破，必须在蛋白质分析方面实现一些重要创
新和突破，开发若干关键技术并形成功能模块或组
件，最终发展成为集成化蛋白质分离检测系统，才
能有效实现蛋白质的高灵敏度、高通量分离鉴定。
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