全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第 19卷 第 2期
2007年 4月
Vol. 19, No. 2
Apr., 2007
蛋白转导域内在化机制的研究进展
曲恒燕，孙曼霁*
(军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850)
摘　要：蛋白转导域(protein transduction domain, PTD)可以携带外源生物大分子进入细胞，在分子生
物学、细胞生物学的基础研究及生物技术应用中，都展示出良好的前景，应用广泛，但机制不甚明
确。已知的 PTD均有其关键的特定氨基酸存在和较强的正电荷分布，并具有独特的二级结构及空间构
象，这些特殊的结构特征对其内在化机制起决定作用。目前认为巨胞饮作用是 PTD 入胞的主要机制，
PTD在经过细胞表面糖胺聚糖紧密结合快速作用及电荷作用后，由脂筏蛋白介导的巨胞饮作用内在化，
然后巨胞饮体脂质双层破裂，使蛋白转导域 - 大分子释放入胞浆及胞核。
关键词：蛋白转导域；内在化；机制
中图分类号：Q516; Q73　　文献标识码：A
Recent progress in internalization mechanism of
protein transduction domain
QU Hengyan, SUN Manji*
(Institute of Pharmacology and Toxicology, Beijing 100850, China)
Abstract: Protein transduction domain (PTD) can carry a variety of large, biologically-active molecules into
cells, and serves as a valuable biological tool in fundamental research and biotechnological applications.
However, the mechanism of transduction remains elusive. Studies on the structure of PTD provide clues about
the mechanism of PTD translocation. The specific amino acids with strong positive charge as well as the unique
secondary structure and three dimensional conformation are all required for the translocation. These special
structures play an important role in PTD internalization. At present, macropinocytosis is thought to be the
major pathway of PTD internalization. PTD enters cells by rapid lipid rafts-mediated macropinocytosis after
binding to the cell membrane via ionic interaction and the tight and rapid combination with glycosaminoglycans.
The disruption of the macropinosome vesicle lipid bilayer ultimately results in the PTD –cargo release to the
cytosol and nuclus.
Key words: protein transduction domain; internalization; mechanism
文章编号 ：1004-0374(2007)02-0220-04
收稿日期：2006-08-14；修回日期：2006-09-11
基金项目：军队“十一五”科技攻关项目(0 6G11 9)
作者简介：曲恒燕(19 79 －)，女，博士研究生；孙曼霁(19 31 －)，男，研究员，博士生导师，中国科学院院士，
*通讯作者，Tel: 010-66874609, E-mail: sunmj@nic.bmi.ac.cn
细胞膜以磷脂双分子层为骨架，镶嵌着蛋白质
分子和糖脂。膜结构决定其对物质的选择通透性，
脂质的疏水性使外源多肽及蛋白质难以穿越细胞
膜。1988年，Green和 Frankel分别独立发现：从
HIV-1病毒分离出的TAT蛋白具有穿越细胞膜的能
力，首次报道了蛋白转导现象， 推翻了细胞膜不可
221第2期 曲恒燕，等：蛋白转导域内在化机制的研究进展
透过的认识。TAT蛋白可以引导多种多肽和蛋白质
进入细胞，称作转导作用(transduction)。随后又发
现许多具有转导能力的多肽结构。这些能携带生物
大分子进入细胞的多肽统称为蛋白转导域(protein
transduction domains, PTD)或转导肽( transduction
peptide)，也称为细胞渗透蛋白(cell permeable
proteins, CPP)或膜转位序列(membrane translocating
sequences, MTS)、胞膜穿透肽(membrane penetrat-
ing peptides，MMP)[1]。
将靶蛋白用重组技术或化学偶联等方法连接到
PTD上，可以将信号转导分子、转录因子、酶类、
反义寡核苷酸等递送到细胞内，研究细胞内分子调控
机制，鉴别同源异型蛋白转录因子的转录靶点，分
析靶向基因的特征及研究调节生理病理现象的遗传通
路[2]。转导肽可携带活性生物大分子进入难以达到的
部位，发挥治疗作用，如利用转导肽携带抗凋亡肽
进入脑组织对缺血性脑损伤产生保护作用[3]。给组织
特定部位注入PTD-Cre可引导该部位的基因重组，这
比构建转基因小鼠容易得多，也便宜得多[4]。可见，
细胞转导肽具有强大的内在化作用和广泛的应用潜
力，但其入胞的具体途径和机制目前还存在争议，
不少研究从转导肽的结构中寻求作用机制的答案。
1　结构特征
特定氨基酸及二级结构域的研究可为转导肽入
胞机制提供线索，几个氨基酸被替代可完全抑制
PTD转导。TAT介导的蛋白转导过程速度快，不
依赖于受体和转运蛋白，呈浓度依赖性，目前推
测，这一过程与 PTD蛋白转导域中的碱性氨基酸
(精氨酸和赖氨酸)有关，这些氨基酸均带有强的正
电荷，可能通过直接与带负电荷的细胞膜脂类相互
作用而介导穿膜过程，任何一个突变都会严重消弱
它的转导；而穿透素(penetratin)严格依靠一个中央
疏水核(W6,F7)的存在，单个氨基酸替换会影响转
导，这种情况不仅存在于 TAT和穿透素，在其他
转导肽也观察到相似情况[5]。根据结构分析，细胞
转导肽都存在较多的碱性氨基酸或疏水性氨基酸，
可以与带负电的膜脂结合，介导生物大分子的细胞
内在化。
人周期蛋白 1(hPer1)可以转导入细胞，氨基酸
830— 845是其 PTD，富含碱性氨基酸。对其三维
结构及突变体进行研究，同时分析其静电、能量和
疏水性等特征，Arg836是转导的关键性基团，将
此精氨酸突变成丙氨酸则失去转导能力。另外，大
片带正电的区域也是 hPer1-PTD内在化的关键因
素，α-螺旋结构对正电荷在空间安排中起到了辅助
作用 [ 6 ]。
核磁共振研究显示 PTD存在一个扩展的螺旋
结构。Kim等[7]确定各氨基酸在 α-螺旋轴上的位
置后，对氨基酸进行特定改变，以使螺旋构象更
稳定，以期得到更高的跨膜转导效率。他们保持
α-螺旋同一侧的5个精氨酸不变作为跨膜转导的最
小单位，对其另一侧的氨基酸进行替换，以增强
α-螺旋结构的稳定性，优先选择最靠近 Arg-7和
Arg-9的Gly-2 和 Lys-4作为替换目标，位于5个Arg
最远端的Arg-11 和 Gln-8为次选目标，将 Pro放置
在螺旋结构的 N-端，由此设计出一系列多肽，结
果均具有蛋白转导功能，多数肽转导功能远高于
TAT。可见 α-螺旋结构对于 PTD转导起到了举足
轻重的作用。
2　内在化机制
PTD内在化需要细胞膜的结构成分参与。细胞
表面广泛存在的糖胺聚糖与PTD紧密结合快速形成
复合物是蛋白转导的第一步。结合平衡热力学显示
PTD与三种不同糖胺聚糖均有较高的结合常数，而
其中细胞表面的硫酸乙酰肝素(heparan sulfate, HS)
是蛋白内在化的关键调节子[8-9]。PTD与细胞膜表面
存在强烈的电荷作用，并且可与膜结构成分结合形
成复合物。因此，区分细胞表面黏附的蛋白与真正
进入细胞内的蛋白是很关键的，以避免在细胞固定
后部分蛋白进入细胞的假相，VP22由于其强碱性
残基而有报道说是在细胞固定后进入细胞的。
Lundberg 和 Johansson[10]使用甲醇固定细胞曾宣称
VP22蛋白的“假内流”，声称 PTD-蛋白的入胞和
核定位仅发生在固定细胞中而不发生在活细胞中，
错误地推断VP22-PTD介导的是细胞结合而不是转
位。最近大量研究报道了标记蛋白和(或)功能性肽 /
蛋白在活细胞中的 PTD转导，PTD介导有生物活性
的多肽蛋白可在活细胞中发挥作用。用微速摄影共
聚焦显微镜观察，在非固定的活动的成纤维细胞中
可见具有荧光标记的 Fg-PTD入胞。Mano等[11]对荧
光标记的S413-PV肽分别进行活细胞和固定细胞条件
下的共聚焦激光扫描显微镜观察，两种条件下的胞
浆和胞核均有大量荧光分布，推翻了蛋白入胞是细
胞固定后结合在细胞表面的蛋白在胞内重新分布而
引起假相的说法。
PTD以一种快速不依赖于受体和转运蛋白的方
222 生命科学 第19卷
式进入细胞, 呈浓度依赖性，但具体机制仍有争
议。至今主要有三种模式解释PTD的入胞机制。第
一种模式认为，转导肽垂直插入胞膜，与脂质并列
的疏水残基通过低聚反应与装配的亲水面形成一通
道。这一模式可使亲水物质有效通过，但会对细胞
生存造成威胁，几个肽可在细胞表面形成小孔导致
细胞死亡[12]。目前还没有证据表明转导肽是直接跨
膜进入细胞的。第二种模式认为蛋白通过静电作用
结合到胞膜脂质的极性端，导致逆向小体的瞬间形
成，吞没转导肽及其携带的大分子，是不依赖温度
和能量的转位，这种情况即使在 4℃条件下也能发
生，胞内小体的再度开放就会释放转导肽 -大分子
进入胞浆。在 Antp-PTD转运小肽的穿膜过程中，
有单层磷脂小泡即逆向小体形成，在 4℃条件、
ATP消耗及存在内在化抑制剂等的情况下，内在化
也不受抑制；而长度相同、电荷和疏水性相同只是
将 6位上的色氨酸突变成苯丙氨酸的小肽虽能结合
脂质，但不被内在化，不能诱导逆向小体形成[13]。
被转运分子的大小会限制逆向小体的形成，并且需
要有疏水氨基酸的存在，因此，此模式不可能是
PTD转导的普遍机制。第三种模式认为PTD与胞膜
相互作用后，在内吞作用下通过囊泡进入细胞，然
后释放入胞浆和胞核。目前认为内吞作用是解释
PTD 入胞的主要机制，TAT-PTD、11R-PTD 和
BETA2/NeuroD 转录因子拥有丰富的精氨酸和赖氨
酸，通过内吞作用进入细胞，内吞体转运后释放入
胞浆和胞核[9,14]。内吞作用有多种形式，包括巨胞
饮作用、小凹蛋白介导型、网格蛋白介导型、吞
噬作用及内吞体间交流等。
T细胞用盐酸阿米洛利(巨胞饮作用所需的Na+/H+
离子交换抑制剂)预处理，或细胞松弛素D(丝状肌
动蛋白延伸抑制剂)预处理，TAT-Cre-488转运进入
小囊泡的量均减少，经这两种巨胞饮抑制剂均处理
的细胞中，几乎没有 TAT-Cre-488转运入胞，表
明 TAT-Cre-488介导的入胞是通过脂筏依赖的巨胞
饮作用发生的[15]。从目前关于转导肽机制的研究来
看，PTD首先以一种不依赖受体的方式与细胞膜脂
筏蛋白相互作用，激动由巨胞饮作用介导的内在
化，紧接着巨胞饮体内 pH值下降，巨胞饮体脂质
双层的稳定性降低，最终导致 PTD-大分子释放入
胞浆及胞核。脂筏中含有糖磷脂酰肌醇锚定的蛋白
聚糖和糖蛋白，PTD可能对某些类型的蛋白聚糖具
有更高的亲合力，或者可能直接与膜胆固醇成分直
接结合而促发巨胞饮作用。蛋白从巨胞饮体逃逸是
入胞过程的限速步骤。尽管PTD介导的从巨胞饮体
向胞浆释放所涉及的分子机制还不清楚，但认为释
放囊泡的是巨胞饮体，而不是其他类型的胞内体，
并且，尽管巨胞饮体的 pH值降低，并不与溶酶体
融合，因而不会导致其内容物降解。
低浓度下(0.2µmol/L和 0.4µmol/L)的 S413-PV 转
导肽进入CHO-K1 细胞显著受到氯丙嗪(抑制网格蛋
白介导的内吞)的抑制，而制霉素(通过耗尽或隔离
膜胆固醇而抑制脂筏介导的内吞途径，包括巨胞饮
作用和小凹蛋白介导型内吞)对其入胞几乎没影响，
表明参与其入胞作用的是网格蛋白介导型内吞而不是
脂筏介导型；然而氯丙嗪、盐酸阿米洛利、制霉
素对CHO-K1 细胞和Hela细胞吸收高浓度(1µmol/L)
的 S413-PV均没有影响，只有细胞松弛素D对其入
胞有轻微抑制，可见高浓度 S413-PV的有效入胞不
是通过内吞作用，主要机制还不清楚[11]。因此，蛋
白转导的机制虽然以内吞为主，但也不能完全排除
其他机制。值得一提的是，不同的 PTD 可能会有
不同的内在化机制，同一PTD在转导不同分子时也
可能具有不同的内在化机制。
3　问题与展望
PTD能有效通过生物膜且不依赖于转运体或特
异受体，能促进多肽及蛋白的入胞。蛋白转导技术
应用广泛，也还有需进一步完善之处。
首先，PTD在体内缺乏组织特异性和细胞类型
特异性，这在某些条件下是一种优点，但对于要求
药物靶向到体内特定区域或进入特异细胞，就是个
问题了。因此增加转导肽的靶向性则是将来发展的
一个目标，需要构建靶向部分，而噬菌体展示技术
筛选出来的细胞特异PTD提示了一个很有前景的方
法。在亚细胞水平，PTD 及其共轭分子的转运主
要定位于胞核而不是胞浆，这与核定位序列NLS有
关。新出现一种胞浆转导肽，专门为有效胞浆运输
而设计的，与 PTD相比，胞浆转导肽及其融合分
子显示了明显的胞浆定位偏爱和显著增强的跨膜转
导能力 [ 7 ]。
其次，P TD s 或其融合蛋白会在内吞体内聚
集。蛋白转导的主要机制是通过巨胞饮作用进入细
胞，然后释放入胞浆和胞核，但转导蛋白经常会陷
入巨胞饮体中而不被释放，因此需要高剂量的蛋白
才能达到有效的生物功能。为克服这一问题，蛋白
可连接于流感病毒血凝素 2亚单位的 NH2结构域
223第2期 曲恒燕，等：蛋白转导域内在化机制的研究进展
(HA2), HA2是 pH依赖性融合肽，在低 pH环境中可
导致膜裂解。pH敏感的HA2肽显著特异地增强蛋白
从巨胞饮体中逃逸[16]。HA2-聚精氨酸融合 p53可激
活 p21的转录活性，比单纯聚精氨酸融合 p53更有
效地抑制癌细胞的生长[17]。同样还有采用光敏感的
PTD来增强从内吞体的逃逸[18]。
此外，一些蛋白在内在化进入细胞后不再具有
生物活性，可考虑在蛋白和 PTD之间插入一连接
子，用以辅助在细胞内释放有活性的蛋白和药物；
因纯化问题，PTD 不能用于不溶性蛋白：鉴于这
些障碍，P TD 序列还需要优化以提高其适用性。
PTD是否有免疫原性或半免疫原性及长期应用会对
机体产生何种影响还需进一步的研究。
PTD蛋白转导是一个高效的运输系统，是蛋白
靶向入胞的有力的生物学手段，为亲水性大分子药
物跨越细胞生物膜屏障及血脑屏障，以治疗疾病提
供了新的途径；可作为分子生物学、细胞生物学等
基础研究的工具，也可应用于生物技术中，并具有
临床治疗潜力。
[参 考 文 献]
[1] Beerens A M, Al Hadithy A F, Rots M G, et al. Protein
transduction domains and their utility in gene therapy. Curr
Gene Ther, 2003, 3(5): 486-494
[2] Mainguy G, Montesinos M L, Lesaffre B, et al. An induc-
tion gene trap for identifying a homeoprotein-regulated locus.
Nat Biotechnol, 2000, 18(7): 746-749
[3] Asoh S, Ohsawa I, Mori T, et al. Protection against ischemic
brain injury by protein therapeutics. Proc Natl Acad Sci
USA, 2002, 99 (26): 17107-17112
[4] Peitz M, Pfannkuche K, Rajewsky K, et al. Ability of the
hydrophobic FGF and basic TAT peptides to promote cel-
lular uptake of recombinant Cre recombinase: a tool for effi-
cient genetic engineering of mammalian genomes. Proc Natl
Acad Sci USA, 2002, 99(7): 4489-4494
[5] Fischer R, Waizenegger T, Kohler K, et al. A quantitative
validation of fluorophore-labeled cell-permeable peptide
conjugates: fluorophore and cargo dependence of import.
Biochim Biophys Acta, 2002, 1564(2): 365-374
[6] Yang X L, Xie J, Niu B, et al. Structure analysis of the
protein transduction domain of human Period1 and its mu-
tant analogs. J Mol Graph Model, 2005, 23(5): 389-394
[7] Kim D, Jeon C, Kim J H, et al. Cytoplasmic transduction
peptide (CTP): new approach for the delivery of biomolecules
into cytoplasm in vitro and in vivo. Exp Cell Res, 2006, 312
(8): 1277-1288
[8] Noguchi H, Bonner-Weir S, Wei F Y, et al. BETA2/NeuroD
protein can be transduced into cells due to an arginine- and
lysine-rich sequence. Diabetes, 2005, 54(10): 2859-2866
[9] Ziegler A, Nervi P, Durrenberger M, et al. The cationic cell-
penetrating peptide CPP(TAT) derived from the HIV-1 pro-
tein TAT is rapidly transported into living fibroblasts:
optical, biophysical, and metabolic evidence . Biochemistry,
2005, 44(1): 138-148
[10] Lundberg M, Johansson M. Positively charged DNA-bind-
ing proteins cause apparent cell membrane translocation.
Biochem Biophys Res Commun, 2002, 291(2):367-371
[11] Mano M, Teodosio C, Paiva A, et al. On the mechanisms of
the internalization of S413-PV cell-penetrating peptide.
Biochem J, 2005, 390(Pt 2): 603-612
[12] Brasseur R. Tilted peptides: a motif for membrane destabi-
lization (hypothesis). Mol Membr Biol, 2000, 17(1): 31-40
[13] Magzoub M, Eriksson L E, Graslund A. Comparison of the
interaction, positioning, structure induction and membrane
perturbation of cell-penetrating peptides and non-translo-
cating variants with phospholipids vesicles. Biophys Chem,
2003, 103(3): 271 -288
[14] Noguchi H, Matsumoto S. Protein transduction technology:
a novel therapeutic perspective. Acta Med Okayama, 2006,
60(1): 1-11
[15] Wadia J S, Stan R V, Dowdy S F. Transducible TAT-HA
fusogenic peptide enhances escape of TAT-fusion proteins
after lipid raft macropinocytosis. Nat Med, 2004, 10(3):
310-315
[16] Joliot A, Prochiantz A. Transduction peptides: from tech-
nology to physiology. Nat Cell Biol, 2004, 6(3): 189-196
[17] Michiue H, Tomizawa K, Wei F Y, et al. The NH2 terminus
of influenza virus hemagglutinin-2 subunit peptides enhances
the antitumor potency of polyarginine-mediated p53 pro-
tein transduction. J Biol Chem, 2005, 280(9): 8285-8289
[18] Matsushita M, Noguchi H, Lu Y F, et al. Photo-acceleration
of protein release from endosome in the protein transduc-
tion system. FEBS Lett, 2004, 572(1-3): 221-226