全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第22卷 第10期
2010年10月
Vol. 22, No. 10
Oct., 2010
文章编号 ：1004-0374(2010)10-0985-06
收稿日期：2010-04-08；修回日期：2010-08-09
基金项目：国家自然科学基金项目( 3 0 7 2 1 0 0 1 ;
30973373; 30772507) ；国家高技术发展计划(“863”
计划)(2006AA02A403; 2006AA02A308) ；国际科技
合作与交流专项(2008DFA31130)
*通讯作者：E-mail: zhaoxh@cicams.ac.cn; Tel: 010-
67709015
自组装蛋白质芯片——功能蛋白质组学的新工具
艾润娜，赵晓航*
(中国医学科学院/ 北京协和医学院肿瘤研究所，分子肿瘤学国家重点实验室，北京100021)
摘　要：传统的蛋白质芯片制备需要进行繁琐的蛋白质表达与纯化。同时，由于蛋白质活性不稳定，
蛋白质芯片不宜长期保存。新一代自组装蛋白质芯片，利用无细胞表达体系和 D N A 固定技术，能够
将蛋白质即时、原位表达并固定在芯片上，有效地解决了传统蛋白质芯片的制备和保存问题。目前自
组装蛋白质芯片已初步用于大规模蛋白 - 蛋白质相互作用的筛选，以及鉴定免疫优势抗原等研究。该文
介绍了近年自组装蛋白质芯片技术的进展和应用研究。
关键词：自组装蛋白质芯片；蛋白 - 蛋白质相互作用；无细胞蛋白质合成
中图分类号：Q 8 1 6　　文献标识码：A
Self-assembling protein microarray — a new tool for functional proteomics
AI Run-na, ZHAO Xiao-hang*
(State Key Laboratory of Molecular Oncology, Cancer Institute, Chinese Academy of
Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100021, China)
Abstract: Traditional protein microarrays require time-consuming processes of protein production and
purification since the protein activities are not stable and the array products could not be stored properly for a
long time. Self-assembling protein microarrays utilized cell-free expression system and DNA immobilization
technique, which allowed multiple-protein expression simultaneously and in situ immobilization on the surface
of arrays. This technology effectively overcomes the problems of traditional protein microarrays, and provides
a useful tool for functional proteomics analysis. Currently, self-assembling protein microarrays are primarily
used for screening protein-protein interactions, identifying immunodominant antigens and so on. This review
focused on the recent advancement and application research on self-assembling protein microarrays.
Key words: self-assembling protein microarray; protein-protein interaction; cell-free protein synthesis
蛋白质芯片具有微型化、高通量、高效、省
时、所需样本量低、可重复性强和数据质量高等诸
多优点，目前已经广泛应用于疾病诊断、药物设
计、蛋白质- 蛋白质相互作用研究、蛋白质- 核酸
相互作用研究、蛋白质- 脂质体相互作用研究、特
异性蛋白质的筛选和功能蛋白质组研究等多个领域。
传统的蛋白质芯片制备技术主要通过表达并纯
化蛋白，将各种纯化蛋白有序地固定于特殊固相片
基(滴定板、滤膜和载玻片)上，然后用标记了特定
荧光素的蛋白质配体或其他成分与芯片杂交，经漂
洗去除未能与芯片上蛋白互补结合的成分，再经荧
光扫描仪或激光共聚焦扫描技术测定芯片上各点的
荧光强度，通过荧光强度分析蛋白与蛋白间的相互
作用。但传统蛋白质芯片的制备存在许多问题，如
蛋白质的表达和纯化步骤繁琐，耗时耗力；固定在
芯片上的蛋白质不易保存，不能长期保持活性等。
与传统的蛋白质芯片制备方法相比，自组装蛋白质
986 生命科学 第22卷
芯片采用无细胞系统在芯片表面开展蛋白质的即时合
成与固定，极大地提高了蛋白质合成、纯化的效率
和通量；由于无细胞系统和蛋白质芯片的开放性
质，增加了实验的可控性；同时原位合成也避免了
因保存不当导致蛋白质活性下降的问题。本文综述
了自组装蛋白质芯片制备技术及其应用的研究进展。
1　自组装蛋白质芯片的原理
1.1　DNA/mRNA 模板的制备及固定
蛋白质芯片的合成需要大型的 c D N A 文库。
cDNA文库必须处于适合表达的状态，即与适当的启
动子连接，无非翻译序列，以及重组必要的纯化标
签。随着测序技术的发展，许多物种的全基因组测
序工作已经完成，并在此基础上构建了一些物种的
开放阅读框(open reading frame, ORF)克隆文库，如
人类[1]、霍乱弧菌[2]、兔热病杆菌[3]等 ORF 克隆文
库。此外，近年发展起来的蛋白质表达通用克隆技
术，如Gateway克隆[4]和 TA克隆[5]能使特定基因的
ORF根据研究需要方便地重组于不同的表达载体中，
便于ORF 克隆文库的高通量表达。有了ORF 克隆文
库，就可以通过已知的基因组信息，设计引物从
ORF 克隆文库中调取目的ORFs，将这些DNA 片段
用DNA 芯片的打印技术固定在芯片的片基上[6]。
1.2　无细胞蛋白质合成体系
无细胞蛋白质表达系统，即一种模拟体内蛋白
质合成与翻译后修饰条件的体外蛋白质表达系统，
由含有基因转录、蛋白质合成与翻译后修饰所需主
要元件的特定细胞抽提物构成。常用的如兔网织红
细胞、大肠杆菌和麦胚抽提物，还包括超嗜热菌、
杂交瘤、爪蟾卵细胞、昆虫、哺乳动物和人类细
胞提取物等[7-11]。在该系统中，蛋白质可以在不同
环境(如原核或真核表达系统)和温度(如超嗜热菌表
达)条件下合成，将转录和翻译过程偶联，以质粒
DNA 为模板经PCR 扩增目的基因后在无细胞表达系
统中合成蛋白质[10]。系统中可以加入其他组分，如
酶、能量物质等，为蛋白折叠、二硫键形成、修
饰或蛋白活性提供适宜的环境。无细胞系统也可以
在翻译时直接标记目的蛋白质，将荧光基团、生物
素、光敏基团和抗原表位等在蛋白质合成中重组到
指定位置以便下游的检测[12,13]。通过压电灌注，有
效地将反应体积降低至纳升级，更加适合芯片上蛋
白质的合成[14]。
1.3　蛋白质捕获和检测技术
固定蛋白质是一件复杂的工作，因为其化学性
质复杂，还要确保其结构的完整性和可接近性。方
法之一是采用甲醛、环氧、胺或其他试剂与蛋白质
的氨基或羧基结合，将蛋白质以随机的方向固定在
芯片表面，充分暴露其潜在的相互作用表面[15-17]。
第二种方法是在蛋白质 N 端或 C 端重组标签蛋白，
通过标签蛋白捕获试剂将表达的融合蛋白固定在芯
片表面。该方法可以使所有蛋白质以一致的方向固
定于芯片表面，而且蛋白质与芯片表面有一定距
离，减少了蛋白质相互作用中的空间位阻效应。同
时，标签蛋白增加了结合目的蛋白质的选择性，简
化了后续蛋白质纯化步骤。
芯片的检测技术可分为基于标记和非标记的两
种检测方法。其中，基于荧光标记的技术是将荧光
基团直接偶联相互作用的靶蛋白分子，或通过二级
试剂连接(如三明治方法)，通过检测荧光标签的强
度确定蛋白质的相互作用。相反，非标记的检测方
法是通过测量相互作用分子的内在特性，如质量或
介电常数，来判断相互作用强弱。前者使用商业化
的试剂和仪器，但荧光基团的共价引入可能影响蛋
白质功能或被监测的表位；而后者避免了外源基团
引入对蛋白质功能的影响，并可做到实时监测，但
所需的仪器设备复杂。目前基于标记的检测方法其
灵敏度高于非标记方法[18]。
2　无细胞自组装蛋白质合成技术分类
2.1　PISA技术
蛋白质原位芯片(protein in situ array, PISA)是一
种基于特定基因序列的经PCR扩增和体外无细胞表达
系统表达和原位捕获的蛋白质芯片技术，以阵列的
形式将DNA 直接转化为功能性蛋白，无需进行基因
的克隆、表达和纯化，并且避免了蛋白质芯片长期
保存的问题[19]。在此基础上，Angenendt等[14]进一步
结合多重打点技术(multiple spotting technique, MIST)
建立了一种高度微缩的亚纳升级的原位蛋白质合成技
术，使芯片上合成蛋白质密度达到每片13 000 点。
2.2　NAPPA 技术
核酸程序化蛋白质芯片(nucleic acid program-
mable protein array, NAPPA)技术是在固定的DNA模
板上原位合成蛋白质的芯片技术。将质粒 DNA 和
标签蛋白捕获抗体共同固定于玻片上，然后用兔网
织红细胞裂解液覆盖玻片，新合成的蛋白质被每个
点上的抗体原位捕获[6]。通过优化模板DNA的合成
得到高质量的 DNA，并改进打印方法(如使用牛血
清白蛋白大大提高模板 DNA 的结合效率)，在表
987第10期 艾润娜，等：自组装蛋白质芯片——功能蛋白质组学的新工具
达 1 000 个人类蛋白质的第二代NAPPA 芯片中，转
录因子和激酶表达的成功率分别为86%和98%，那
些通常在异源系统中难以表达的膜蛋白的表达信号
也达到93%。Ramachandran等[20]在一张含有647个
独特基因的NAPPA 芯片上验证了这种高密度芯片表
达蛋白质的功能。用那些功能明确的已知二元相互
作用蛋白，如Jun-Fos 和 p53-MDM2 等作为阳性对
照或查询蛋白，发现 NAPPA 芯片表达的蛋白质能
够选择性地正确结合其相互作用配体分子。
和 PIS A 一样，NA P P A 芯片不需要纯化蛋白
质。同时与PISA 相比，NAPPA 芯片的优点是，具
有固定的 DN A 模板，芯片比较稳定，便于存储和
分发，在需要时可迅速翻译为蛋白质芯片。NAPPA
技术的不足之处主要为，需要将每个目的基因与
GST 标签序列重组，构建重组克隆表达质粒；需要
将固定的质粒生物素化，以便使表达质粒固定到亲
和素的表面，还要避免这一过程对转录的干扰。另
外，这一技术并不能合成“纯”蛋白质芯片，合
成的芯片中，每个点上既有蛋白质，也有编码蛋白
质的质粒DNA(可以用DNase 去除)和捕获抗体。与
PISA 一样，每张DNA 芯片只能合成一张蛋白质芯
片[21]。
2.3　DAPA 技术
He 等[22]研发了从DNA 芯片到蛋白质芯片(DNA
array to protein array, DAPA)的技术。含标签蛋白和
编码蛋白的DNA克隆被固定在一张玻片上，而在另
一张玻片上包被特异标签蛋白的捕获试剂，在两张
玻片间的滤膜上进行无细胞蛋白质合成。芯片上的
DNA 模板可以反复使用，所合成的蛋白质经滤膜扩
散被捕获和固定在第二张玻片上，形成与DNA芯片
对应的蛋白质芯片。DAPA 芯片上蛋白质点的阵列
密度符合高斯分布，D N A 模板可以重复使用，同
一张DNA 芯片可以制备多张蛋白质芯片(至少可以
制作20个拷贝的蛋白质芯片)。该技术对那些不配
备芯片点样机的实验室特别适用。DAPA可以展示大
量不同的蛋白质，包括抗体片段，绿色荧光蛋白和
转录因子等。与NAPPA 相比，DAPA 技术在另一平
面上合成由单一纯化蛋白构成的蛋白质芯片，避免
了在下游应用时可能存在共定位蛋白质的干扰[22,23]。
2.4　ISPCFmA 技术
Tao 和 Zhu[24]在 mRNA 展示技术基础上，建立
了基于mRNA芯片的原位嘌呤捕获技术(In situ puro-
mycin capture from mRNA array, ISPCFmA)，采用
嘌呤霉素捕获新合成的多肽，原位制备蛋白质芯
片。芯片上固定的 DNA 模板经 PCR 扩增，体外转
录为mRNA，mRNA的 3端与一段被生物素(biotin)
和嘌呤霉素修饰的ssDNA 退火，再通过生物素- 亲
和素的相互作用，将 m R N A s 固定在包被亲和素
(avidin)的玻片上，并在无细胞抽提物中原位翻译成
蛋白质。翻译中的核糖体在到达 RNA/DNA 杂交区
域时发生阻滞，新生蛋白质释放减缓。接着与DNA
结合的嘌呤霉素捕获新生蛋白并将其固定在玻片
表面。翻译结束后，经 R N a s e 消化去除剩余的
mR NA，获得蛋白质芯片。由于嘌呤霉素与 mR N A
的精确定位，mRNA 与合成蛋白呈现 1:1 的数量关
系，因而该方法限制了蛋白质点的扩散。但在打印
前需要额外的操作——转录并修饰mRNA 分子。通
常 m R N A 不稳定，所合成的蛋白质含量受打印的
mRNA 含量的限制 。
2.5　其他支持物
除了传统的玻片支持物外，研究者还开发了其
他材料的支持物，使蛋白质芯片的应用更加灵活、
广泛。Oleinikov等[25]用自组装蛋白质合成技术将靶
蛋白合成并固定在CombiMatrix半导体寡核苷酸芯片
上，成功地展示了荧光素酶和绿色荧光蛋白，展示
的蛋白质具有正确的折叠和活性，检测灵敏度高。
Wong 等[26]根据 NAPPA 原理，将无细胞系统合成的
蛋白质用抗体偶联的磁珠捕获，建立了磁珠- 酶联
免疫吸附法(bead enzyme-linked immunosorbnent assay,
bead ELISA)，可以用来筛选含有自身抗体的血清，
检测的灵敏度和特异度与传统ELISA 相似。
3　自组装蛋白质合成技术的应用
3.1　研究蛋白质-蛋白质相互作用
利用NAPPA芯片，Ramachandran等[6]研究了29
个已知参与DNA合成起始过程的蛋白质之间的相互作
用。分别用单个蛋白与表达这29 个候选蛋白的芯片
共孵育，最终发现了110 个相互作用关系。其中49
个为已知相互作用，它们曾分别经遗传学、酵母双
杂交(yeast two hybrid system, Y2H)、生化等传统方法
所鉴定；同时，发现了63 个未曾报道的相互作用。
NAPPA与传统相互作用金标准的结果相比，其重叠率
为85%(17/20) ；用免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,
co-IP)方法验证相互作用，NAPPA 检出率为52.8%
(19/36) ；与 Y2H 结果重叠率最低，只有42%。此
外，发现了一些间接相互作用的证据，例如，只
有共表达Cdc6 时，MCM2 才能与Cdt1 结合，因此
Cdc6 可能作为一种中介蛋白，介导 MCM2 与 Cdt1
988 生命科学 第22卷
的结合。并且，该研究小组还利用NAPPA，将Cdt1
与geminin发生相互作用的结构域从相对较大的区域
(177~380aa)定位到了较小的一段区域(198~212aa)。
Gerber等[27]利用芯片上自组装蛋白质合成技术
和原位微流亲和实验技术，以及该实验室建立的机
械捕获分子相互作用(mechanical trapping of molecu-
lar interactions, MITOMI)方法[28]，建立了一种体外
高通量筛选蛋白质相互作用的微流实验平台，即蛋
白质相互作用网络生成器(protein interaction network
generator, PING)。在这种装置中，蛋白质原位表
达并固定于独立的小室内，小室与微流仪器连通，
可以同时检测流经小室的成百上千个蛋白质间的相
互作用(二元或多元相互作用)，利用荧光标记抗体
和MITOMI 确定分子间的相互作用。由于每个反应
都发生在独立的小室中，避免了交叉污染。作者用
该装置构建了肺炎链球菌43个蛋白质的相互作用网
络，该网络包括43 个节点和157个相互作用链条。
所鉴定的相互作用中，63%(24/38)已在Swissprot数
据库中有注释。最大的节点是 4 个热休克蛋白质，
从中引发出 61 个相互作用链条。其中最大的节点
GroEL 热休克蛋白质复合物，是一种非常复杂的蛋
白质复合物，也包含96个非热休克蛋白质的特异相
互作用，平均每个蛋白质发生3.6个相互作用。值
得注意的是，该研究发现了一些位于同一条生化通
路上的新的蛋白质相互作用，提示该通路可能存在
某些反馈机制。
3.2　抗原芯片
体液免疫是机体应对外来抗原和自身抗原产生
的特异性保护机制，当受到外来刺激后血清中产生
特异性抗体。传统的抗体/ 抗原蛋白质芯片需要生
产并纯化大量的抗体或抗原蛋白用于芯片制备，工
作量大，抗原数量有限。Ramachandran 等[29]用自
组装蛋白质合成技术，可以快速高效地将各种待测
抗原展示到芯片或磁珠上，有利于全面了解疾病和
健康状态下的机体的体液免疫反应。同时，用患者
血清与不同抗原表位蛋白阵列杂交，可以鉴定免疫
优势抗原，有助于研制预防疾病的疫苗[21]。
Montor等[30]用改进的NAPPA芯片研究了绿脓假
单胞菌的262个外膜蛋白，鉴定了在囊性纤维病和急
性感染患者中激发适应性免疫反应的12个抗原，为
了解哪些蛋白质在自然感染过程中被免疫系统有效识
别提供了有价值的信息。这些蛋白质在患者与对照
人群间的差异检出率具有显著性意义(P<0.01)。该研
究为血清诊断和疫苗研制提供了一系列候选分子。
此外，Rolfs等[2]选择性合成了霍乱弧菌基因组
中约15% 表达蛋白的基因序列，用 NAPPA 技术将
其原位转录、翻译并捕获到芯片表面，抗原制备成
功率达到92%。进而检测了这些体外合成蛋白激活
Toll样受体(Toll like receptor, TLR)的能力，鉴定到
已知靶蛋白FlaC，并且发现了一种新的TLR5 的激
活剂。
Anderson等[31]对比了NAPPA与标准ELISA试剂
盒检测p53 阳性和阴性血清肿瘤自身抗体的效率。
在筛选p53 阳性和阴性血清方面，NAPPA 原位合成
抗原与标准ELISA 方法相似；用同样的抗体进行的
滴定实验发现，NAPPA 和商业化ELISA 的检测灵敏
度相似；用针对 p53 不同表位的抗体的实验发现，
NAPPA 展示抗原的方法并不影响抗原表位的可接近
性，并且两种方法的信号具有较高的一致性。不同
之处在于 NAPPA 可以方便地进行多重化实验，不
会影响其性能。对于大规模研究来说，可以随时表
达大量的抗原，而且成功率很高 。
将NAPPA 技术与磁珠结合，Wong 等[26]建立了
磁珠ELISA 方法，用来筛查肿瘤患者血清中的自抗
体，磁珠ELISA 表达并特异检测GST标签蛋白的成
功率为98.6%(71/72)。在检测p53肿瘤抗原时，磁
珠ELISA 的特异性和灵敏度与标准ELISA 试剂盒、
基于微孔板的程序化(rapid antigenic protein in situ
display, RAPID)ELISA相当。
3.3　检验抗体的特异性
He等[32]用PISA标签捕获方法在镍-氨基三乙酸
(Nickel-nitrilotriacetic acid，Ni-NTA)包被的微孔板
上合成了一张迷你抗体芯片，用来分析人单链黄体
激素抗体的结合特异性。镍离子可与6×His 螯合，
从而固定带有His标签的蛋白质，用克隆的人抗黄
体激素 VH/K 片段的基因在芯片上原位合成抗体，
这些抗体基因的片段是该实验室之前用抗体- 核糖
体-mRNA(antibody-ribosome-mRNA complex, ARM)
核糖体展示在转基因小鼠中筛选出来的。用黄体激
素-BSA特异性抗原和非特异对照蛋白分别与芯片孵
育，只能检测到与抗原的结合反应，验证了抗体结
合位点的特异性，也说明芯片上的抗体处于正确折
叠状态[19,33]。
3.4　筛查蛋白质表达
用小型化(亚纳升级)蛋白质原位表达和固定技
术合成了一张含有384个人类胎脑cDNA文库中克隆
的蛋白质芯片，检测这些 cDNA 在芯片上的表达水
平，验证原位合成蛋白质的方法是否能够扩展到整
989第10期 艾润娜，等：自组装蛋白质芯片——功能蛋白质组学的新工具
个表达文库。与传统的表达方法比较后，揭示了可
表达克隆和不能表达克隆的相似的分布规律。这说
明蛋白质原位芯片是一种可以在无细胞系统中大规模
筛查蛋白质表达的快速、经济、可靠的方法[14]。无
细胞蛋白原位表达和固定也被用于分离重组蛋白[34]。
4　展望
自组装蛋白质芯片具备传统蛋白质芯片的优
点，如所需样本量低、高通量、可重复性好等，
同时还简化了蛋白质表达纯化的过程，避免了蛋白
质长期存储的稳定性问题。因此，可以预见，这
种蛋白质芯片技术的应用范围会快速扩展到功能蛋
白质组研究的领域，如检测蛋白质与蛋白质、蛋白
质与其他生物分子的相互作用，发现蛋白质的翻译
后修饰[35-37]，检测信号通路分子的活性[38,39]，检测
复杂样品中各类蛋白质的表达情况[40, 41]，鉴定传染
性疾病的优势抗原以辅助疫苗的研制[42]等等。此
外，自组装蛋白质合成技术与纳米技术结合，使蛋
白质芯片进一步向小型化高通量方向发展[29]。
[参　考　文　献]
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