全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第22卷 第8期
2010年8月
Vol. 22, No. 8
Aug., 2010
文章编号 ：1004-0374(2010)08-0823-08
收稿日期：2009-12-16；修回日期：2009-12-22
基金项目：国家自然科学基金项目(30870520)
*通讯作者：Tel: 0533-2780271; E-mail:lumingfeng4659@
sina.com.cn
体外展示技术研究进展
卢明锋1,2*
(1 山东师范大学生命科学学院，济南 250014；2 山东理工大学生命科学学院， 淄博 255091)
摘　要：该文系统阐述了核糖体展示、m R N A 展示及 D N A 展示等体外展示技术的实验原理，并对近
年来各种体外展示技术所取得的进展进行了全面的回顾和总结。
关键词：核糖体展示；m R N A 展示；D N A 展示
中图分类号：Q78 文献标识码：A
Advance in study on in vitro display technology
LU Ming-feng1,2*
(1 School of Life Sciences, Shandong Normal University, Ji’nan 250014, China; 2 School of Life Sciences, Shandong
University of Technology, Zibo 255091,China )
Abstract: This paper describes the principle of in vitro display technology such as ribosome display, mRNA
display, DNA display and reviews in detail the advance in study on in vitro display technology in recent years.
Key words: ribosome display; mRNA display; DNA display
要想在实验室里模拟自然进化进行定向加速进
化，就必须像自然界中的细胞那样想办法将基因型
与表型连接在一起。为实现上述目的，20 世纪80
年代以来多种体内展示技术，如噬菌体展示[1]、细
胞表面展示[2,3]及质粒展示等相继发展起来，并取得
了巨大的成功[4]。但这些展示技术都需要借助活细
胞的生命活动才能实现全部的流程，所以不可避免
地存在以下几个缺点[5]; 受转染效率的限制，这类文
库的库容<1010；对不同于细胞环境条件下的选择无
能为力；不适于具有细胞毒性蛋白质的筛选；不
能用于对细胞存活有重要影响的蛋白质的筛选。由
于完全采用无细胞系统进行体外蛋白质合成，90年
代末发展起来的体外展示技术，如核糖体展示
(ribosome display)、mRNA展示(mRNA display)和
DNA 展示(DNA display)有望克服以上难题成为新一
代的展示技术。
1　核糖体展示(ribosome display)
1.1　传统的核糖体展示
1982 年，Korman 等[6]利用免疫沉淀技术从细
胞中成功分离到了“核糖体 - 多肽 -mRN A”三元
复合物上的mRNA。Kawasaki[7]于 1989 年提出可以
应用相似的原理利用无细胞系统进行随机肽库筛选
的专利。Ellinglon和Szostak[8]、Tuerk和Gold[9]于
1990年建立了SELEX( systematic evolution of ligands
by exponential enrichment)技术。1994年，Mattheakis
等[10]在上述工作的基础上首次建立了实用化的多聚
核糖体展示技术(polysome display)。随后的研究表
明，不论是在体内还是体外条件下，核糖体上的新
生多肽的折叠与翻译都是同步进行的[11]，核糖体自
身或核糖体RNA、分子伴侣等都参与了新生多肽的
折叠，新生多肽的正确折叠无需与核糖体解离[12]。
1 9 9 7 年 ， H e 和 T a u s s i n g
[13]、 Hanes 和Plückthun[14]分
别在多聚核糖体展示技术的基础上，通过调整
mRNA 与核糖体的比例至1∶1 使体外翻译产物中主
要是单核糖体复合物，并通过在无细胞体系中添加
824 生命科学 第22卷
分子伴侣和蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide
isomerase, PDI)以确保产生正确折叠的蛋白质，核
糖体展示技术宣告正式建立。
核搪体展示技术的原理如图1所示：首先通过
PCR 扩增用于核糖体展示技术的 DNA 文库。然后
在无细胞翻译系统中进行偶连的转录和翻译。由于
在蛋白质编码区缺乏终止密码子，释放因子 EF 因
不能与核糖体结合，造成翻译过程减速并使核糖体
停留在mRNA 的 3- 末端形成“肽-核糖体-mRNA”
(peptide-ribosome-mRNA，PRM)复合物，然后用相
应的抗原、配体或酶的底物对此核糖体展示的蛋白
文库进行亲和筛选并通过 RT- PCR 获得下一轮展示
的模板，所得DNA进入下一轮富集，部分DNA 可
通过克隆进行测序分析。
图1　ribosome display 流程图[15]
阻碍蛋白质合成的二级结构效应的产生，但是非偶
联的无细胞体系可以通过分别对转录和翻译步骤进
行优化并且可以控制反应体系中mRNA 的添加量以
取得最佳实验效果[19]。2007年Zahnd 等[20]与 He和
Taussig [21]分别就应用这两种无细胞体系进行的核糖
体展示技术的操作步骤进行了标准化的整理和规
范，这必将有利于核糖体展示技术的推广和运用，
使之成为当之无愧的下一代展示技术。
1.2　附加强相互作用的高级核糖体展示(advanced
ribosome-display with strengthened association, ARiSA)
传统的核糖体展示是非共价连接，形成的
PR M 复合物不够稳定，筛选条件严格受限。由于
每轮筛选后能够回收到的 mRNA 产量不是很高，所
以常造成文库多样性的损失。自2002年以来，Taira
实验室先后发展了三种方法来弥补传统的核糖体展
示的不足。这三种方法都是基于引入额外的 RNA-
protein 相互作用使PRM复合物间的联系得到增强，
希望通过形成更加稳定的 P R M 复合物能够增加
m R N A 的回收率，进而提高核糖体展示的筛选效
率。尽管这些方法大多数还处于理论验证阶段，但
有些已经得到实际应用并取得了良好的实验结果。
相信在这些技术在不断改进的基础上一定能够成为
传统核糖体展示的有益补充。
1.2.1　核糖体失活展示系统(ribosome-inactivation
display system, RIDS)
R I D S 的特点是在传统核糖体展示的基础上，
通过在文库DNA模板上随机肽库编码区的下游插入
了一个RTA(risicin A chain)基因，经体外转录后得
到 mRNA，随后在兔网织红细胞裂解系统(rabbit
reticulocyte lysate)中进行体外翻译。由于RTA是真
核生物核糖体大亚基的特异性抑制物，折叠后的
RTA 立即发挥其活性，催化真核生物核糖体大亚基
上23S-28SrRNA毗邻GAGAtetra-loop的一个保守腺
苷的N-糖苷键的水解。这样的一个单点脱嘌呤会改
变延长因子的结合位点，使蛋白质的合成受到抑
制，因为核糖体失活所以释放因子也不能与之结
合，于是核糖体停在mRNA 的终止密码子之前并形
成极其稳定的PRM 复合物(图 2)。由于RIDS 形成
的PRM复合物即使在常温下也非常稳定，而且无需
添加Mg2+ 和 anti-ssrA 寡核苷酸等特殊条件，所以
RIDS更适合那些需要在特殊条件下进行亲和筛选的
功能蛋白的体外选择实验。Zhou 等[18]不但证明了
RIDS 用于体外选择的可行性，而且在2007 年制定
核糖体展示的DNA模板蛋白质编码区后必须有
一段至少23~30 个氨基酸的间隔区才能确保被展示
蛋白质从核糖体上完整地退出，间隔区的长度会影
响展示效率[16-18]。5-末端非编码区和3-末端非编码
区添加茎环结构可有效避免mRNA 的降解[10]，在亲
和筛选过程中维持低温和高浓度的 Mg 2+ 能够防止
PRM复合物的解离，添加anti-ssrA寡核苷酸等都能
有效地提高核糖体展示的效率[15]。对无细胞系统的
选择通常是要依据被展示蛋白的来源和性质。 Rab-
bit reticulocyte lysate产生的主要是单核糖体复合物，
而E.coli S30通常产生的是多聚核糖体复合物。原
核无细胞系统在亲和筛选后需要用EDTA 除去Mg2+
使 PR M 复合物解离，然后才能进行 RT-P C R。而
真核无细胞系统无须 PR M 复合物解离，可直接进
行in-situ RT-PCR。尽管转录和翻译偶联的无细胞
体系更加简单高效，并且可以避免mRNA 的降解和
825第8期 卢明锋：体外展示技术研究进展
了标准化的RIDS 操作程序[22]。
1.2.2　附加TAR-TAT相互作用的核糖体展示
艾滋病毒(H IV)的TAR ( trans-activator respon-
sive ) 区段能与病毒编码的TAT( trans-activator)蛋白
特异性结合调节病毒基因组的复制。2002年Fujita
等[23]提出在被展示蛋白编码区的上游引入TAR下游
引入TAT 的办法可获得了更加稳定的PRM 复合物。
实验结果表明，多个串联的 TAT 适体和 TAT 衍生
物间结合确实获得了超强的RNA-protein 间相互作
用，其表观Kd 低于16 pmol/L。但多个串联的TAT
适体和TAT衍生物之间可能通过反式相互作用形成
复杂的RNA-protein 网络使之失去实际价值。2005
年，Inoue等[24]改用TAT蛋白49~86残基组成的TAT
蛋白衍生物及Kd 降低了近200倍的一个新TAT适体
间的强相互作用使核糖体展示中mRNA 的回收率有
了一定的提高。
1.2.3　附加Cv-MSp相互作用的核糖体展示
2003年，Sawata和Taira等[25]在DNA模板的T7
启动子和SD序列之间插入了一个能形成热稳定二级
结构的 Cv 序列，在表位标签蛋白的下游引入能与
Cv 特异结合的噬菌体MS2 衣壳蛋白二聚体。mRNA
与新生肽之间的连接确实得到了增强，即使在保留
mRNA 上的终止密码子的情况下，PRM 复合物的稳
定性也不影响后续的亲和筛选。2004 年，Sawata
等[26]以多聚核糖体展示的方式验证了该方法可用于
检测蛋白质体外相互作用和体外选择。Wada 等[27]
于2008年将这种后来被称之为高稳定性核糖体展示
(highly stabilized ribosome display)的技术应用于从人
工肽库(artificial peptide library，APL)中筛选金属结
合肽适体，并发现了一个与Co-IR[cobalt(?)complex
immobilized on resin]有特殊亲和性的新的金属结合基
序，证明了该方法用于肽适体的体外选择的可行性
和可靠性(图3)。“highly stabilized ribosome
display”在其他领域的应用值得期待。
图3　“highly stabilized ribosome display”示意图[27]
2　mRNA 展示(mRNA display)
2.1　基于嘌呤霉素技术的mRNA 展示
1997年Nemoto等[28]首先报道了IVV (in vitro
virus)技术，稍后Robert和Szostak[29]也发表了用于
蛋白质体外选择的 mRNA- 肽融合体的文章，mRNA
display由此建立。mRNA display的技术流程见图4。
DNA 文库首先进行体外转录形成 mRNA 文库，然后
通过末端带有嘌呤霉素的寡聚核苷酸连接子上的
DNA间隔区与mRNA的 3-端保守序列进行杂交将两
者连接在一起。当 3- 端带有嘌呤霉素连接子的
mRNA 在无细胞系统中完成体外翻译时，由于嘌呤
霉素是一种相对分子质量小、化学性质稳定的氨酰
tRNA 类似物，可进入核糖体的A 位点，在新生肽
链和嘌呤霉素的O-甲基酪氨酸之间形成稳定的酰胺
键，使mRNA 的 3- 端与多肽的羧基端共价结合起
来后形成稳定的 mRNA- 多肽融合体。利用亲和层
析技术将 mRNA - 蛋白质融合体纯化出来，经 RT-
PCR 形成cDNA- 蛋白质融合体，亲和筛选出同靶物
质结合的 cDNA- 蛋白质融合体，经 PCR 扩增后得
到下一轮筛选 D N A 文库。
最初的mRNAdisplay 是采用夹板法(splint)形成
mRN A - 嘌呤霉素共轭物。由于连接效率较低，最
终的 mRNA- 肽融合体形成率只有 1%~1 0% [ 28 ,2 9]。
2000年，Kurz等[30]在改用带有补骨脂素(psoralen)的
DNA连接子直接通过光交联反应与mRNA 3-末端杂
交，mRNA - 肽融合体形成率提高到了 40%。但这
两种方法都因为有杂交的 DNA 双链序列而影响了
图2　RIDS体外筛选功能蛋白示意图[18]
826 生命科学 第22卷
mRNA 3-端的稳定性。2003年，Miyamoto-Sato等[31]
使用Fluor-PEG Puro (p(dCp)2-T(Fluor)p-PEGp-(dCp)
2-puromycin)连接子通过单链酶连接得到了更加稳定
和高效的共轭嘌呤mRNA 模板，mRNA- 肽融合体形
成率可高达70%，而且引入荧光素标记后无须再进
行放射性标记。先经RT-PCR 形成cDNA- 蛋白质融
合体后再进行亲和筛选，这不但可以降低亲和筛选
过程中 mRN A 的降解，而且反转录形成的 cDN A /
mRNA 的杂交双链也避免了 RNA 二级、三级结构
对体外筛选的干扰。2009年，Tabata 等[32]将 mRNA
display与微流控(microfluidic)系统结合起来用于单链
抗体片段(single-chain Fv, scFv)的体外选择和进化，
获得了每轮体外选择富集106~108 倍的超高富集率，
仅经1~2轮体外选择就从~1012天然随机scFv文库中
获得了高亲和力和专一性的抗体，他们还进一步证
明该方法同样适合蛋白质-DNA和蛋白质-药物间相
互作用的高效体外选择。2009年，Shibui 等[33]通
过对mRNA display富集到目的CDNA-蛋白质融合体
后进行适当稀释后进行PCR 扩增，PCR 扩增产物可
直接用于测序和体外翻译，由此建立了一个完全由
体外系统获得scFv 的方法。
2.2　基于supress tRNA 技术的N-末端融合mRNA
展示
虽然已经建立了多种行之有效的体外展示技术
如ribosome display、基于嘌呤霉素技术的mRNA展
示技术和DNA display 技术等，但这些体外展示技
术大部分都是通过将被编码肽蛋白质的C-末端连接
在编码mRNA 的 3- 末端，所以不适于那些C-末端
是其功能所必需的蛋白质的体外进化。20 03 年，
Sawata和Taira [25]曾利用编码区N-末端融合表达的
MS2 衣壳蛋白二聚体与其mRNA5- 末端的Cv 序列
图4　mRNAdisplay 流程图[15]
间的特异性识别机制将蛋白质的N-末端与mRNA5-
末端连接起来。Doi和Yamagama[34]、Yonezawa等[35]
的“STABLE”技术也可以通过N- 末端融合表达的
链霉亲和素将蛋白质的 N - 末端与亲和素标记的
DNA 模板5- 末端连接起来。由于上述两种方法的
表型与基因型是非共价连接，所以筛选条件受限。
2004 年，Figueiredo 等[36]提出的“DARTs”技术
的原理是共价连接，但至今尚未应用于体外选择。
2007年，Ueno等[37]建立了基于supress tRNA技术
的N- 末端融合mRNA display，原理如图5 所示：
双链 D N A 文库首先被转录成 mR N A。然后，用酰
肼修饰的单链DNA 连接子与mRNA 编码区的上游序
列进行分子杂交，并用 T4 RNA 连接酶进行连接。
此连接产物的酰肼基团随后与被酰基化到琥珀
supress tRNA上的苯丙氨酸衍生物的酰基发生化学
连接。经修饰后的 mRNA 在进行体外翻译过程中，
修饰后的氨酰supress tRNA倾向于占据紧邻起始密
码子下游的琥珀终止子上的核糖体上的A 位点，苯
丙氨酸便被掺入到生长中的肽链。由于直接在起始
密码子的下游插入了一个终止密码子，除非 Sup-
press tRNA携带的氨基酸掺入新生肽链否则翻译过
程即告终止，所以永远不会发生未融合肽与融合肽
之间的竞争。于是，新生肽的 N 端就与编码它的
m R N A 连接在了一起。根据被展示肽的性质筛选
mRNA-peptide 融合文库，通过RT-PCR 获得下一轮
筛选的 DNA 文库。经过多轮筛选后即可通过 RT -
PCR 扩增及测序得到表型分子的遗传型分子序列。
2.3　非核糖体肽的mRNA 展示
非核糖体肽(the nonribosome peptides，NRP)如
环孢菌素A、万古霉素和青霉素等代表着一类在临
床治疗上有重要意义的资源。NPRs 通常会被N- 甲
基化骨架、D- 氨基酸、稀有侧链及糖基化所修饰，
这有利于增强其蛋白酶水解稳定性、对膜的通透能
力以及与靶标的亲和性等。NRP 通常不是由核糖体
合成，不需要 m R N A 模板，而是由复杂的多酶聚
合体即非核糖体多肽合成酶(nonribosomal ptide
synthetases，NRPs)合成，试图通过遗传操作NRPs
生产新型NRP 的难度极大[38]。采用mRNA display
从 mRNA 指导的核糖体翻译产生的组合肽库中发现
类NRP分子就成为了一个很好的备选方案。众所周
知，核糖体能够耐受含有非天然侧链氨基酸类似物
的能力，可以将多种非标准残基掺入肽链。从药理
学的角度看，做为非天然构件的N-甲基氨基酸(N-
827第8期 卢明锋：体外展示技术研究进展
methyl amino acids，N-Meaa)有着特殊的价值，可以
提高蛋白构象的刚性、蛋白酶抗性和跨膜透性[39]。
采用Suppress tRNA技术最多可以将两个非天然氨基
酸掺入到肽链中[40]。2008 年，Kawakami 等[41]引入
遗传密码重新编程的概念，结合弹性酶(flexizyme)
和PURE(protein synthesis using recombinant element)
系统这两种关键技术，成功合成了含有多个N-甲基
化氨基酸和非蛋白氨基酸的多肽。Flexizyme系统是
一个基于核酶的全新的 tRNA 乙酰化系统，可以将
任一氨基酸装载到任一tRNA 上。PURE 系统是一个
全部采用重组元件的体外蛋白质合成系统，其所有
组分可根据需要随意调整。实验原理如图6 所示：
Flexizyme识别N-Meaa酯键上的LG基团和tRNA3-末
端的 3 个保守序列 CCA，完成 tRN A 的氨乙酰化，
将N-Meaa 装载到指定的tRNA 上形成相应的N-Meaa-
tRN A。随后将各种N-Meaa-tR NAs 添加入 wPUR E
(withdraw protein sythesis using recombinant elements)
系统中，由于缺少相应的a a t R N A 合成元件，在
mRNA 上特定密码子位点即可将相应的N-Meaa 掺入到
新生肽链中。与Kawakami采用Flexizyme系统合成
Meaa-tRNA的方式不同，2008年，Subtelny等 [42]采
用的是2004年，Merryman和Green[43]所创造的方法
并加以适当改进，在aatRNA 基础上通过三步化学反
应合成N-Meaa-tRNA。两种方法各有所长，可以彼此
互补不足。结合mRNA display 完全有可能从中得
到具有更好生物稳定性和生物利用度的侯选肽类药
物。遗传密码重新编程更重要意义的还在于，我们
完全可以利用上述两种方法更方便、更经济地合成
由任意氨基酸组成的随机肽库，而无需采用三核苷
酸亚磷酰胺合成子[44]、Multi Line Split DNA Synthe-
sis [45](MLSDS)或通过调整密码子特定位点碱基组成
的方式来得到仅由几种有限的氨基酸组成蛋白质文
库。这对筛选具有新折叠类型的天然蛋白质和研究
蛋白质折叠起源问题十分有利。
3　DNA展示(DNA display)
3.1　基于体外区隔化(in vitro compartmenta-lisation，
IVC)的 DNA 展示
1998年，Tawfik和Griffiths[46]模拟天然细胞用
液滴直径~2 μm体积~5fl的乳胶囊将底物偶联的编
码DNA 与表达产物通过IVC 形成人工细胞。这种方
法仅通过乳胶囊中的小液滴就可将基因型与表型连
接在一起，目前已成功用于 D N A 甲基转移酶 M .
HaeIII、限制性内切酶及DNA 聚合酶的体外选择和
进化[47 ]。1999 年，Doi 和 Yanagawa [3 4]建立的
“STABLE”(streptavindin-biotin linkage in emulsions)
display通过在IVC形成的w/o乳胶囊中将DNA编码
的链霉亲和素融合蛋白与生物素标记的编码DNA分
子非共价连接在一起，DNA 回收率能够达到 95%。
2002年，Sepp等[48]建立的Microbead display是通过
链霉亲和素包被的聚苯乙烯微珠将被展示蛋白质与
生物素标记的编码DNA 物理连接在IVC 形成的乳胶
囊中，单个的微珠用流式细胞仪进行荧光素激活的
细胞分选(fluorescence-activated cell sorting，
FACS)。尽管FACS 的筛选通量可高达105/s，但受
流式细胞技术的限制只适用于容量 ~109 文库的选
择。由于在同一个微珠可以同时结合上百个基因表
达产物，所以Microbead display非常适合结合性
低、专一性高蛋白的筛选。Microbead display最大
的优点还在于它不必仅通过与过渡态类似物或酶的
图6　遗传密码重新编程条件下的mRNA指导的N-甲
基多肽合成示意图[41]
图5 mRNA-肽N-末端融合技术示意图[37]
828 生命科学 第22卷
抑制剂结合能力来进行酶的筛选，而可以同时针对
酶的底物识别能力、特定产物的形成能力、酶的催
化速率和周转率等全部性质进行选择。200 3 年，
Griffiths和Tawfik[49]采用Microbead display从一个3.
4×107的磷酸三酯酶突变文库中选择到一个比野生型
酶的催化效率高 6 3 倍的磷酸三酯酶。2 0 0 4 年，
Bertschinger和Neri [50]描述了一种共价连接的DNA 展
示。通过PCR 在 DNA 文库分子的3- 末端引入5-
GGFC-3(F代表5-荧光素脱氧胞嘧啶)序列，然后与
体外转录/ 翻译混合物共包裹于w/o 乳胶囊中。在
体外翻译过程中，由于 DNA 编码的随机多肽 N- 端
融合表达的DNA甲基转移酶M.Hae III 可以与5-
GGFC-3 序列上的F 形成共价键，所以基因型与表
型间是通过共价键连接在一起的。从理论上看，
2004年，Figueiredo等[36]通过融合表达的VirD2酶活
性将表型和基因型共价连接在一起的DARTs(DNA/
protein attachment and recovery tools)展示系统也可
采用IVC 的形式实现。2009 年，Sumida 等[51]发挥
了基于 I V C 的 D N A 展示的独特优势，在
“STABLE”技术的基础上建立了适用于Fab 片段的
体外选择的双顺反子 DNA 展示。与其他体外展示
只能应用于scFvs 的体外成熟不同，由于无需删除
DNA 文库模板上的终止密码子，所以可以编码多个
开放阅读框，非常适合于寡聚蛋白和异源二聚体
Fab片段的体外选择。Yanagawa 的实验证明采用热
处理作为选择压力能够从一个保守区的疏水核心被
随机化的Fab片段文库中选择到了更加稳定的Fab片
段的编码基因。
3.2　顺式展示技术
基于IVC的DNA display具有与表型相连的基因
型是 DN Ａ模板所以更加稳定，能够在一些特殊条
件下进行选择。但受乳胶囊液滴体积的限制，文库
容量最大只能达到109~1010，远小于其他体外展示
技术1012~1014的文库容量[47]，这在筛选结果的亲和
力和特异性与展示文库的库容成正相关的情况下是
非常不利的。而且要形成大小合适的人工细胞往往
需要掌握一定的技巧，DNA 模板浓度也要随人工细
胞的体积进行相应的调整才能实现人工细胞中的单
基因分布方式[52]。2000年Gerald[53]提出利用具有自
身模板识别功能的反式作用因子介导分子文库基因
型与表型特异性连接的构想, 并指导其课题组相继建
立了以CIS 系统和共价抗体展示技术(covalent anti-
body display, CAD ) 为代表的两种新的DNA 展示技
术, 统称为顺式展示技术。这两种技术均不需IVC，
文库容量能够达到1012，既弥补了IVC 的不足，又
保留了DNA 展示的优点。在R1 等 IncB 质粒的复制
过程中，RepA 蛋白与ori 区的结合是复制起始的基
础。在RepA与ori区之间有一个被称为CIS的顺式
作用元件，该元件具有 Rho 依赖的转录终止子活
性，在转录过程中引起 RNA 聚合酶在DNA 模板上
的停顿，新生的RepA 专一性地结合到CIS 区，并
立即在CIS的引导下与自身模板DNA的ori区特异性
结合，进而实现基因型与表现型之间的特异性连
接。2004年，Odegrip 等[54]利用RepA的顺式活性建
立了CIS展示系统，目前该技术已经被英国isogenica
公司作为核心技术用于无细胞人工突变等方面的研
究。2005年，Reiersen 等[55]利用P2 噬菌体复制起
始蛋白P2A 的共价顺式活性构建了新的CAD 系统，
不过其筛选过程效果欠佳，尚待改进。
4　小结
尽管公开发表的成功的体外选择实例绝大多数
是采用核糖体展示和mRNA 展示，但目前还很难预
测将来哪一种技术会成为主导。核糖体展示原理简
单、文库容量大、技术成熟和易于操作，因而在
肽、scFv、配体结合蛋白及酶等多个领域得到广泛
应用并取得成功。mRNA 展示因采用嘌呤霉素小分
子实现了表型与基因型间的共价连接，所以具有很
多优势。mRNA 展示弥补了核糖体展示形成的PRM
复合物稳定性不足的缺点，可在极端条件下进行
体外选择。mRNA 展示可获得最大的文库容量(1.4
×1014)，随机区段也最长，可在108 个残基中进行
连续80个氨基酸的随机化，在最大限度的探察蛋白
质空间方面具有得天独厚的优势[5 4 ]。不仅如此，
mRNA 展示在 N 端展示、非核糖体肽等非天然蛋白
质或多肽的体外展示及通过构建天然肽库在蛋白质
组水平上研究蛋白质间相互作用关系等方面也有其
独到之处[55]。但由于mRNA display需要对mRNA及
嘌呤霉素 -mR NA 连接产物的进行纯化，作为技术
关键的连接子也需进行复杂的化学反应合成，在没
有建立相关技术平台的实验室难以开展，所以限制
了该技术的推广应用。公平地讲各种体外展示技术
各有所长，彼此可以弥补不足，这给各个实验室依
据自身实验条件和实验目的合理选择适当的技术体
系提供了空间。相信随着各种体外展示技术的进一
步成熟与发展，必将在新药研发、酶及抗体的体外
829第8期 卢明锋：体外展示技术研究进展
选择等相关领域取得更大的成功。
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