全 文 ：生命科学
Chinese Bulletin of Life Sciences
第22卷 第7期
2010年7月
Vol. 22, No. 7
Jul., 2010
文章编号 ：1004-0374(2010)07-0616-07
收稿日期：2010-04-01
基金项目：国家自然科学基金杰出青年科学基金
(30525022); 国家重点基础研究发展计划(“973”项目)
(2010CB912800，2009CB521706)
*通讯作者：E-mail: songerwei02@yahoo.com.cn;
songew@mail.sysu.edu.cn
R N A 干扰体内导入技术研究进展
姚燕丹，宋尔卫*
(中山大学附属第二医院乳腺外科肿瘤中心，广州510120)
摘　要：RNA干扰 (RNA interference, RNAi) 是一种发展迅速并具有广阔应用前景的基因控制技术，它
能特异性地沉默内源或外源性靶基因，已成为基因治疗的有效手段。然而，利用 R N A 干扰技术进行
体内基因沉默的主要障碍是如何实现 siRNA 和 miRNA 的体内安全高效输送导入。该文结合国内外进展
和本课题组在 R N A 干扰方面的研究成果，对 R N A 干扰体内导入技术作一综述。
关键词：R N A 干扰；s i R N A ；m i R N A ；基因治疗；技术
中图分类号：Q52; R730.59　　文献标识码：A
Delivery technology of RNA interference in vivo
YAO Yan-dan, SONG Er-wei*
(Breast Tumor Center, Sun Yat-Sen Memorial Hospital, Sun Yat-Sen University, Guangzhou 510120, China)
Abstract: RNA interference (RNAi) is a rapidly developing technique and has the prospect of genetic
manipulation techniques. It can silence specific endogenous or exogenous target gene, and has become an
effective means of gene therapy. However, how to achieve the efficient delivery of RNA interference in vivo is
still a major obstacle. Here, together with study abroad and our group’s achievements, we summarized the delivery
techniques of RNA interference in vivo.
Key words: RNAi; siRNA; miRNA; gene therapy; technique
RNA干扰(RNA interference, RNAi)能特异性地
沉默内源或外源性靶基因，是一种发展迅速并具有
广阔应用前景的基因控制技术[1]。自 2001年 Tuchl
等发现siRNA 能在哺乳动物细胞内高效沉默目标基
因的表达后，生命科学领域掀起了对siRNA 的基础
和应用研究的热潮。有关小分子RNA的研究不仅多
次入选Science 杂志一年一度的十大科技突破，而
且作为其代表的RNA干扰技术的发现者还于2006年
获得诺贝尔生理或医学奖。R N A 干扰包括应用
siRNA 或 miRNA 进行基因控制，这项技术不仅可应
用于基础研究，还有望成为攻克肿瘤、艾滋病、遗
传性疾病或神经系统疾病等疾病的新型武器。
siRNA(short interference RNA)是双链RNA分子
进入细胞之后被称为Dicer的RNase Ⅲ类酶剪切而产
生的21~23 nt大小的双链小RNA分子[2]。siRNA 在
疾病中的应用范围很广，其主要适应症是恶性肿瘤
和病毒感染性疾病的治疗研究。RNA 干扰的作用机
制是通过dsRNA (双链RNA) 经外界进入细胞或合成
后由核内通过转运蛋白运输到胞浆中, 被Dicer酶识
别并加工成21~23 nt 长度的短双链RNA，反义链
RNA 使特定靶基因的mRNA 降解, 从而抑制靶基因
的表达并产生相应的生物学效应。与其他抑制基因
表达的方法相比，siRNA 技术应用于治疗恶性肿瘤
等重大疾病的优点在于特异性高、效能强，几乎所
有的基因都能被沉默，而且简便和相对安全，所以
很多科学家都致力于应用siRNA 治疗疾病的研究。
我们率先在整体动物疾病模型中研究siRNA，证实
了siRNA 在小鼠肝炎中的治疗潜能。
617第7期 姚燕丹，等：R N A 干扰体内导入技术研究进展
m i R N A 参与基因转录后水平调控，在肿瘤发
生、发展、转归中起着重要作用，成为肿瘤生物治
疗领域一个新亮点[3-5]。miRNA 介导的RNA干扰的作
用机制是内源性的miRNA被RNase III酶Drosha识别
并加工为一个长度为70 nt呈长发夹结构的前体miRNA,
接着前体 miRNA 被 Dicer 酶识别并加工成长度为
21~23 nt 的短双链RNA，其中反义链miRNA 与目
标mRNA 形成不完全互补结合降解靶基因的mRNA,
从而抑制靶基因的表达。miRNA 通过调控癌基因或
(和)抑癌基因的表达参与肿瘤细胞增殖、分化、凋
亡、迁移、血管生成和蛋白裂解等生物程序的调
控，与癌细胞的恶性表型密切相关。因此，利用
病毒或脂质体载体系统输送具有抑癌基因作用的
miRNA，可用于治疗某些特定的肿瘤。在国内我们
率先研究发现miRNA-let-7对乳腺癌干细胞的调控作
用，进一步对let-7进行干预研究证实了这种调控作
用，研究结果证明了miRNA 治疗癌症的巨大潜能[6]。
虽然，利用siRNA 和 miRNA 进行RNAi 有巨大
的治疗潜能。然而，R N A 干扰技术实现体内基因
沉默的主要障碍是如何获得高效安全的输送体系将
目标基因的siRNA 或 miRNA 输送到体内。目前研究
中常用到的输送体系，如病毒载体、高压静脉注射
等方法在实际临床应用中受到明显的限制，很难广
泛应用[7,8]。另外一些方法将siRNA直接送到靶部位
如皮肤[9]、眼睛[10]、肺[11]或中枢神经系统[12]，具
有一定应用潜能，但与系统全身给药仍有一定的差
距。近年来，进入临床试验的siRNAs 新药都直接
采用局部给药，从而避免了体内输送给药所面临的
复杂问题。然而，为了应用 RNAi 治疗癌症和其他
疾病，采用全身导入给药施行RNAi 非常必要。最
佳的体内全身系统输送给药体系必须具备以下要
素[13,14]: (1) 输送体系必须具有良好的生物相容性、
生物可降解性和没有免疫源性；(2) 输送体系可以有
效地把siRNA 或 miRNA 输送到靶细胞或组织内，并
保护有活性的siRNA 或 miRNA 逃避血清核酸酶的攻
击；(3) 输送体系能把siRNA 或 miRNA 富集到靶细
胞或组织中，避免肝脏和肾脏的清除；(4) 该输送
体系和siRNA 或 miRNA 通过内吞进入细胞后，可以
释放 siRNA 或 miRNA 到胞浆中，从而产生RNA 干
扰后效应。下面具体介绍 RNAi 的体内输送体系。
1　siRNA 体内输送体系
1.1　基于脂质的siRNA体内输送体系
基于脂质的输送体系一般由脂质体、微粒、乳
剂和固态的脂质纳米粒组成。目前已有多个基于脂
质的输送体系被开发应用于siRNA 的体内输送。对
基于脂质的 siRNA 体内输送体系来说，脂质混合
物、siRNA 与脂质的比例、颗粒大小以及制作工艺
都必须经过优化。在诸多合成的siRNA 输送体系当
中，脂质体载体是最吸引人的运载工具之一。这是
由于该输送体系具有以下优点：简单的利用所带的
阳离子就能结合运载带负电荷的siRNA；具有较高
的转染效率；能增强药物代谢动力学；这个体系
的毒性和免疫源性较低。而且，阳离子脂质体还具
有能保护 s i R N A 不被核酸酶降解，减少肾脏对
siRNA的清除等优点。自从1980年首次应用阳离子
脂质体 D O T M A 输送质粒 D N A 进入哺乳动物细胞
后，其他阳离子脂质体的研究不断涌现[15]。在2000
年之前，大多数基于脂质体的体内输送体系都用于
输送质粒DNA进入细胞或组织中[16]。直到siRNA 作
为潜在新药到来之后，阳离子脂质体从主要用于输
送 DNA，转而应用于输送siRNA。众所周知，阳离
子脂质体的结构决定阳离子脂质体输送体系的转染效
率和毒性。不同长度的烃链影响阳离子脂质体的细
胞毒性[17]。
尽管大多数基于脂质的siRNA输送体系以脂质
体为主要组分，但是还有其他基于脂质的体系被成
功开发应用于siRNA 的输送。阳离子固态脂质纳米
粒就是其中的一种，它由胆固醇酯、甘油三酯、胆
固醇、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)和 3-[N (N,N
二甲基胺乙基) 胺基甲酰基] 胆固醇组成，并与
siRNA和聚乙二醇(siRNA-PEG)通过静电作用形成可
逆性结合[18]。Kim等[18]报道利用固态脂质纳米粒输
送siRNA 能有效地抑制靶基因的表达和保持一定的
血液稳定性，并且细胞毒性较低。Morrissey 等[19]
将核苷酸脂质纳米粒(SNALPs)应用于鼠、豚鼠和非
人类的灵长类动物等动物体内 siRNA 输送研究评
估。SNALP 由包含有阳离子和致融脂质的双层脂质
组成，这种脂质能通过内吞作用进入胞内，并可由
内涵体释放出siRNA[20]。SNALPs 的表面包裹连接
中性亲水的聚乙烯乙二醇，这种结构在合成过程中
在外部对颗粒起稳定作用。在鼠乙型肝炎疾病模
型，首次应用SNALPs 携带针对乙型肝炎病毒特异
的siRNA，结果显示可以有效地抑制乙型肝炎病毒
的复制。尽管基于阳离子脂质体的输送系统已经证
明siRNA 作为人类治疗药物的潜能，但是仍有很多
问题亟待解决。迄今为止，很多研究都着眼于
siRNA 的应用，而很少探讨载体或siRNA 可能存在
618 生命科学 第22卷
的毒性。有几项研究发现体内给予脂质和 siR N A
后，实验鼠没有发生不确定的干扰素反应[21,22]，但
仍需进一步研究基于阳离子脂质体和脂质输送体系
的生物安全性，包括从结构上不断优化基于脂质的
输送体系，使这类输送体系可以预见的毒性降到最
低。
1.2　纳米材料介导的siRNA体内输送体系
基于纳米材料的输送体系已经广泛应用于输送
DNA，近年来开始应用于输送siRNA，应用最多的
是聚合物输送体系。自1990年阳离子聚合物应用于
输送质粒 DNA 以来，已经积累了较多的经验。与
基于脂质的输送体系类似，聚合物输送体系通常包
含有一个带阳离子的核心部分。虽然siRNA 在相对
分子质量、投料比、稳定性和作用方式等方面与质
粒 DNA 都有明显的差别，但是由于两者都是核苷
酸，在体内输送的很多方面有共同的特性。因此，
聚合物介导的DNA体内输送体系为siRNA 体内输送
治疗体系的发展提供许多有益的参考信息[23]。通常
阳离子聚合物分为人工合成和天然高分子。人工合
成的聚合物包括分支和线性的PEI、PLL 和环糊精
多聚阳离子；天然阳离子聚合物有壳聚糖、去端肽
胶原和阳离子多肽。基于阳离子聚合物的优越性在
于siRNA 和聚合物复合物的结构简单，不像阳离子
脂质体那样需要多个操作步骤，阳离子聚合物通常
只需与带负电荷的 siRNA 简单混合就能形成复合
物。作为一种广泛应用的阳离子聚合物，PEI 有比
较宽的相对分子质量范围和多个质子化的氨基，故
而在生理 p H 条件下可以形成比较高的电荷密度。
PEI 和核苷酸复合物通过PEI 上带正电荷的氨基和
DNA 或 RNA 上带负电荷的磷酸基之间的静电作用而
获得 [24]。PEI优于其他聚合物之处在于其转染效率
较高。由于 PEI 的“质子海绵效应”特性，可以
在低 pH 值的内涵体内起缓冲作用，并释放出核苷
酸到胞浆[25]。尽管PEI作为体内输送载体具有以上
的优势，但其存在细胞毒性。Fischer 等[26]研究发
现PEI在很多细胞系中可以通过类似细胞坏死和凋
亡等机制诱导细胞死亡，而且这种细胞毒性可以随
着PEI 相对分子质量的增大和分支的增多而增大。
研究显示在PEI与siRNA通过静电作用复合后去除游
离的PEI 可以降低其毒性。
为了减少PEI相对分子质量较大所带来的细胞
毒性和提高其对核酸酶的耐受性，不同长度的PEG
被引入PEI反应中合成嵌段共聚物[27]。用PEI和PEG
合成生物可降解阳离子聚合物用于输送 siRNA(图
1)，并通过提高PEG的亲水性以降低共聚物的细胞
毒性，提高弱水溶性的PEI和 siRNA 复合物的水溶
性，再通过伯胺反应将可降解键引入PEI使聚合物
能自降解，该聚合物有较好的输送能力。PEG 可以
形成一个防护层以减少体内环境中的降解酶或蛋白
对可降解键结构的降解。王均研究组用 PEG、PEI
和 PPEEA 合成生物可降解阳离子聚合物用于输送
siRNA，该共聚物能成功地与siRNA 结合形成复合
物(图1)，而且该共聚物与细胞的生物相容性相当
好，并将聚合物siRNA 复合物成功输送到目标细胞
发挥沉默基因表达并产生相应的生物学效应[2 8 ]。
Kim等[29]利用一种能与siRNA 起静电作用的阳离子
聚合物PEI 、对立体结构起稳定作用的PEG以及有
靶向血管内皮细胞作用的RGD多肽三种主要嵌段合
成共聚物，并用这种纳米材料进行治疗研究。以每
只鼠40 μg 的量将VEGF 受体特异的siRNA 与 PEG-
PEI-RGD 聚合物复合后通过鼠尾静脉给药。研究结
果显示，PEG-PEI-RGD 聚合物介导的VEGF siRNA
图1 阳离子聚合物与siRNA简单混合后形成聚合物siRNA复合物
619第7期 姚燕丹，等：R N A 干扰体内导入技术研究进展
全身给药治疗可以抑制病毒诱导的血管形成和疱疹
性角膜炎引起的损伤。众多的体内输送的成功例子
说明聚合物介导的siRNA 体内输送体系就如基于脂
质的输送体系一样充满希望。
1.3　siRNA的键合输送体系
在非病毒载体介导的siRNA输送体系中，阳离
子脂质和纳米材料扮演重要的角色，并取得了巨大
的成功。在这些阳离子输送体系中，输送载体与带
负电荷的siRNA 通过静电作用复合。尽管这些输送
系统已经取得巨大的进步，但这些体系还必须解决
包括免疫反应、脱靶效应和颗粒大小控制等问题，
科学家们仍需继续探索其他siRNA导入方法[30]。另
一个体内输送策略是把siRNA直接连接到可以靶向
的部分或能增强细胞内吞作用的特殊载体[31]。由于
这种输送体系中只有siRNA 具有治疗作用，siRNA
与功能肽、亲脂分子、P E G 和配体等多种材料连
接，以增强输送效果。有几个研究发现siRNA 以键
合结合的方式与细胞穿膜肽(CPPs)连接，可以增强
体外细胞siRNA 的药物输送。与TAT肽的连接可以
促使siRNA内吞到细胞内，并产生RNA干扰效应[32]。
CPPs这种穿膜输送肽主要是通过与siRNA的巯基连
接形成二硫键，这个键在胞浆中易受破坏。在多个
哺乳动物细胞系的研究证实，CPP 连接输送siRNA
对目标基因的表达起明显的RNA干扰效应。由于阳
离子肽与阴离子的siRNA 连接后使肽趋向中性，可
能会在一定程度上削弱 CPPs 肽的穿膜效率。由于
这种材料存在影响细胞膜和免疫源性等细胞毒性，
而且已有报道证实用CPP行 siRNA 体内输送可以诱
导机体产生免疫应答，所以CPP用于siRNA 体内输
送的安全性仍需进一步的研究。
另一个比较有应用前景的亲脂的siRNAs体内输
送载体是胆固醇结合物。经鼠尾静脉注射给予胆固
醇和ApoB siRNA的结合物可以抑制肝脏和空肠目标
靶基因 Ap oB 超过 5 0% 的蛋白表达，同时也减少
ApoB 的血清蛋白水平。在药物代谢动力学研究发
现放射标记的胆固醇 siRNA 结合物的半衰期为 95
min，而游离的siRNAs 的半衰期为6 min。半衰期
延长的原因可能是由于胆固醇与siRNA 的这种结合
促进siRNA 与血清蛋白如白蛋白等的结合。在这个
研究中需给予50 mg/kg的高剂量siRNA，必须继续
研究进一步优化改良体内的最低有效剂量，使给药
方案能适合临床应用需要[32]。
1.4　受体介导的RNAi体内输送体系
通过细胞表面特异的受体可以选择性地导入
siRNA 或 miRNA 等基因物质，这些受体种类很多，
其中一个例子是存在于部分乳腺癌细胞或卵巢癌细
胞表面的 Her2受体。因为 Her2受体只大量表达于
癌细胞表面，在正常组织细胞中表达甚少，这也是
癌细胞具有恶性表型的机制，所以可以作为靶向导
入的目标。另外，Her2 受体与配基或抗体结合后，
可通过细胞内吞作用循环到细胞内。研究证明，
Her2受体/抗体复合物被吞入细胞后，复合体会被
分离，如果复合体同时结合了化疗药物或基因物
质，这些物质将会被吸收并释放到胞浆中。因此，
Her2抗体或配基携带的抗癌药物只攻击Her2高表达
的癌细胞，并能顺利把药物带入细胞内[33]。
我们通过靶向Her2乳腺癌单链片段抗体融合蛋
白证明了这种导入方法的细胞专一性，也证明了这
种导入方法可以广泛的应用于靶向其他细胞表面受
体(图2)[34]。 由于单链片段抗体融合蛋白不是通过形
成共价键的形式与siRNA 结合，所以可以用同一个
融合蛋白导入多个不同的siRNA。 所有这些结果都
图2 融合蛋白与siRNA形成复合物并将siRNA靶向导入受体阳性的肿瘤细胞
620 生命科学 第22卷
证明了 siRNA 可以通过这个输送体系导入全身系
统，并且可以只靶向表达特殊表面蛋白的细胞。细
胞专一性靶点既可减少起治疗效果所需要的siRNA
量，也可减少 siRNA 的潜在毒性。这些例子大概
是目前开发以siRNA 为基础的药物首次采用的全身
导入策略，其他用来导入DNA质粒进行基因治疗的
方法，如脂质体和免疫脂质体等适合导入质粒编码
的siRNA前体——shRNA，也可导入siRNA或siRNA
前体。在一项肺癌肝转移的研究中，反复注射含有
直接针对bcl-2基因siRNA的脂质体(每次10 mg/kg，
共给药10 次)，可以抑制肿瘤生长。与此相似，近
来有研究利用包含有靶向细胞表面分子siRNA 的纳
米微粒进行全身导入，研究出又一种新的 siRNA 导
入方法。杨安钢研究组也成功构建并表达人抗
HBsAg 单链片段抗体融合蛋白用于siRNA 的靶向输
送，体内外研究均证实这种融合蛋白能够结合并输
送siRNAs 和 siRNA 表达质粒到达HBsAg 阳性细胞，
并有效抑制HBV 基因的表达和病毒复制[35]。
近年来，另一个受体介导的核苷酸适配体输送
体系在siRNA 得到应用。该适配体是近年来发展起
来的一类新型靶向识别分子，由于其具有相对分子
质量较小，可化学合成、稳定性好、生物安全性
高等优点，受到了人们的广泛关注。最近，核苷
酸适配体输送体系在靶向T 细胞的siRNA 体内输送
研究在动物模型中也得到证实[36]。研究将一个由
CD7 特异的单链片段抗体和含有9 个精氨酸的阳离
子寡核苷酸短肽的结合物(scFvCD7-9R)应用于靶向
输送T 细胞的特异siRNA 到人源化鼠。这种抗体结
合物能够把抗病毒的siRNAs 靶向输送到幼稚T 细
胞，并抑制受感染鼠HIV 病毒的复制。还有Bunka
和Stockley[37]应用适配体和siRNA组成的嵌合体进行
siRNA 的靶向输送，利用的是适配体与膜抗原的结
合反应。有研究使用能够特异结合前列腺特异的膜
抗原蛋白(PSMA) 的嵌合体进行靶向输送，并随后
经内吞到细胞内。研究发现嵌合体RNA 能特异结合
到 P S M A 的细胞，而不结合到其他细胞。在体内
siRNA 输送研究中，这种适配体和siRNA 的嵌合体
介导的RNA干扰可以安全的输送到体内，并沉默目
标基因的表达。
因为适配体能选择性结合到相应的蛋白和受体，
并且具有比较低的免疫源性，其替代抗体的潜能有
广阔的应用前景。然而，这一嵌合体中核苷酸的稳
定性应进一步提高以便于应用到体内输送治疗。还
有，适配体连接siRNA 后不是以自然状态存在，可
能在细胞内生物学过程和RNA干扰效应方面与自然
状态的siRNA 有所区别。仔细设计出稳定而有效的
适配体和siRNA 复合物将是未来发展的必要条件。
2　miRNA 的体内输送体系
miR NA 是基因表达的小分子 RNA，与细胞发
生发展分化增殖和凋亡等生物学过程密切相关。利
用miRNA 行 RNAi 的治疗策略是基于miRNA 表达的
高低变化明显影响细胞的生物学行为[3]。miRNA 的
导入方法大致上与siRNA 的体内导入方法相似。适
合 siRNA 体内输送的体系是否可以简单地套用到
miRNA 的体内输送，仍需相关研究进一步验证。最
近，有研究用腺相关病毒导入miRNA 的替代疗法治
疗肝癌。该研究表明，肝癌(HCC)细胞miR-26A 的
表达水平较正常细胞低。miR-26A 表达量的增加，
可通过调节cyclins D2 和 E2进而诱导细胞周期阻
滞。通过腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)
导入miR-26A 到鼠肝癌模型体内可以抑制肝癌的增
殖，诱导肝细胞凋亡，从而阻止肝癌恶化，而且
该方法没有明显的毒性[38]。研究提示对于这种在正
常组织中表达较高而在细胞病理状态下表达降低的
miRNA，miRNA 替代疗法是一种较好的治疗策略，
而且腺病毒这种导入方法没有明显的毒性。从更为
技术性的角度看，该研究报道的改良重组腺相关病
毒载体(recombinant adeno-associated virus，rAAV)
使 miRNA 的输送效率大大增加。rAAV 载体是目前
惟一没有引起人类宿主任何病理反应的载体，具有
低免疫原性以及长期稳定表达携带的外源基因等特
点，已经成为神经系统疾病的新型基因治疗工具。
就像其他 DN A 病毒，腺相关病毒不会整合到基因
组，因此较少引起插入突变等风险。仍需进行更深
入的研究进一步优化miRNA 的输送系统，尤其是要
努力提高其在人体使用的安全性和有效性。
miRN A 参与基因转录后水平调控，在肿瘤发
生、发展、转归中起着重要作用，成为肿瘤生物
治疗领域一个新亮点。毫无疑问，基于 miRNA 的
体内输送策略和靶向调控治疗将是一个充满希望和
挑战的研究领域。
3　RNA 干扰体内导入应用前景
从RNA干扰技术的发明到今年短短的10年时间
里，RNA 干扰在疾病治疗方面取得了飞速的发展和
令人瞩目的成就。最近几年国内外学者在包括
siRNA 和 miRNA 药物在内的核酸药物的研究和输送
621第7期 姚燕丹，等：R N A 干扰体内导入技术研究进展
方面取得了丰富的研究积累。我们在国际上最早自
整体动物疾病模型中证实小干扰 RNA 的治疗效果
后[39]，还利用融合鱼精蛋白的单链片段抗体高效输
送siRNA [34]。王均等在国际上率先开展利用生物相
容性PEG、PEI 和 PPEEA 组成高分子胶束纳米材料
输送siRNA 的研究 [28]，并发展了同时输送小干扰
RNA 和小分子化疗药物的高分子胶束纳米粒和高分
子纳米凝胶载体系统，在细胞和动物实验中初步证
明了其协同作用。我们在癌症治疗的基因靶标及肿
瘤干细胞的调控方面也有新的突破性的发现，发现
miRNA-let-7对乳腺癌干细胞具有调控作用[6]，进一步
地研究显示，采用核酸药物载体，导入 miRNA 分
子可以调控癌干细胞的功能，显示miRNA 在癌症等
重大疾病治疗中具有重要应用前景。这些研究为
RNA 干扰技术的临床应用奠定了良好的基础。这项
技术迅速在临床上推广，目前迫切需要解决的问题
仍然是其给药载体和给药方式，特别是适合全身系
统给药的载体体系，能将 RNAi 药物准确送入特定
组织和细胞，并发挥高效功能。
[参　考　文　献]
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