全 文 ：第 １２卷第 ４期
２０１４年 ７月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ４
Ｊｕｌ􀆰 ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０４􀆰 ００９
收稿日期：２０１３－０５－２７
基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金（２００８０２９５１０３６）；国家自然科学基金（３０８０００１８，３０９７００５８）；工业生物技术教育部重点实验室主
任基金（ＫＬＩＢ－ＺＲ２００８０１）
作者简介：袁春伟（１９８８—），男，山东临沂人，硕士研究生，研究方向：发酵过程控制及分离提取；张震宇（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｚｙ＠
ｇｍａｉｌ􀆰 ｃｏｍ
重组大肠杆菌 ＢＬ２１（ｐＵＣ１９ Ｈｙｐ）产羟脯氨酸的
补料分批培养
袁春伟，何艳春，张胜利，张震宇
（江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 ２１４１２２）
摘　 要：利用自主构建的组成型重组大肠杆菌 ＢＬ２１（ｐＵＣ１９ Ｈｙｐ）为出发菌株，运用间歇流加、指数流加和恒速流
加 ３种流加 Ｃ源的方式进行补料分批培养。 结果表明：在装液量为 ４ Ｌ的 ７ Ｌ发酵罐中，以 ０􀆰 ３０ ｇ ／ ｍｉｎ恒速流加为
最优，在发酵 ４４ ｈ时，羟脯氨酸的质量浓度达到最高，为 ４２􀆰 ５０ ｇ ／ Ｌ，脯氨酸转化率为 ８１％，此时细胞干质量为 ２１􀆰 ３３
ｇ ／ Ｌ，残糖质量浓度为 ０􀆰 １７ ｇ ／ Ｌ。 Ｌ 羟脯氨酸含量与摇瓶发酵时的 １􀆰 ３９ ｇ ／ Ｌ相比，提高了大约 ３０倍，比日本株式会
社的发酵产量提高了 １􀆰 ５０ ｇ ／ Ｌ，发酵过程中糖酸转化率约为 ４􀆰 ０ ∶１。 发酵液中的氨基酸分析结果表明，除脯氨酸、
羟脯氨酸外的其他氨基酸质量浓度均低于 ０􀆰 １ ｇ ／ Ｌ，发酵液中主要氨基酸为脯氨酸和羟脯氨酸。
关键词：恒速流加；大肠杆菌；羟脯氨酸；重组
中图分类号：ＴＱ４６４．７　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０４－００４３－０６
Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ ｂｙ ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｎｏｖｅｌ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ｐＵＣ１９⁃Ｈｙｐ）
ＹＵＡＮ Ｃｈｕｎｗｅｉ，ＨＥ Ｙａｎｃｈｕｎ，ＺＨＡＮＧ Ｓｈｅｎｇｌｉ，ＺＨＡＮＧ Ｚｈｅｎｙｕ
（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ， Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ， ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｉｎ ｏｕｒ ｌａｂ， ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｏｂｊｅｃｔ ｏｆ
ｓｔｕｄｙ． Ｔｈｒｅｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｗａｙｓ ｏｆ ｃａｒｂｏｎ ｓｏｕｒｃｅ ｆｌｏｗ： ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ ｆｌｏｗ ａｄｄｉｔｉｏｎ， ｉｎｄｅｘ ｆｌｏｗ ａｄｄｉｔｉｏｎ ａｎｄ
ｃｏｎｓｔａｎｔ ｓｐｅｅｄ ｆｌｏｗ， ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ．
Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｗａｓ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｓｐｅｅｄ ｆｌｏｗ ｗｉｔｈ ０􀆰 ３０ ｇ ／ ｍｉｎ． Ａｆｔｅｒ ４４ ｈｏｕｒｓ ｏｆ
ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌ⁃ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ ｗａｓ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｏｆ ４２􀆰 ５０ ｇ ／ Ｌ； Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｌｉｎｅ
ｗａｓ ８１％； ｒｅｓｉｄｕａｌ ｓｕｇａｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ０􀆰 １７ ｇ ／ Ｌ． Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｓｈａｋｉｎｇ ｆｌａｓｋ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ １􀆰 ３９ ｇ ／ Ｌ， Ｌ⁃ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｂｏｕｔ ３０ ｔｉｍｅｓ ａｎｄ ａｔ ｔｈｅ ｓａｍｅ ｔｉｍｅ． Ｉｎ
ｔｈｅ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ， ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔ ｏｆ Ｌ⁃ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ ｗａｓ ａｂｏｕｔ
４􀆰 ０ ∶１． Ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｉｎ ｔｈｅ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｌｉｑｕｉｄ ｓｈｏｗｅｄ ｐｒｏｌｉｎｅ ａｎｄ Ｌ⁃ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ ｗｅｒｅ
ｔｈｅ ｍａｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｃｏｎｓｔａｎｔ ｆｅｅｄｉｎｇ；Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ；ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ；ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
　 　 羟脯氨酸（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ，Ｈｙｐ）属于手性分子，
共有 ４种立体异构体。 本文中所涉及的 Ｌ 羟脯氨
酸为反式 ４ 羟基 Ｌ 脯氨酸（ ｔｒａｎｓ⁃４⁃ｈｙｄｒｏｘｙ⁃Ｌ⁃
ｐｒｏｌｉｎｅ），以下均简称Ｌ 羟脯氨酸。 Ｌ 羟脯氨酸的
分布很广，是胶原、明胶、植物细胞壁蛋白质和微生
物次生代谢产物的重要组成成分［１］。 近些年来 Ｌ
羟脯氨酸在食品、医药、化妆品方面发挥了不可替
代的作用［２］，可以作为婴幼儿食品［３］和一些非哺乳
动物的饲料添加剂，还起到调节脂肪乳化［４］、抗肿
瘤、抗高血压［５］等作用，另外在化妆品方面也具有
抗氧化、抗辐射的作用［６］。
Ｌ 羟脯氨酸是哺乳动物胶原的重要成分［７］，目
前国内生产 Ｌ 羟脯氨酸的方法主要是利用水解法
直接从胶原中提取。 至于化学合成法，由于生产成
本高昂，一般不被采用。 水解法存在众多负面作
用［８］，例如：生产和纯化的步骤较多导致最终产率
很低、在生产过程中必须加入一些有毒害作用的溶
剂或试剂（亚硝酸等）、有废料产生等。 微生物发酵
法以脯氨酸（ｐｒｏｌｉｎｅ，Ｐｒｏ）为底物，运用流加葡萄糖
的方法产 Ｌ 羟脯氨酸，避免了这些负面影响，且对
发酵底物的利用率高，过程无毒害，是一种替代传
统水解法的理想方法。 本文中笔者拟利用自主构
建的组成型重组大肠杆菌 ＢＬ２１（ｐＵＣ１９ Ｈｙｐ）为出
发菌株，运用间歇流加、指数流加和恒速流加 ３种流
加 Ｃ源的方式进行补料分批培养，为其大规模培养
提供基础数据。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
１􀆰 １􀆰 １　 菌种和质粒
大肠杆菌 ＢＬ２１（ｐＵＣ１９ Ｈｙｐ）由笔者所在实验
室成员自主构建，其中脯氨酸羟化酶基因［９］由多拷
贝质粒 ｐＵＣ１９携带转入宿主菌。
１􀆰 １􀆰 ２　 培养基
ＬＢ培养基（ｇ ／ Ｌ）：胰蛋白胨 １０、酵母提取物 ５、
琼脂 ２０、ＮａＣｌ １０；ｐＨ ７􀆰 ０～７􀆰 ２。
发酵培养基（ｇ ／ Ｌ）：葡萄糖 １０、甘油 ５、胰蛋白
胨 ８、（ＮＨ４） ２ＳＯ４５、Ｋ２ＨＰＯ４ １、ＮａＣｌ ２。 以下分开灭
菌： ＭｇＳＯ４ ０􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ、 ＦｅＳＯ４ ３ ｍｍｏｌ ／ Ｌ、 ＣａＣｌ２ ０􀆰 ０１５
ｇ ／ Ｌ、脯氨酸 ４００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ。
补料培养基Ⅰ：葡萄糖 ４００ ｇ ／ Ｌ。
补料培养基Ⅱ：质量分数 ３０％左右的氨水。
培养基在接种前加入 ０􀆰 ０５ ｇ ／ Ｌ 的氨苄青霉素
（ＡＭＰ）。
１􀆰 １􀆰 ３　 主要设备
ＢｉｏＦｌｏ４１５ ７ Ｌ 发酵罐（ＮＢＳ 公司）；ＳＢＡ ４０ Ｃ
型生物传感分析仪（（山东省科学院生物研究所））；
Ｌ ８９００型氨基酸分析仪（日产公司）。
１􀆰 ２　 培养方法
菌种活化：将冷藏于－８０ ℃冰箱的菌种划线接
种于 ＬＢ固体培养基，３７ ℃培养过夜，用活化后的菌
种制备斜面种子，保存待用。
种子制备：从斜面培养基挑取单菌落，接种至
装有 ３０ ｍＬ ＬＢ 培养基的 ２５０ ｍＬ 三角摇瓶中，
３７ ℃、２２０ ｒ ／ ｍｉｎ摇床培养 ８ ｈ。
７ Ｌ发酵罐中补料分批培养：将种子以 ６％的接
种量接种于装液量为 ４ Ｌ 的 ７ Ｌ 发酵罐中，温度为
３５ ℃，用质量分数为 ３０％的氨水控制 ｐＨ 为 ６􀆰 ５ 以
上，通气量为 １～３ ｖｖｍ（ｖｖｍ表示每分钟通气量与罐
体实际料液体积的比值），搅拌转速为 ４００ ～ ９００
ｒ ／ ｍｉｎ，在发酵过程中，将通气量和搅拌转速一同与
溶氧关联，控制发酵罐中的溶氧水平在 ４０％以上，
当到达一定时间不能满足 ４０％的溶氧时，便保持最
高通气量和最大搅拌速率。 每次取样测定 Ａ６００及发
酵液中剩余葡萄糖含量等参数，以残糖的耗尽为标
志开始补料，在 ８ ｈ时，残糖降低到不能满足菌体需
求，此时运用不同的流加方式开始补料。
１􀆰 ３　 检测与分析
溶氧测定：本实验中溶氧电极校准方法为转速
和通气量均设为初始值（４００ ｒ ／ ｍｉｎ、１ ｖｖｍ），断开溶
氧电极与电脑的连接线，此时校准为 ０，然后所有料
液添加完毕，溶氧稳定之后，接种前校准为 １００％。
葡萄糖浓度测定：发酵液 １２ ０００ ｒ ／ ｍｉｎ、４ ℃冷
冻离心 ２ ｍｉｎ后，取上清，用 ＳＢＡ ４０ Ｃ 型生物传感
分析仪测定。
全氨基酸测定：Ｌ ８９００型氨基酸分析仪。
细胞干质量测定方法 ：分光光度计测定 ＯＤ６００
值，然后依照文献［１０］的方法，根据实验数据拟合
细胞干质量（ｄｒｙ ｃｅｌｌ ｗｅｉｇｈｔ，ＤＣＷ）和菌液 ＯＤ６００值
的回归方程：ρ（ＤＣＷ）＝ ０􀆰 ５４ＯＤ６００。
Ｌ 羟脯氨酸的测定采用氯胺 Ｔ 法，参照文献
［１１］。
２　 结果与讨论
在发酵 ８ ｈ 时残糖基本耗尽，经测定葡萄糖质
量浓度为 ０􀆰 ０５ ｇ ／ Ｌ，但此时的溶氧并未出现上升的
４４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
迹象，主要是因为脯氨酸在羟基化的过程中需要大
量 Ｏ２的参与（图 １），这也是发酵过程中溶氧始终维
持较低水平的一个重要原因，从而确定初次流加培
养基的标志不是溶氧的突然上升，而是残糖的基本
耗尽。
图 １　 羟脯氨酸的生物转化
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｒａｎｓ⁃４⁃ｈｙｄｒｏｘｙ⁃Ｌ⁃ｐｒｏｌｉｎｅ
２􀆰 １　 间歇流加方式
间歇流加是将流加操作分为几个间断进行，在
各个流加间断的起始即完成流加，其余时间均为分
批发酵。 间歇流加可以迅速补糖，对发酵的各个间
断的葡萄糖消耗情况加以控制，间歇发酵又可分为
基于指数关系的间歇流加、基于恒速关系的间歇流
加和基于反馈方式的间歇流加等，本实验中采用基
于恒速关系的间歇流加。 实验分两组进行，间隔 ２ ｈ
补料 １ 次，Ⅰ组每次流加 ２０ ｇ 葡萄糖溶液，Ⅱ组每
次流加 ４０ ｇ葡萄糖溶液，间隔 ４ ｈ取 １次样（除葡萄
糖浓度在补料前后都测定外，其余参数在补料前取
样测定）。 结果如图 ２所示。
流加葡萄糖后Ⅰ组和Ⅱ组的葡萄糖瞬时质量
浓度分别接近 ５ 和 １０ ｇ ／ Ｌ，但是每次取样在补料前
进行，所以测得的葡萄糖浓度是经过菌体一段时间
消耗后的残糖浓度。 由图 ２ 可知：Ⅰ组葡萄糖在每
次补料前基本耗尽，Ⅱ组的葡萄糖呈现累积的趋
势，说明菌体消耗葡萄糖的速率介于二者之间。 在
发酵 ８～ １６ ｈ 时，低浓度的葡萄糖有利于菌体生长；
随着菌体的生长，葡萄糖含量逐渐成为Ⅰ组菌体生
长的限制性因素，而Ⅱ组在 １６ ｈ 后可较快速生长。
但是Ⅱ组在 ４４ ｈ后由于副产物、代谢产物的生成和
残糖浓度过高等一系列因素导致生长趋于稳定，Ⅰ
组菌体密度继续呈上升趋势。 在 ４４ ｈ 之前，Ⅱ组的
Ｌ 羟脯氨酸产量略高于Ⅰ组，之后Ⅱ组略低于Ⅰ
组，并且 ２组 Ｌ 羟脯氨酸产量均有所降低，主要是
副产物或菌体自溶产生的物质将 Ｌ 羟脯氨酸分解
所致，最终Ⅰ组在 ４４ ｈ获得最高 Ｌ 羟脯氨酸产量，
为 ２７􀆰 ５４６ ｇ ／ Ｌ。
间歇发酵过程中，葡萄糖浓度变化剧烈，虽然
有些发酵实验中，间歇流加取得了较好的结果，但
图 ２　 间歇流加时残糖浓度、吸光度及
Ｌ 羟脯氨酸浓度变化
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｔｅｎｄｅｎｃｙ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ａｎｄ Ｈｙｐ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｉｎｔｅｒｍｉｔｔｅｎｔ
ｆｌｏｗ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
是本实验证明间歇流加并不利于 Ｌ 羟脯氨酸的生
产，因此就需要寻求另外的流加方式来进一步优
化，从本实验中可以看出菌体的耗糖量在 １０ ～ ２０
ｇ ／ ｈ之间。
２􀆰 ２　 指数流加方式
菌体的生长需要一个合适的流加速率，流加速
率过高容易产生代谢副产物，流加速率过低影响生
产强度的提高。 指数流加是一种基于物料平衡理
论对某些参数进行合理假设的前置流加控制策略，
可使底物的流加与发酵罐中菌体的增长相适应。
流加速率 Ｆ的计算公式［１２］：
Ｆ ＝ （μＸ０Ｖ０） ／ ［Ｙ（ＳＦ Ｓ）］ｅμｔ （１）
式中：μ 为比生长速率（ｈ－１），ｔ 为流加时间（ｈ），Ｘ０
为细胞质量浓度（ ｇ ／ Ｌ），Ｖ０为培养物体积（Ｌ），（Ｘ０
５４　 第 ４期 袁春伟等：重组大肠杆菌 ＢＬ２１（ｐＵＣ１９ Ｈｙｐ）产羟脯氨酸的补料分批培养
Ｖ０）也就是在每次流加前测量的发酵罐中细胞量
（ｇ），Ｙ为细胞得率 （ ｇ ／ ｇ），ＳＦ为流加培养基质量浓
度（ｇ ／ Ｌ），Ｓ为底物质量浓度（ｇ ／ Ｌ）。
表 １　 指数流加策略中相关参数的设定
Ｔａｂｌｅ １　 Ｓｅｔｔｉｎｇ ｖａｌｕｅｓ ｏｆ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ
ｉｎ ｉｎｄｅｘ ｆｌｏｗ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｓｔｒａｔｅｇｙ
μ ／ ｈ－１ Ｙ ／ （ｇ·ｇ－１） ＳＦ ／ （ｇ·Ｌ
－１） Ｓ ／ （ｇ·Ｌ－１）
设定值 ０􀆰 ３６ ４００ １０
　 　 为满足菌体生长时的物料平衡，在菌体的快速
生长期采用对数流加策略，快速生长期过后则保持
前段时间的流加速率，采用恒速流加。 由于流加速
率 Ｆ 是一个与时间 ｔ 有关的指数函数，采用流加软
件控制流加速率，使流加速率 Ｆ 随时间 ｔ 的改变而
时时改变。 根据间歇发酵的平均比生长速率，该实
验分 ３ 组进行，比生长速率 μ 的设定分别为 ０􀆰 １２
（Ⅰ组）、０􀆰 ０８（Ⅱ组）和 ０􀆰 ０５（Ⅲ组） ｈ－１。
利用式 （ １）计算出相应时刻的流加速率 Ｆ
（Ｌ ／ ｈ），并以此速率流加发酵。 结果如图 ３所示。
由图 ３可知：在 ８ ～ １２ ｈ 由于流加速度较慢，此
时残糖基本耗尽，在 １２ ～ ２０ ｈ 根据比生长速率的不
同，残糖浓度逐渐出现差距。 定时取样测定残糖浓
度和及时调控流加速率 Ｆ 可以有效避免葡萄糖过
量积累，Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组分别在 １２、１６ 和 ２８ ｈ 开
始恒速流加，流加速率 Ｆ 分别为 ０􀆰 ５６１、０􀆰 ４３９ 和
０􀆰 ３９３ ｇ ／ Ｌ。 恒速流加后残糖浓度与发酵时间基本
呈一次函数上升，说明后期葡萄糖的单位时间消耗
量基本恒定。 从发酵液吸光度方面来看，在流加初
期Ⅰ组流加速率较快，Ｃ源供应充分，细胞密度迅速
上升，其余 ２组细胞密度随残糖的降低而降低，但是
后期高浓度的残糖和代谢副产物共同影响菌体生
长，细胞密度又随残糖浓度的增大而减小。 至于 Ｌ
羟脯氨酸的产量，由于残糖浓度过高带来的危害导
致 ３组 Ｌ 羟脯氨酸均过早降解，第Ⅲ组在 ４０ ｈ 时
Ｌ 羟脯氨酸的最大产量为 ２４􀆰 ８０９ ｇ ／ Ｌ，尽管指数流
加较间歇流加平稳得多，但最终产量却并不理想。
菌体不适合指数流加，对此笔者进一步分析，
在菌体生长阶段采用指数流加必须具备一些条件，
其一：菌体的生长遵循 Ｍｏｎｏｄ方程［１３］。
Ｍｏｎｏｄ方程：μ ＝ μｍａｘＳ ／ （ＫＳ ＋ Ｓ） （２）
式中：μｍａｘ为最大比生长速率，Ｓ 为限制性基质浓度，
ＫＳ为基质半饱和常数，即细胞比生长速率为 μｍａｘ的一
图 ３　 指数流加时残糖浓度、吸光度及
Ｌ 羟脯氨酸浓度变化
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｔｅｎｄｅｎｃｙ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ＯＤ６００ ａｎｄ Ｈｙｐ
ｃｏｎｔｅｎｔ ｄｕｒｉｎｇ ｉｎｄｅｘ ｆｌｏｗ
ａｄｄｉｔｉｏｎ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
半时的基质浓度。 该方程是用来描述无抑制的细胞
生长模型，脯氨酸羟化酶为生长耦联型，在羟基化反
应中与细胞竞争 Ｏ２，明显抑制了细胞生长。 在接种
后 ５ ｈ，发酵罐中的溶解氧降低到 ４％左右，从而使得
溶解氧成为菌体生长时不可忽略的因素之一。 一般
发酵时，随着菌体密度的增大，葡萄糖消耗量也随之
增大，但是本实验中脯氨酸羟化酶的量也在增大，相
应需要更多 Ｏ２参与脯氨酸的羟基化，从而使得菌体
生长受到一定抑制，很难正常指数生长，进而确定该
发酵过程不是无抑制的菌体生长，不适合指数流加方
式。 从残糖浓度看出，菌体对葡萄糖的利用基本恒
定，下面采用恒速流加方式进行优化。
２􀆰 ３　 恒速流加方式
恒速流加相对于指数流加在操作上更为简单，
６４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
只需在补料开始时设定流加速率，不必在过程中改
变流加速率。 恒速流加时遵循以下物料平衡
方程［１３］。
细胞平衡：ｄ（ＶＸ） ／ ｄｔ ＝ Ｖｒｘ （３）
碳平衡：ｄ（ＶＳ） ／ ｄｔ ＝ － Ｖｒｓ ＋ ＦＳ０ （４）
产物平衡：ｄ（ＶＰ） ／ ｄｔ ＝ Ｖｒｐ （５）
式中：Ｖ为培养物体积（Ｌ），Ｘ 为培养基中细胞密度
（ｇ ／ Ｌ），ｒｘ为细胞生长速率（ ｇ ／ （Ｌ·ｈ）），Ｓ 为培养基
中 Ｃ 源质量浓度 （ ｇ ／ Ｌ）， ｒｓ为 Ｃ 源的消耗速率
（ｇ ／ （Ｌ·ｈ）），Ｆ为流加速率（Ｌ ／ ｈ），Ｓ０为补料培养基
Ｃ源质量浓度（ ｇ ／ Ｌ），Ｐ 为培养基中产物质量浓度
（ｇ ／ Ｌ）， ｒｐ为产物形成速率 （ ｇ ／ （ Ｌ·ｈ））， ｔ 为时间
（ｈ）。 实验时对初始流加葡萄糖速率进行控制，测
定发酵液中的残留葡萄糖浓度，然后再结合各项指
标确定最适流加速率。 实验分 ３ 组进行，设定的流
加速率 Ｆ分别为 ０􀆰 ２０（Ⅰ组）、０􀆰 ３０（Ⅱ组）和 ０􀆰 ４０
（Ⅲ组） ｇ ／ ｍｉｎ。
关于溶氧问题，以恒速流加的第Ⅱ组为例进行
分析，初始设定溶氧不低于 ４０％，但是在发酵第 ６小
时搅拌转速和通气量均为最大才能满足，在第 ７ 小
时溶氧便迅速降到 ４％，且以后一直保持这种低溶
氧状态，直到发酵结束，菌体开始自溶后，溶氧才略
有上升的趋势。 其他流加方式和流加速率的溶氧
也与此种类似，流加速率较低的，溶氧略高点，如：
恒速流加的第Ⅲ组由于 Ｃ源不足，溶氧从 ７ ｈ的 ４％
上升到放罐时的 ３０％。 细胞只有在葡萄糖浓度合
适的情况下才能既保证自身的生长，又有足够的能
量和 Ｏ２合成 Ｌ 羟脯氨酸，如果葡萄糖不足，细胞只
能维持自身的生长，从而没有多余的能量用来合成
Ｌ 羟脯氨酸。
从残糖方面分析，如图 ４所示，前 ２组残糖都稳
定在一定范围，其中Ⅰ组残糖浓度维持在 ０􀆰 ０５ ～
０􀆰 １０ ｇ ／ Ｌ，Ⅱ组残糖浓度维持在 ０􀆰 １０ ～ ０􀆰 ２０ ｇ ／ Ｌ，但
是当流加速率再次提高时，残糖含量不再继续稳定
在一定范围内，而是产生积累现象，例如：Ⅲ组在 １６
ｈ之后残糖浓度几乎成一次函数趋势上升，说明此
时在物料平衡方面，Ｃ 源的输入已经大于细胞的消
耗，葡萄糖浓度随时间的增长成一次函数上升，说
明细胞对葡萄糖的消耗为匀速消耗，即：
Ｆ － ｒｓ ＝ ｋ （６）
式中：Ｆ为流加速率，ｒｓ为 Ｃ源的消耗速率，ｋ 为发酵
液中残糖浓度的增长速率。 由图 ４可知残糖浓度随
时间的增长成一次函数上升，说明 ｋ近似为常数，又
图 ４　 恒速流加时残糖浓度、吸光度及
Ｌ 羟脯氨酸浓度变化
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｔｅｎｄｅｎｃｙ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕａｌ ｇｌｕｃｏｓｅ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ， ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ ａｎｄ Ｈｙｐ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｄｕｒｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｓｐｅｅｄ
ｆｌｏｗ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
因为该流加方式为恒速流加，所以 Ｆ 也是一个恒定
值，因此 ｒｓ也近似为恒定值。
在菌体密度方面，如图 ４ 所示。 Ⅰ组由于 Ｃ 源
严重不足，限制菌体的生长，生长速率和最大细胞
密度都不如其他 ２组；Ⅲ组由于残糖浓度过高，易产
生代谢副产物，影响菌体生长，菌体密度低于Ⅱ组，
大致趋势相似，在 ３６ ｈ 达到稳定期。 最后在 Ｌ 羟
脯氨酸方面进行分析。 在 ２４ ｈ 之前，３ 组数据几乎
近似一样，没有明显差距，在稳定期（３６ ｈ 后）差距
较为明显，Ⅱ组在 ４４ ｈ 时出现最大 Ｌ 羟脯氨酸产
量，４２􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ，Ｐｒｏ 转化率为 ８１％，可见，０􀆰 ３０ ｇ ／ ｍｉｎ
的流加速率对于稳定期产 Ｌ 羟脯氨酸比较有利，与
同种流加方式的其他 ２ 种流加速率拉开了较大差
距。 结合菌体密度和 Ｌ 羟脯氨酸浓度变化曲线可
７４　 第 ４期 袁春伟等：重组大肠杆菌 ＢＬ２１（ｐＵＣ１９ Ｈｙｐ）产羟脯氨酸的补料分批培养
以看出，Ｌ 羟脯氨酸的产生是非生长依赖型的，Ⅱ
组的Ｌ 羟脯氨酸在发酵中后期产率迅速上升，和其
他 ２组迅速拉开差距，但是在细胞密度方面和Ⅲ组
几乎相似，从而可以确定，由于溶氧的限制，合适的
流加速率在细胞生长方面帮助较小，在 Ｌ 羟脯氨酸
的产率和稳定性方面有较大帮助。
在工业生产中较低的糖酸比（发酵中消耗的葡
萄糖质量与产生的 Ｌ 羟脯氨酸质量之比）能给企
业节约生产成本，带来更大的经济效益，在装液量
为 ４ Ｌ的 ７ Ｌ发酵罐中以上述 ３ 种流加速率进行恒
速流加时的糖酸比如表 ２所示。
表 ２　 恒速流加时的糖酸比
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｓｕｇａｒ⁃ａｃｉｄ ｒａｔｉｏ ｄｕｒｉｎｇ ｃｏｎｓｔａｎｔ
ｓｐｅｅｄ ｆｌｏｗ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ
流加速率 ／
（ｇ·ｍｉｎ １）
发酵时间 ／
ｈ
ｍ（消耗的
葡萄糖） ／ ｇ
ｍ（产生的 Ｌ
羟脯氨酸） ／ ｇ 糖酸比
０􀆰 ２ ４０ ４２４ ５７􀆰 ７６ ７􀆰 ３ ∶１
０􀆰 ３ ４４ ６８８ １７０ ４􀆰 ０ ∶１
０􀆰 ４ ４４ ９０４ １０８ ８􀆰 ４ ∶１
　 　 对本实验中的发酵液进行氨基酸分析，分析发酵
过程中是否有其他氨基酸产生以及脯氨酸的残留量。
测得最终发酵产物中主要氨基酸及浓度如表 ３所示。
从表 ３可以看出，除羟脯氨酸和脯氨酸以外的其
他氨基酸的含量都很低，其中苯丙氨酸（Ｐｈｅ）的质量
浓度为 ０􀆰 ０９８ ｇ ／ Ｌ，在除 Ｐｒｏ 外的杂氨基酸中含量
最高。
表 ３　 氨基酸分析结果
Ｔａｂｌｅ ３　 Ａｎａｌｙｓｉｓ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ
氨基酸种类 ρ（氨基酸） ／ （ｇ·Ｌ－１）
谷氨酸 ０􀆰 ０６１
丙氨酸 ０􀆰 ０５４
半胱氨酸 ０􀆰 ０１５
亮氨酸 ０􀆰 ００８
酪氨酸 ０􀆰 ０６３
苯丙氨酸 ０􀆰 ０９８
赖氨酸 ０􀆰 ０３７
脯氨酸 ７􀆰 ８５４
羟脯氨酸 ４２􀆰 ５００
３　 结　 论
利用生物转化法生产 Ｌ 羟脯氨酸过程中，以
０􀆰 ３０ ｇ ／ ｍｉｎ恒速流加葡萄糖溶液使 Ｌ 羟脯氨酸的
产量达到了 ４２􀆰 ５０ ｇ ／ Ｌ。 残糖质量浓度对菌体的生
长特别是最终产物产量影响较大，将残糖质量浓度
控制在 ０􀆰 １０～０􀆰 ２０ ｇ ／ Ｌ可使菌体保持较低的比生长
速率，有效缓解了菌体因快速生长造成的溶氧不足
和代谢抑制物过多带来的危害。 Ｌ 羟脯氨酸的生
物转化是一个耗氧过程，比生长速率的降低可减少
氧气用于菌体自身的生长，从而满足 ＨＹＰ 生物转化
过程中的溶氧需求。
尽管菌体的比生长速率较低，但是溶氧却一直
很难满足菌体生长的需要，实验中通入的是无菌空
气没有使用纯氧，整个发酵过程溶氧都成为限制性
因素，之后的优化可以在增加溶氧方面展开，如：在
菌体中导入血红蛋白基因提高细胞的氧气利用率、
增加罐压和通入纯氧等。
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（责任编辑　 管　 珺）
８４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷