全 文 ：不利用丙酮酸的丙酮酸生产菌的选育
占桂荣!，高年发
（天津市工业微生物重点实验室 天津科技大学生物工程学院，天津 !""###）
摘 要：以光滑球拟酵母（ !"#$%"&’(’ )%*+#*,*）$%&’ 为出发菌，经过 () 和 *+, 复合诱变选育出一株不利用丙酮酸的
高产菌（$%#"-）。其摇瓶发酵产酸量和产酸率分别比原菌增加了 #. /-0和 #. /10。在 1 2 罐上的产酸量和产酸率
分别是 3" /#! 4·2 5 &和 .- /.0，比原菌增加了 1 /30和 1 /!0。
关键词：丙酮酸；复合诱变；育种
中图分类号：$6’#& /3 文献标识码：7 文章编号：&.3# 5 !.38（#"".）"- 5 ""!# 5 "1
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34-*#2"*：!"#$%"&’(’ )%*+#*,* MN@D>B $%&’ VDM =MHL DM MND@N>B4 MN@D>B DB =B=MHL WI@=U>Q DQ>L AE T>4T WI@=U>Q
DQ>L W@AL=Q>B4 MN@D>B（$%#"-）VDM J@HHL JI ()?*+, QAXWO>QDN>AB X=NDN>AB Y $TH MD>B（$%#"-）W@AL=QHL QAB?
QHBN@DN>AB AE WI@=U>Q DQ>L DBL I>HOL VH@H >BQ@HDMHL JI #. /-0 DBL #. /10 NTDB NTH V>OL MN@D>B >B EODMZ Q=O?
N=@H，@HMWHQN>UHOI Y SDNQT Q=ON=@H VDM QABL=QNHL >B D 1 2 EH@XHBNA@，$TH QABQHBN@DN>AB DBL I>HOL @HDQTHL NA
3" /#! 4·2 5 & DBL .- /.0，VT>QT VH@H >BQ@HDMHL JI 1 /30 DBL 1 /!0 NTDB NTH MND@N>B4 MN@D>B @HMWHQN>UHOI Y
5$0 6(#.-：WI@=U>Q DQ>L；QAXWO>QDN>AB X=NDN>AB；J@HHL>B4
丙酮酸是重要的!?氧代羧酸之一，它不仅在生
物能量代谢中具有十分重要的作用，而且是合成多
种有用化合物的前体，在制药、化工、食品等工业以
及科学研究中有广泛的用途［&，#，!］，许多维生素、氨
基酸的生物合成都是以丙酮酸为起始物。近年来，
对丙酮酸及其丙酮酸系列产品的开发利用正日益深
入，商业上的需求也持续增长［-］。
丙酮酸的发酵法生产研究已有 1" D 的历史。
日本学者经过近 -" D 的研究选育出了丙酮酸高产
菌株，并于 &’8’ 年实现了工业化发酵生产，其产酸
水平高达 .3 /8 4·2 5 &。但是与其它有机酸发酵生产
相比，产酸水平比较低，虽然应用各种方法对其菌种
及发酵条件进行优化，但产量和产率始终不能得到
显著提高。作者在丙酮酸发酵过程中发现，丙酮酸
产量达到一定水平后，葡萄糖消耗速率下降，且丙酮
酸产量下降（实验数据显示）。这个结果在其他人的
有关研究中也有述及［-］。经研究分析认为，导致丙
酮酸产量停滞不前甚至下降的原因是当丙酮酸含量
增加到一定水平后，丙酮酸产生菌优先利用丙酮酸
作碳源进行菌体生长或生成其它代谢物。选育不利
用丙酮酸的突变株来提高丙酮酸发酵产量在国内尚
未见报道。本文选育不利用丙酮酸的突变株，并对
不利用丙酮酸的突变株产酸性能进行了初步研究，
进一步提高了发酵菌的产酸量。
! 收稿日期：#"".?"8?"#
作者简介：占桂荣（&’3!?）男，江西婺源县人，硕士研究生，主要研究方向为生物化工。
联系人：高年发，教授，博士生导师，+?XD>O：4DAB>DBED[ &.!/ QAX
;AU Y #"".
·!#·
生 物 加 工 过 程
RT>BHMH \A=@BDO AE S>AW@AQHMM +B4>BHH@>B4
第 - 卷第 - 期
#"". 年 && 月
万方数据
! 材料与方法
! "! 出发菌种
光滑球拟酵母（ !"#$%"&’(’ )%*+#*,*）#$!%（&’ ( )
*+, ( ) #$$ ( ) $-. (），天津科技大学有机酸教研室
保藏。
! "/ 培养基和菌种培养
! "/ "! 斜面培养基
无水葡萄糖 !0 1；蛋白胨 2 1；酵母浸粉 3 1；麦
芽汁 3 1；琼脂 /0 1；蒸馏水定容至 ! 4，56 2 "0。
! "/ "/ 固体培养基
（!）78793完全培养基
葡萄糖 :0 1；蛋白胨 !0 1；;6/ $9: ! 1；<1=9:·
>6/9 0 "2 1；烟酸 ? @1；盐酸硫铵素 !0!1；盐酸吡哆
醇 0 "2 @1；生物素 /0!1；琼脂 /0 1；78793 2 1；蒸馏
水定容至 ! 4，56 2 "0。
（/）丙酮酸唯一碳源固体培养基
丙酮酸钙 /0 1代替葡萄糖，其余成分同（!）。
（3）限制培养基
丙酮酸唯一碳源固体培养基中加入 0 "/ A 的
78793完全培养基。
（:）培养方法
取诱变过或处理好的菌液 0 "! @4 涂于平板上，
置于 30 B、湿度为 22A的培养箱中进行培养 / C 3
-。
! "/ "3 种子培养基
葡萄糖 30 1；蛋白胨 !0 1；;6/ $9: ! 1；<1=9:·
>6/9 0 "2 1；56 2 "D 1；自来水定容至 ! 4，56 2 "D 。
! "/ ": 发酵培养基
葡萄糖 ?0 1（!00 1罐上用）；蛋白胨 3 1；硫酸铵
2 "% 1；;6/$9: ! 1；<1=9:·>6/9 0 "2 1；烟酸 ? @1；盐
酸硫胺素 !0!1；生物素 /0!1；盐酸吡哆醇 0 "2 @1；
78793 :0 1（摇瓶时添加），金属离子母液 2 @4，自来
水定容至 ! 4，56 2 "D。
培养方法：从新鲜斜面上接一环菌入种子培养
基（20 @4 E 200 @4），在 30 B、/!0 F·@+G ( !下培养 !D H
后，以 !0 A 接种量接入发酵培养基。摇瓶发酵装
液量 20 @4 E 200 @4 锥形瓶，转速 /!0 F·@+G ( !，发酵
时间如无特指即为 20 H。分批发酵时，2 4发酵罐装
液量 3 4，通气量 3 4·@+G ( !，用 ? @,I·4 ( !的 &896溶
液控制 56 2 "0，发酵温度 30 B。
! "3 诱变方法及突变株的筛选
! "3 "! #$!% 菌株的 JK 和 LM= 单因子及 JKNLM=
复合诱变
取 !0 @4 种子培养液于 3 200 F·@+G ( !离心 !0
@+G，收集菌体，用 !0 @4生理盐水洗两次，然后将菌
体重新悬浮于适量的生理盐水中，制成细胞浓度为
!0?个 E @4的菌悬液。
JK诱变：取 !0 @4菌液于"%0 @@ 的培养皿中
（带磁棒），置于紫外诱变箱的磁力搅拌器上，以 !2
O的紫外照射仪于 30 P@处照射。设定不同的照射
时间为不同的 JK 处理剂量。紫外线照射后，暗修
复 / H 涂平板。各样品均进行活菌计数，并与对照
组比较，计算致死率［2］。
LM=诱变：吸取 : @4 菌悬液至 /20 @4 锥形瓶
内，并加入磷酸缓冲溶液（56 > "0）制成约 !0D个菌 E
@4的菌悬液，再加硫酸二乙酯 0 "/ @4，使硫酸二乙
酯在菌悬液中的体积分数为 ! A，并分别振荡处理
不同的时间，立即加入 0 "2 @4 的 /2 A 硫代硫酸钠
溶液终止反应，并涂平板。各样品均进行活菌计数，
并与对照组比较，计算致死率。
JKNLM= 复合诱变：经 JK 诱变处理的菌液加入
种子培养基培养 !/ H，再经 LM= 诱变处理，分离菌体
并加入丙酮酸唯一碳源的种子培养基培养 !0 H，然
后加入制霉菌素杀死利用丙酮酸的菌株。离心分离
菌体并稀释到一定的浓度涂限制培养基平板。
! "3 "/ 不利用丙酮酸突变株的初筛
挑取限制培养基平板上的小菌落分别点接到对
应的 78793完全培养基平板和丙酮酸唯一碳源固体
培养基平板上，在 78793完全培养基平板生长且透
明圈比较大而在丙酮酸唯一碳源固体培养基平板上
不长或菌落小的单菌落既为所需突变株。
! "3 "3 不利用丙酮酸突变株的复筛
初筛所得菌株与原菌同时进行摇床发酵实验，
比较各菌株的产酸量，选出最优菌株。
! ": 分析方法
! ": "! 酵母菌体测定方法
发酵液稀释至相应倍数，在可见光 DD0 G@测定
其吸光值。
! ": "/ 葡萄糖测定方法
用山东科学院研制 =*’N:07 型生物传感仪检
测。
! ": "3 丙酮酸测定方法
6$47法［D］。
/00D 年 !! 月 占桂荣等：不利用丙酮酸的丙酮酸生产菌的选育 ·33·
万方数据
! 结果与讨论
! "# 出发菌株的产酸能力
诱变前对出发菌株的产酸能力进行了检验，实
验结果见表 #。
表 # 出发菌株产酸能力比较
$%&’( # )*+,%-./*0 *1 23( %&.’.24 *1 ,4-56.7 %7.8
&4 23( 8.11(-(02 /2%-2.09 /2-%.0/
样品号 # ! : ; < =
酸产量 >（9·? @ #） :A "! :# ": !B "C !D "; != "# !< "B
由表 # 可看出，对出发菌株所作 的 = 个平行实
验中，样品 ! 产酸能力最高，而样品 <、D 产酸能力
低，其产酸能力差异可能是由于出发菌株的个体差
异所造成，选择产酸能力较高的样品 ! 作为诱变出
发菌株。
! "! 不同诱变剂致死率和正突变率的比较
为考察最适诱变条件，采用不同的 EF 和 GHI
诱变剂量对源菌进行诱变，所得致死率和正突变率
结果见表 !、:。
表 ! EF诱变处理的致死率和正突变率
$%&’( ! $3( ’(23%’ -%2( %08 ,*/.2.6( +52%02 -%2( %12(- EF +52%2.*0
EF处理时间 > / #< :A ;< =A B< CA
致死率 > J :A ":# ;< "正突变率 > J ; #A !< ;A :A #A
表 : GHI诱变处理的致死率和正突变率
$%&’( : $3( ’(23%’ -%2( %08 ,*/.2.6( +52%02 -%2( %12(- GHI +52%2.*0
GHI处理时间 > +.0 #A !A :A ;A 致死率 > J :D ":# =A "!; BD "=A D< "<; CA "D# CC ";:
正突变率 > J ! B #A #< D :
以上结果表明，EF 照射 =A / 以及 GHI 处理 ;A
+.0的致死率分别达到 DAJ 以上，且两者的正突变
率都比较高。因此选择这样的诱变剂量处理出发菌
株。
! ": 不利用丙酮酸突变株的初筛
从 )%)K:完全培养基和丙酮酸唯一碳源固体培
养基对照平板上选出 < 株菌，（分别命名为 $L!A#，
$L!A!，$L!A:，$L!A;，$L!A<），把它们与原菌重新点
接到 )%)K:完全培养基和丙酮酸唯一碳源固体培养
基对照平板上，结果如图 # 所示。
从图 # 可看出，在基本培养基上原菌比其它菌
长的大，因此其它几个菌是符合要求的 。在限制培
养基上亲株 $LM#C 有微弱生长，而突变株几乎不生
长，在 )%)K: 完全培养基上亲株生长相似，因此突变
株几乎不能利用丙酮酸，作为碳源生长为丙酮酸利
用缺陷型，培养基上亲株生长和突变株生长相似，因
此突变株几乎不能利用丙酮酸。
注：各菌在两平板中的点样位置对应生发菌为中下方菌落
图 # 突变株与原菌在 )%)K:完全培养基（左边）和丙酮酸唯
一碳源固体培养基（右边）上的生长情况
N.9 "# )*+,%-./*0 *1 23( +52%02 /2-%.0/ %08 23( /2%-2.09 /2-%.0
! "; 不利用丙酮酸突变株的复筛及遗传稳定性试
验
初筛所获得 < 株菌与原菌同时上摇床发酵结果
如表 ; 所示。
表 ; 突变株与原菌产酸比较
$%&’( ; )*+,%-./*0 *1 23( %&.’.24 *1 ,4-56.7 %7.8
&4 23( +52%02 /2-%.0/ %08 23( O.’8 /2-%.0
菌株号 $L#C $L!A# $L!A! $L!A: $L!A; $L!A<
产酸量 > 9·? @ # :A "= :# "! !C "< :; "< :D "B !D ";
产酸率 > 9·9 @ # :A "! :# !C "# :; "! :D "; !B "C
遗传稳定性试验结果如表 < 所示。
表 < 遗传稳定性结果
$%&’( < $3( 9(0(2.7 /2%&.’.24 *1 23( /2-%.0/
菌株号 $L#C: $L!A# $L!A! $L!A: $L!A; $L!A<
产酸量 >
9·? @ #
第一代 != "
第五代 != ":; !B "CD !C ";! !B "C; :A "!# !D "#
从表 < 可看出菌株 $L!A; 比原菌 $L#C 的产酸
量和产酸率分别增加了 != ";J和 != "
酮酸产生能力强且稳定，而其余 ! 株菌在传代 : 次
后，丙酮酸产生能力均有所下降。综合考虑丙酮酸
产生能力和菌株的遗传稳定性，确定不利用丙酮酸
突变株 $L!A; 为进一步研究用菌株。
! "< 不利用丙酮酸突变株 $L!A; 遗传标记的鉴定
及分析
对不利用丙酮酸突变株 $L!A; 的三大类营养物
质要求进行鉴定，其结果如表 = 所示。从表 = 得知
不利用丙酮酸突变株 $L!A; 在粘有维生素混合液的
·:;· 生物加工过程 第 ; 卷第 ; 期
万方数据
滤纸片周围生长，而在其它混合液周围不生长。说
明不利用丙酮酸突变株 !"#$% 缺乏合成某些维生素
的能力，是维生素缺陷型菌株。
表 & 三大类营养物质对 !"#$% 生长的影响
!’()* & +,,*-. /, .01** 23456 /, 47.13*4.6 /4 !"#$% 81/9.0
营养情况 氨基酸 维生素 核酸 对照
生长情况 : ; : :
“ ;”表示滤纸片周围出现菌落，“ :”表示未出现菌落
然后对不利用丙酮酸突变株 !"#$% 的维生素缺
陷型进行鉴定，其结果如表 < 所示。从表 < 可看出：
它与亲株 !"=> 相同，在不沾有盐酸硫胺素、烟酸、盐
酸吡哆醇、生物素而含有其它维生素的滤纸片周围
无菌落出现，在沾有盐酸硫胺素、烟酸、盐酸吡哆醇、
生物素而缺少其它维生素的滤纸片周围出现菌落。
说明不利用丙酮酸突变株 !"#$% 是盐酸硫胺素、烟
酸、盐酸吡哆醇和生物素 % 种维生素的缺陷型。
表 < 各种维生素对 !"#$% 生长的影响
!’()* < +,,*-. /, ’)) ?3.’@346 /4 !"#$% 81/9.0
所缺维生素 生长情况 所缺维生素 生长情况 所缺维生素 生长情况
盐酸硫胺素 : 烟酸 : 生物素 :
盐酸吡哆醇 : 叶酸 ; 核黄素 ;
泛酸 ; 肌醇 ; 胆碱 ;
对照 ;
注：“ :”“ ;”意义同表 &
# A& 不利用丙酮酸突变株 !"#$% 与亲株 !"=> 在 B
C罐中发酵试验比较
不利用丙酮酸突变株 !"#$% 与亲株 !"=> 在 B C
罐中发酵试验的结果如图 # 和图 D 所示。
—!—8)7-/6*；—"—EF17?3- ’-35；—#—81/9.0
图 # !"#$% 菌（左图）和图 D!"=> 菌（右图）的 B C发酵罐分批发酵情况对比
G38 A# !3@*H-/716* /, (’.-0 ,*1@*4.’.3/4 E1/-*66 /, !"#$% ’45 !"=>
从图 # 可以直接看出，不利用丙酮酸突变株
!"#$% 从发酵 =# 0 开始产酸，随着发酵的进行丙酮
酸产量一直在增长，直到糖耗完为止。而亲株 !"=>
在发酵 B# 0 的产酸达到最大值（因此时残糖高，如
果下罐不利于发酵液的分离），随后丙酮酸产量却有
所下降。这表明亲株 !"=> 在发酵后期消耗丙酮酸
而不利用丙酮酸突变株 !"#$% 发酵全程不消耗丙酮
酸。所以 !"#$% 菌株属不利用丙酮酸的突变株，符
合选育要求。从图 # 和图 D 还可以看出：不利用丙
酮酸突变株 !"#$% 菌下罐的产酸量、产酸率和生产
强度分别为 <$ A#D 8·C : =，&% A&I，= ADD 8·（C·0）: =，
而 !"=> 菌尽管 B# 0 发酵后达到最大酸量，但积余
的葡萄糖影响了后面的分离纯化，在后期的持续发
酵中产物丙酮酸也被利用代谢，影响了 !"=> 的丙酮
酸的产量。下罐的产酸量、产酸率和生产强度分别
为 && A
株比亲菌产酸量、产酸率和生产强度分别增加了
B A
# A< 讨 论
从图 D 丙酮酸的代谢途径可以看出，要使丙酮
酸的产量提高主要有两种方法：（=）在保证细胞正常
生命活动的前提下，尽可能减少丙酮酸的降解或转
化，这是获得丙酮酸的高产量和高产率的必要条件；
（#）加速从葡萄糖到丙酮酸的代谢，以确保获得丙酮
酸的高生产强度［<］。丙酮酸脱羧（"JK）生成乙醇和
丙酮酸在厌氧状态下由乳酸脱氢酶（CJL）作用生成
乳酸都可以通过改进发酵条件得以避免。而抑制丙
酮酸脱羧酶（"JK）、抑制转氨酶和加速葡萄糖的代
谢只能通过诱变育种或改变基因来实现。
突变菌 !"#$% 的耗糖速率明显比 !"=> 快，即加
速了糖到丙酮酸的代谢，生产强度得到了极大的提
高（比原菌高 #$I）。突变株的丙酮酸脱羧酶（"JK）
也得到了一定程度的抑制，丙酮酸的产量和产率也
#$$& 年 == 月 占桂荣等：不利用丙酮酸的丙酮酸生产菌的选育 ·DB·
万方数据
有一定程度的提高。
图 ! 丙酮酸的代谢途径
"#$ %! &’()*+,#- .)(/0)1 +2 .1345)(’
参考文献：
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