全 文 ：生物转化对甲基苯甲酸合成对苯二甲酸的研究
王 净!，"，许建和#，田 晶!，"，许国旺!
!
（! $ 中国科学院大连化学物理研究所国家色谱中心，大连 !!%&#"；
# $ 华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海 #&&#"’；" $ 大连轻工业学院分析中心，大连 !!%&"(）
摘 要：在单加氧酶和脱氢酶系的作用下，睾丸酮丛毛单胞菌 )*+%,’’ 以对甲基苯甲酸（ !-./0）为唯一碳源，生物
催化生成对苯二甲酸（1.2），并对其细胞生长、底物代谢和产物生成过程进行了研究。结果表明，底物在 3 4内即可
完全代谢，但检测到产物的生成需要更长的时间。
关键词：睾丸酮丛毛单胞菌；生物转化；对甲基苯甲酸；对苯二甲酸
中图分类号：53!6 文献标识码：2 文章编号：!%’# 7 "%’3（#&&,）&( 7 &&!6 7 &(
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醇酯（1T.，俗称聚酯），聚对苯二甲酸丙二醇酯
（1..）以及聚对苯二甲酸丁二醇酯（1\.），是聚酯生
产中主要的原料。近几年，世界 1.2 的生产一直以
较快速度增长，生产能力从 !66’ 年的 ! 3## 万 H ]年
增长到 #&&# 年的 # %!# 万 H ]年，年均增长率达到
’ $,^。同期，产量从 ! %’! 万 H 增长到 # (6( 万 H，年
均增长率达到 3 $"^［!］。传统工业主要是采用化学
合成方法生产对苯二甲酸，其化学生产则以对二甲
苯的硝酸氧化，催化液相空气氧化及 L伊斯曼-科达克法等［#］化学法为主，但化学法生产存
在着消耗能源巨大、对反应设备要求苛刻、原料消耗
和水资源消耗较高、排出的工业废水较多、污染物的
排放和污染扩散较大等缺点。生物催化技术是生物
学和化学工程的交叉学科。生物催化与化学合成法
相比有如下优点：!反应条件温和；"具有多功能
性、底物选择性、立体选择性、对映选择性、区域选择
! 收稿日期：#&&,-&3-#&
基金项目：国家“6’"”计划（#&&"J\’!%&&"）项目和中科院创新基金（_#&!#）资助
作者简介：王 净，（!6’3-），辽宁人，女，硕士研究生，研究方向：应用微生物。
联系人：许国旺，T-LA第 " 卷第 ( 期
#&&, 年 !! 月
生 物 加 工 过 程
J4<=BPB ;EDK=AI ES \<=BBK<=>
9EU G #&&,
·!6·
万方数据
性和化学选择性高的优点；!化学反应专一但又可
以改变；"对环境友好。生物催化技术是实现化学
工业可持续发展最有效的技术。同时我们尝试采用
生物催化转化法生产对苯二甲酸。
睾丸酮丛毛单胞菌（!"#$#"%$& ’(&’"&’()"%(）是丛
毛单胞菌属（ !"#$#"%$&）的一个种。在自然界中分
布广泛，为条件致病菌［!］。现有报道关于睾丸酮丛
毛单胞菌对喹啉类化合物的降解［"］，但关于催化生
成对苯二甲酸的研究还未见报道。本文从不同菌株
出发，以对甲基苯甲酸为唯一碳源，挑选出能够生成
对苯二甲酸的菌株，并对该菌株进行了研究。
! 材料和方法
# $# 菌种和培养基
# $# $# 菌株
%&# $#’#! 和 %&# $#’()（伯 克 霍 尔 德 菌），
%&# $##!(，%&# $*"! 和 %+++#((’,（恶臭假单胞菌），
+-.（食酸丛毛单胞菌），%&" $#)!#（糖丝菌属），%/++
010"1（阴沟肠杆菌），%/++##11* 和 2&3*,))（睾丸
酮丛毛单胞菌）。
# $# $0 糖丝菌株专用的培养基［,］
基础培养基（ 4 5 6）：硫酸铵 0 $(，磷酸二氢钠
( $,，磷酸二氢钾 ( $,，七水硫酸镁 ( $0，无水氯化钙
( $#；固体培养基中另加入琼脂占 # $,7 8 0 $(7。
液体培养基（ 4 5 6）：硝酸铵 # $(，磷酸二氢钾
( $,，氯化钠 # $(，磷酸氢二钾 ( $,，七水硫酸镁 ( $,，
氯化钙 ( $#，氯化铁 ( $(0，酵母提取物 ( $(,。
# $# $! 除糖丝菌属外其他菌用培养基［*］
液 体 培 养 基：硫 酸 铵 #( 99.: 5 6，氯 化 镁
0 99.: 5 6，无 水 氯 化 钙 ( $) 99.: 5 6，氯 化 锰
,(#9.: 5 6，七水氯化铁 ##9.: 5 6，硫酸铜 # $)0#9.: 5
6，氯化钴0 $,!#9.: 5 6，钼酸钠 0 $"0#9.: 5 6，硫酸亚
铁( $((( #7，维生素 ;# 0#9.: 5 6，磷酸钾缓冲溶液
,( 99.: 5 6，<= > )。
# $# $" 碳源
准确称取 ( $0( 4 的对甲基苯甲酸，用稀氨水溶
解，并用双蒸水定容于 #(( 96 的容量瓶中，配制成
0 4 5 6的标准品，备用。
# $0 菌株的选择
利用 # $# 中的各种不同菌种及液体培养基分别
以对甲基苯甲酸为生长底物（唯一碳源），接种到装
液量为 !( 96 的 #(( 96 三角瓶中，在 !( ?，
#*( @ 5 9AB的通气恒温摇床上振荡培养，并定期取发
酵液检测是否生成对苯二甲酸。通过唯一碳源法来
筛选能够生产对苯二甲酸的菌种，其中底物加入量
为 ( $#( 4 5 6。
# $! 生长曲线测定
先以细菌培养基培养菌株制成种子液，再以
,7的接种量转接到液体培养基中，根据其不同时间
测定的光密度 *+*((得到其生长曲线。
# $" 底物代谢实验
在唯一碳源培养的过程中，定期取发酵液检测
对甲基苯甲酸的代谢程度。取发酵液 # $, 96，
’ ((( @ 5 9AB离心 #( 9AB，除去其中菌体及蛋白大分
子，上清液用 ( $00#9 的滤膜过滤后用毛细管电泳
检测底物浓度。
# $, 分析方法
细胞浓度的变化用 *+*((的检测值表示，仪器
为 CD0",( 紫外分光光度计（日本岛津公司）。底物
及生成物的浓度用毛细管电泳检测，仪器为 E 5 %+F
32G 毛细管电泳仪（美国 ;HIJ9-B 公司），毛细管为
熔融二氧化硅毛细管柱，柱箱温度 0, ?，运行电压
为 #, JD，采用负电源，压力进样 ( $, #, K，检测波长为 0(( B9。
" 结果与讨论
0 $# 菌种的选择
在不同时间检测对苯二甲酸的生成和菌体生长
情况，如表 # 所示。各菌在唯一碳源培养基中都有
生长，但仅有菌 2&3*,)) 在唯一碳源培养中有对苯
二甲酸的生成。所以选择该睾丸酮丛毛单胞菌
（2&3*,))）进行进一步的研究。对甲基苯甲酸是一
类芳香烃化合物，而自然界中降解烃类的微生物约
占微生物群落总数的 #7［)］。所以微生物能够利用
对甲基苯甲酸作为碳源生长是一件相对容易的事
情，所选的菌株都能够在以对甲基苯甲酸为唯一碳
源的培养基中生长。
0 $0 生长曲线和底物代谢实验
图 # 中分别表示睾丸酮丛毛单胞菌 2&3*,))
在初始底物质量浓度为 ( $# 4 5 6 的唯一碳源培养基
中的生长曲线和底物代谢曲线。由图 # 可见，该菌
细菌浓度有明显增加，( 8 ’ L 为延滞期，’ 8 0( L 为
菌体的对数生长期，其后为稳定期，直至 0’ L 开始
衰亡。该菌可以快速代谢对甲基苯甲酸，由底物代
·0(· 生物加工过程 第 ! 卷第 " 期
万方数据
谢曲线可以看出，底物在 ! " 之内就已经被完全代
谢。
表 # 各菌株在唯一碳源培养基中产 $%&情况
%’()* # $+,-./01,2 ,3 0*+*4"0"’)1/ ’/1- 3+,5 !60,).1/ ’/1- (7 -136
3*+*20 80+’128
98,)’0*
:+,;0" ,2
<’+(,2 =,.+/*
$+,-./01,2 ,3
%*+*4"0"’)1/ &/1-
&=# >#!#? @ A
&=# >#!BC @ A
&=# >##?B @ A
&=# >DE? @ A
&<<<#BB!F @ A
<’, @ A
&=E >#C?# @ A
&%<&%<<##HHD @ A
I=JDFCC @ @
—!—%"* K+,;0" /.+L* ,3 I=JDFCC；
—"—%"* 0+’283,+5’01,2 /.+L* ,3 !60,).1/ ’/1-
图 # I=JDFCC 的生长及对甲基苯甲酸的代谢曲线
M1K ># %"* K+,;0" ,3 I=JDFCC ’2- 0+’283,+5’01,2 ,3 !60,).1/ ’/1-
G >? $%&的生成
由图 G 可以看出，睾丸酮丛毛单胞菌 I=JDFCC
在降解对甲基苯甲酸的过程中有对苯二甲酸的生
成，但是生成量不大。据报道芳香烃的代谢主要依
靠的是单加氧酶或双加氧酶，细菌主要产生双加氧
酶，对于芳香烃类化合物代谢途径一般主要是，首先
苯环的裂解，把两个氧原子加到底物中形成双氧乙
烷，进一步还原水解成为顺式双氢乙醇，双氢乙醇可
继续氧化为儿茶酸、原儿茶酸和龙胆酸等中间代谢
物，接着苯环断开，产生琥珀酸、延胡索酸、乙酸、丙
酮酸和乙醛，代谢中的产物被微生物用来合成自身
的生物量，同时产生 谢途径与本研究希望生成的对苯二甲酸的途径不相
符合。但是另一种途径，即苯环上的甲基不断氧化
生成甲酸的情况也有报道［D］，该氧化代谢途径符合
本研究的要求，菌 I=JDFCC 正是通过对对甲基苯甲
酸上甲基的不断氧化才能得到最终的产物对苯二甲
酸。但是该氧化代谢途径并不是对甲基苯甲酸主要
的代谢途径，所以向该方向代谢生成对苯二甲酸的
量偏小。另外，一些细菌（尤其是条件致病菌）在代
谢过程中，随着所形成的末端代谢产物逐渐增多，细
菌所受的反馈抑制作用也逐渐明显，一些毒力较强
的条件致病菌如 "#（ "$%!&’%$($)*+ #,)#,-*.,+），它所
产生的毒性产物对机体和自身都是有毒害作用的。
因此，细菌的毒力不仅表现为它产生毒性产物的能
力，而且也体现在它对毒性产物的耐受能力［#B］。由
于菌 I=JDFCC 是条件致病菌，其在本研究中产生的
酶是诱导酶，由于在代谢过程中产生有毒物质对苯
二甲酸，对酶的反应条件产生影响，这些原因都可能
是导致对苯二甲酸生成量偏小的原因。改善代谢条
件提高对苯二甲酸产量还有待进一步研究。
$%&：对苯二甲酸；E6! A %NQ：对甲基苯甲酸
图 G I=JDFCC 菌株发酵液与标准液的谱图比较
M1K >G <,54’+18,2 ,3 /"+,5’0,K+’5 ,3 /.)0.+* (+,0" ’2- 80’2-’+-
8,).01,2
! 结 论
睾丸酮丛毛单胞菌 I=JDFCC 能够快速代谢对
甲基苯甲酸，并利用其做为碳源生长，在完全代谢后
能够氧化成对苯二甲酸。这些都为进一步开展生物
转化法生产对苯二甲酸的研究奠定了基础。
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