全 文 ：第5卷第2期
2007年5月
生物加工过程
ChineseJ0umalofBioprocessE”gineefing
Mav2007
·67·
4c≠i加6倪c趔Mssucc：nogenes130z厌氧发酵产
丁二酸条件初步研究
苏 溧，陈可泉，蔡 婷，王倩楠，姜 岷
(南京工业大学 制药与生命稃学学院，南京210009)
摘要：对A“m05鲥__ffz“s∽c抽州删130z厌氧发酵产丁二酸的培养条件进行了初步研究研究了不同有机氮源，不
同碳、氯源浓度配比、cO，供体、培养温度，培养基起始pH值对菌株生长和产酸的影响，并在5I。发酵罐中进行了放大
试验，，结果表明最佳培养基配方为(∥L)：葡萄糖lo，酵母膏5，NaITc0310，Na2ITP【)4o3，№112Po。·2112()96，
K2HPO。3，Mgcl，02，Mncl：o2，、aclOl；pH7o在最佳和件下，血清瓶37℃培齐24h，丁二酸产量达到83g／l，
在5L发酵罐中培养，葡萄糖质量浓度分别为10和100g／I．时，丁二酸产量分片、1选到82和456g，】．，收率分别为
80％和65％
关键词：^c￡in06nci“m洲州。哗舢130z；丁二酸；发酵紊件
中图分类号：Q9399 文献标识码：^ 文章编号：1672—367H(2()()7102一(xJ67—06
Researchonanarobicculturalconditionofsuccillicacid
producingstrainAc聒挖。西以cf耽ss比cc协DgPnPs130Z
sLLi，cHENKe—quan，cAITing，wANCQian-nan，儿ANGMin
(coll89e0f“feseienceandPha埘aceuticalE“gineeri唱，Nan"nguT11versloyofIech¨n】o盯，N8nJmg210009，chma)
Abstract：TlleinvesiigaIioflorlermenIaIioIlcunditjons(正且c￡i，L06ⅡciZZH5sⅡcci，砷ge，t椰130Zwasconducted．
EⅡectsorniIrogensou州cs，ra【ioufC山削，C02donor，tenlperatureandbrothinitlalpHonthecolltent
ofsuccinicacidandbiomassorn．5“∞：nogen甜130Zwe上csIudied．Resultsshowedt11att11eoptinⅧn1me—
diumwasas±ollows(ing／L)：glucoselO，y aslexlracL5，^aHc0310，Na2HP0403．NaH2P04‘2H：0
9．6，K2HP043，MgCl202，MnCl20． ，NaCl0．1，pH7．O．UndertheoptiⅡ1alcond讯ons，theconc ntra—
iionofsuccinicacidinsemmbot士lewithcultivatetemuerature37℃andcuhiva“on口eliod24hreached
8．3g／LTh。prtJcesswa caled“pina5LnrrnellLerwhenthei而tialconcentration0f91ucosewele
lOg／L粕d100g／L，the灿oumorsuccinicacidreached8．2g／T．and45．6∥Lw“ht11。yjcldof80％
and65％，respectivelv
Keywords：以c砌06nc删Ⅲs∽cmog帆部130Z；succjnjcacid；fcmlent鲥onconditions
丁二酸是生物炼制产品丁程中最雨要的碳四
平台化合物。其作为许多重要的中间产物和专业
化学制品，传统生产方法采用的是从丁烷经顺丁烯
二再f通过电解生产，生产亍‘染人．成水高，这严重抑
收稿日期：2006-11—14
基金项目：国家高技术研究发展计划资助项目(“863”计划)(20【}6AA022235)；国家自然科学基金资助项目(206060】7)；江苏省高校自
然科学一般研究计划资助项目(05l(JBl8【)043)
作者简介：苏津(1983一)，女，江苏常州人，硕士研究生，研究方向：生物化工。
联系人：姜 岷，副研究员，E⋯1：J1aogIrIin@q“t．educn
万方数据
．68· 生物加工过程
制了j二睃这一大宗化学品的发展潜力。开发牛
物合成J‘二酸的方法具有非常晕要的意义，生产成
本将有望从目前的12000冗／t降至4000元／f以
下，从而打开大宗化学品的市场，取代很多摹J苯
和石化中问产物的商品，减少拄超过250种苯基化
学制品的生产和消费过程中所产生的污染，市场总
量将山目前的1．8万t扩展至400万t。“。
目前丁一酸的生产菌株主要有币组Ecoli、
Asu
物和产物浓度，嗣高渗透压的优点．且为兼性厌氧
黼”“，具有一定的丁业应用前景，但有关该蒲的发
酵培养条件鲜有报道。本文刘』4．suecinogenes130Z
厌氧发酵产丁_二酸的培养条件进行r初步的探讨。
1材料与方法
1．1菌种
产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillussuccinogenes
130Z)ATCC55618。
1，2培养基
1，2，1平板培养基
葡萄糖25 g／L，水解醅蛋白17∥L，NaCl5
g／L，K2HP042．5g／L．琼脂20∥L，pH7 5，121℃．
灭菌15rain。
1．22种子培养基
葡萄糖10g／L，酵母-膏5g／L，NaHCO，10g／L．
NaH2P04‘2H209．6g／i，，K2HP0415．5g／L，pH7．0，
121℃，灭茼15min，葡萄糖分开灭菌。
1．2．3发酵培养基
葡萄糖10g／L，酵母膏5g／L，NaHCO，10g／L，
Na2HP0403g／L，NaH2P04·2H209 6g／L，K2HP04
3g／L，MgCl202g／L，MnCt20．2g／L，NaCl0．1g／L，
pH7．0，121℃，灭菌15rain，葡萄糖分开灭菌。
1．3培养方法
1．31血清瓶种子培养
保存于一70℃冰箱的菌种，接种到平板37℃
厌氧培养箱活化培养12h；然后转接到种子培养基
中，转速120r／rain，振荡培养12h作为种子。
1．32血清瓶发酵培养
种子按体积分数5％接种量接人装有30mL发
酵液的100mLm清瓶中，摇床转速180r／rain，在
37ocF培养24h。
第5鲞蔓!塑
1 3．3分批培养
分批培养在5L发酵罐中进行(5LKoBio
TechCo，Ltd)。用10mol／L的NaOII控制plI存
7．0，N：和CO：的混合气体(V(N，)：y(CO：)=4：1)
的通八速度控制红0．2L／min，搅拌转速200r／rain。
1 4分析方法
1 4．1有机酸含量的测定
有机酸采用高效液相方法(IIPLC)测得(色谱
柱：反相Prevail有机酸色潜柱；流动相：25mmo[／L
KII，PO。；pll25；流动相流速：1mL／min；紫外检测
波长：215nm；进样量20乩；柱温为室温)。
1．4．2葡萄糖含量的测定
生物传感分析仪(SBA40C，山东省科。了：院生物
研究所)。
1．4．3菌体橱度的测定
紫外可见分光光度汁(Spectrumlab752S)于660
nnl(OD。。。)处测定吸光位。
1．4．4细胞十质量的测定
取干燥的5mT离心管称质量(m．)，取4mL发
酵液置J‘离心管中，1000r／nfin离心5min，弃上清
液；再用4mI．牛理盐水清洗苇复离心步骤；将沉淀物
连同离心管置F烘箱中，50℃下燥至恒质量，称质量
(m：)。细胞下质量P(g／m1．)=(m2一m。)／4。
2结果与讨论
2 1 有机氨源种类对菌体生长和产酸的影响
葡萄糖作为碳源，分别选择酵母膏、蛋向胨、玉
米浆和牛肉膏作为有机氮源，培养24h后测定菌体
干质量和丁二酸产量，相同条件下进行3次重复实
验，并取3次测昔的平均值，结果见图1、图2。
酵母膏蛋}：_{胨玉米浆牛肉膏
图1 不同氮源对菌体生物量的影响
Fig1 Effectsofnitrogensourcesoncell芦oⅢh
万方数据
2007年5月办溧等：Artinobacillus
succirtogertes 130Z厌氧发酵产丁二酸条件初步研究
·69酵母_膏堂白脉玉米浆牛肉膏
图2不同氮源对菌体产酸的影响Fig2Effectsof
nitrogerL s urcesonsuccinicacid
production
由图l和图2可知，以酵母膏作为有机氮源发
醉时，菌体生物量大，J二酸产量最高，可能是酵母
音中含有大量的牛长因子对菌株生长和产酸具有
促进作用。因此，选用酵母膏作为发酵有机氮源。2．2培养基碳氮比对菌体生长和产酸的影响
采用不同质量浓度的碳源和氮源配比，考察其
刘蔺体生【乏和细胞产丁二酸量的影响，结果盘u网3
幽4。0，h
十10∥L葡萄糖+5∥L酵母膏；
+20一L葡萄糖+7
5一L酵母膏+20以葡葡特+5-#L酵母膏： 十20∥L葡萄糖+10g几酵母膏
图3不同碳氨比条件下细胞生长图Fig3
Effects ofratiootCto
N012cellgrowth
由图3和图4可知：在葡萄糖浓度保持不变的
基础上提高酵母膏质量浓度，对菌体生长和产酸有
一定程度的促进作用，在两者的质量浓度按碳氮比
相同的原则(2：1)同时提高时，菌体130Z生长得到
最大限度的促进，丁二酸产量亦提高最为明显；然
而，在酵母膏质量浓度保持不变的摹础上再提高葡
十tOg／I．葡萄糖+5一L噼母膏：+20
g／L葡栉精+75一L酵母膏
十20∥L葡萄糖+5刚酵母膏；
十20∥T。葡萄糖+tO—L噼母膏 图4不同碳氮比条件下产丁二酸水平的比较
Fig4『mcts甜ratio
nf(．“}N㈣succiniu acidploduction
萄精的质量浓度(刚碳氮比增大)，刚发酵后期(18
h后)纲胞密度明总降低，J‘二酸产量也变低。以上
结果表明最佳碳氮比为21。2．3CO，供体的选择
厌氧发酵产丁=_酸的代谢途径中CO：和葡萄糖
一样作为底物被利用‘⋯，因此需要额外供给co，，
以保证丁_二酸的大量合成，若CO。供给／fj足，会造成
代谢支路流向乙酸支路，造成乙酸大量积累而丁二酸产量下降”。在10
g／I。葡萄糖底物质虽浓度下，选择20∥LNa，CO、、24
gLCaCO，和20g／[。
NaHCO，(n(葡萄糖)：n(CO：)=i：4(摩尔比))分别 作为C ：供体．发酵结果见表1。表1
不同co：供体对菌体产酸和代谢产物比率以殛pH的影响
Table lEffectsofC02donor
isuccinicac d
pri>duetitm ratioofp oductsand
plICO!
p(J一酸产量)丁二酸产量与发酵终点供体种类
／(g-L一) 己酸产量的比值pH8
10±()18700i010830±01235±0032．34±0．05
2．56±004566±003523±0 586±02
巾表1可以看出，Na2C03、CaC03。j NaHCO，均
可以作为co：供体，丁二酸产量与乙酸产量的比值
相当，说明它们都能够提供足够的co：，但Na：co，
和NaHCO，作为CO：供体时丁二酸产量耍高J’
CaCO，，另从发酵终点的pII亦能看出CaCO，的缓冲 加㈨¨Ⅲ他m㈣㈨¨毗∞(1一．掌q誉一
万方数据
．70． 生物加工过程
效果不如NaHCO，和Na。CO，，冈此血清瓶培养时选
择Na2C03或NaHC03作为C02供体。
2．4正交实验确定主要影响因子的最适用量
参照文献[9]．在以上研究的基础上，同定了
Na2HP0403，NaH2P04·2132096，K HP043，MgCl2
0．2等无机盐离子，比较葡萄糖、酵母膏和CO：供体
3个丰要因子对丁二酸产量的影响，选用正交表
L。(3。)，日．每组实验增加阿组重复(表2)。
表2正交实验设计方案与结果分析
Table2 Theolf【hogona[experimentdesigna dresultanalysis
g’L
由表2极差R值分析可以看出，3个因素影响
130Z产丁二酸能力的主次顺序为：葡萄糖的能力>
酵母膏的能力>NaHCO，的能力，最佳凶素水平为葡
萄糖10g／L、酵母膏5g／L、NaHCO，10g／L，进一步
说明最佳碳氮比为2：l。NaHCO，的最佳水平表明
碳源与CO。供体的最佳摩尔比符合1：2的理论值。
2 5培养温度对菌体生长和产酸的影响
温度对细胞生长和产物合成过程具有很重要
的影响，I叮且有时细胞生长和产物合成的最适温度
不同，在发酵过程中需要选择合适的培养温度。在
29℃，33℃，37℃，41qc，45℃下对130Z进行培
第5卷第2期
养，24h后测定细胞密度和丁二酸产量，相同条件
下进行3次重复实验，并取3次测量的平均值，结果
见幽5、图6。
l
￡，【℃
圈6培养温度对T--酸产量的影响
Fig6 Effectsoftemperatureonsuccinicacidwoduction
由图5、图6可知，培养温度为33气时，细胞密
度最大，丁二酸产量为6．2g／L；37℃培养时，菌体
产丁■酸量最高，达到8．2g／L，细胞密度与33℃培
养时相差不大，因此，选择37℃作为发酵培养温度。
温度达到45℃时，菌株不产丁二酸。
26培养基起始pH对菌体生长和产酸的影响
pH是一项重要的发酵参数，它对菌体的生长和
产物积累有很大的影响，发酵液pH影响微牛物细
胞原生质的电荷，能引起酶活力的改变，影响菌体
对底物的利用速度，以致影响菌体的生长和产物的
合成。在培养基起始p[1分别为5．0，5．5，6．0，6．5，
7．0，7．5，8．0，8．5，9．0时，对130Z进行培养，24h
后测定细胞密度和丁二酸产量，相同条件F进行3
次重复实验，并取3次测量的平均值，结果见图7、
图8。
万方数据
万方数据
生物加工过程 第5卷第2期
加速，细胞密度开始迅速增加，菌体进入刘数生长
期。发酵14h细胞密度达到最大值，而丁_二酸产量
继续增加．36h后葡萄糖消耗速度趋于零，至48h
发酵终点r一酸产罩可以达到45．6g／L，丁二酸收
率为65％。同10g／L葡萄糖底物质量浓度相比，
100g／T。葡萄糖底物质量浓度下，菌体生长较好，佃
1‘二酸收率有所下降。
3结论
(1)通过刘培养基成分中碳源、氮源及CO：供
休这3个主要囚素的研究，确定rA，succinogenes
130Z发酵产j二酸的最佳培养基配方：葡萄糖10
∥L，酵母膏5g／L，NaHCO，10∥L，Na2HPO。0．3
∥L，NaH2P04。2H209．6g／L，K2HP043g／L，MgCl2
02g／T-，MnCl20．2g／[．，NaC]01 g／L，pH7 0。
(2)通过对培养条件的研究，确定rA．succino—
genes130Z发酵产丁一酸的最住培养温度为37℃，
最佳起始pit为7．0，作为CO：供体的NaHCO，存提
供CO。的同时还起到缓冲发酵过程中生成的有机酸
的作用，从发酵终点的pH可知NatlCO。的缓冲效果
最好，说明CO：起作用的形式为CO，／Hco；，具体原
理及影响还在进一步研究中。
(3)在以上所确定的最仕条件下，10∥L葡萄
糖底物质量浓度时血清瓶37℃培养24h，丁二酸产
茸达到83 g／T，5L发酵罐的丁二酸产量可以达到
8．2g／I．，收率达到80％；100g／I．葡萄糖底物初始质
昔浓度下的5L发酵罐培养．J‘二酸产量可以达到
456g／L，收率达到65％。
参考文献：
『I 1 ZeikusJG，JainMK，ElankovanP．Bioleehnofogyofsaccinie
acidproducforl undMkelforderiveAindust2ialproductsJj
ApplNicrobiolB oteehnol，1999，5l：525-545
12』GuttlerMV，Jair．MK，SoniBK．PⅢ㈣focmakingⅦ㈨Ⅲ
acid．micmorgunlsmsfor11Seintheprocessandmethodsforobtai—
ning、ariantsUS5，72322[P?1998433473
。3。CokamRR，Eit⋯t⋯MA，ALtenan}}Xpzessionofpymvale
carboxylasceiihancc$$tlCCi[1ateproductioninEscherlchiacD“with
oulaffeclingglucoseuphtke【JJ BiotechnologyLettm5，1998．20
(8)：795798
14J f，‘，kan／I／II，EvansJ 11，WalkerJ R，etal Thephysiological
effectsandmetahuIicalterationsCaLledbythe xpression。fRhizo
biumetltpyTuvatecmboxylascinEc。妒J]3．pplMicrobiolBio—
technol，2001，56(I／2)：188195
L5j‰kD 1I，ZeikusJGUtilizationofelectrically1cducod!mutra!
redbyActinobacillassuccin。w⋯Physioh’glcalmn|⋯"ofiiRll—
tralredinmetl2hroJlc—drivenftm]aratereductionandcncr目Con
servalion【1]JBacte,⋯c1999，18 【8)：2403-2410
[6]ParkDH，LaivenieksM：GuetdcrMV，elal Microbialotiliza—
Iionofelecl【ica[iyreducedn utraledasthesolelectrond or
forgrowthandmetaboliteproduction[J]ApplEnvironMfombi-
n】．1999，65：2912-2917
[7]kPC，LecW．LeesY，eln1 Effectsofmedium∞⋯p
IlelltSonthecellgrowthnf4naerobiospBrillumsuceinieiproducensan
succinicacidproduclion：J‘ProcessBiochemislty，1999，35(1／
2)．49-55
[8]l,eePC，I eW(；，IeesY．Pl。lISuccinicacidproducllO]awith
reducedby—productformationinthefemmntationofA’laerobiospi
rillums ：clniqoroduceoc IJseglycHnIl∞acadmusourr_elJ Bio—
tectmo／Biocttg．2000，72·4148
[9 ImPC eeWI；，If#5Y，elal Batchandcontinu(}Iiscultiva-
lionofdnaerobiospirilh*msuccin∽rodu—fortheproductionof
succinicacidfromwhey[JjApplMicrobiolB teehnol，2000，
54：2327
[10‘GuettlerMV，RumforD，JainMK 4ctinobacillmcsuccinogenss
sp．nova novelRI】㈣mll-acid—plodm：ingstrainfromIhebovinenp
meH[J]InteinationalJournalofSystenmtieBaclerio[o,g／，1999
49：207—216
L1【]McKinlayJ B，ZeikusJc，ClailPVieillelnsl曲【sentoActinoba-
mll嘴smeinogenesfemml3tativemetabolisminachemicallydefined
growthmodimn[JApplAOdEnvimnmentaIMicrobiology．
2005，71(11)：6651_|5656
[12J J㈣PC，I㈣Ⅳ氓JwSY，etat Sueelnieac dproductionby
Anaerobiospirillum5uc￡ut”Produ黼m：Effectsot Hl／CO=supply
Ⅻddwoseconcentration[J]EnzymeandMicrobialTcchnolo＆,，
199924549j54
万方数据