全 文 ：第７卷第４期
２００９年７月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．４
Ｊｕｌｙ２００９
ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１７６２－３６７８．２００９．０４．００９
收稿日期：２００８－１１－０６
基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３计划）重点资助项目（２００９ＺＸ０９３０６－００１）
作者简介：曹 丹（１９８３—），女，浙江上虞人，硕士研究生，研究方向：应用微生物；王学东（联系人），副研究员，Ｅｍａｉｌ：ｘｄｗａｎｇ＠ｅｃｕｓｔ．ｅｄｕ．ｃｎ
产唾液酸酶微生物的筛选及产酶条件的优化
曹 丹，王学东，张鲁嘉，张建国，魏东芝
（华东理工大学 生物反应器工程国家重点实验室，上海 ２００２３７）
摘 要：以无单唾液酸四己糖神经节苷脂（ＧＭ１）的神经节苷脂为唯一 Ｃ源，从土壤中筛选出１株能以多唾液酸
神经节苷脂为底物，转化生成ＧＭ１的产唾液酸酶微生物，经鉴定为溶黄嘌呤厄菌（Ｏｅｒｓｋｏｖｉａｘａｎｔｈｉｎｅｏｌｙｔｉｃａ）。利
用单因素法和响应面分析法对溶黄嘌呤厄菌产生唾液酸酶的条件进行优化，酶活提高了４．８９倍。利用优化后
培养条件，以神经节苷脂混合体为底物，经过微生物生物转化后，单唾液酸神经节苷脂 ＧＭ１的含量从１０％提高
到８３．７％。
关键词：唾液酸酶；生物转化；单唾液酸四己糖神经节苷脂；溶黄嘌呤厄菌
中图分类号：Ｑ８１５；Ｑ８１９ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０４－００４０－０６
Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｓｉａｌｉｄａｓｅｐｒｏｄｕｃｉｎｇｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍａｎｄ
ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎｏｆｓｉａｌｉｄａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
ＣＡＯＤａｎ，ＷＡＮＧＸｕｅｄｏｎｇ，ＺＨＡＮＧＬｕｊｉａ，ＺＨＡＮＧＪｉａｎｇｕｏ，ＷＥＩＤｏｎｇｚｈｉ
（ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＢｉｏｒｅａｃｔｏｒＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＥａｓｔＣｈｉｎａＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００２３７，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｅｒｓｋｏｖｉａｘａｎｔｈｉｎｅｏｌｙｔｉｃａ—ｔｈｅｓｔｒａｉｎｗｈｉｃｈｕｓｅｄｔｏｃｏｎｖｅｒｔｐｏｌｙｓｉａｌｏｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｉｎｔｏｍｏｎｏｓｉａｌｏ
ｔｅｔｒａｈｅｘｏｓｙｌｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅ（ＧＭ１）ｗａｓｅｆｉｃｉｅｎｔｌｙｓｃｒｅｅｎｅｄｆｒｏｍｓｏｉｌｔｈｒｏｕｇｈｈｉｇｈｆｌｕｘｓｃｒｅｅｎｉｎｇｏｆｓｉａｌｉｄａｓｅ
ｐｒｏｄｕｃｉｎｇｂａｃｔｅｒｉｕｍｗｉｔｈｆｒｅｅＧＭ１ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓａｓｔｈｅｓｏｌｅｓｏｕｒｃｅｃａｒｂｏｎ．Ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｆｏｒｍａｘｉ
ｍｕｍｅｎｚｙｍｅａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｏｐｔｉｍｉｚｅｄｂｙｓｉｎｇｌｅｆａｃｔｏｒｒｅｓｐｏｎｓｅｓｕｒｆａｃｅａｎａｌｙｓｉｓ．Ｔｈｅｓｔｒａｉｎｗａｓｃｕｌｔｕｒｅｄｉｎ
ｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｍｅｄｉｕｍｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｃｒｕｄｅｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ（１０％ ｗ／ｖ）ａｔ３７℃ ｆｏｒ１２ｈ．Ｍｏｓｔｏｆｔｈｅｐｏｌｙｓｉａｌｏ
ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓａｒｅｃｏｎｖｅｒｔｅｄｉｎｔｏＧＭ１．ＴｈｅｒｅｌａｔｉｖｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆＧＭ１ｉｎｃｒｅａｓｅｄｆｒｏｍ１０％ ｔｏ８３７％ ｉｎｔｈｅ
ｃｒｕｄｅｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｓｉａｌｉｄａｓｅ；ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｍｏｎｏｓｉａｌｏｔｅｔｒａｈｅｘｏｓｙｌｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ；Ｏｅｒｓｋｏｖｉａｘａｎｔｈｉｎｅｏｌｙｔｉｃａ
神经节苷脂（ｇａｎｇｌｉｏｓｉｄｅｓ）是含有１个或者多个
唾液酸的鞘糖脂，是大多数哺乳动物细胞膜的组成
成分。单唾液酸四己糖神经节苷脂（ＧＭ１）在中枢
神经系统含量尤为丰富，能通过脑血屏障，嵌入神
经细胞膜结构，调节膜介导的细胞功能，刺激中枢
神经系统损伤后潜在的代替机制，阻止损害的发
展，保护未受损的神经组织，在细胞的分化发育、神
经组织的修复、神经元的可塑性等方面起着重要作
用［１－３］，可用于中风、脊髓损伤和 Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ的早期
治疗［４－７］。ＧＭ１在国内外已广泛应用于临床，但传
统生产神经节苷脂使用萃取和层析分离的方法收
率低、溶剂消耗量大、成本高，造成神经节苷脂治疗
费用昂贵［８］。
唾液酸酶（ＥＣ３．２．１．１８）是一类可以水解糖蛋
白、寡糖、多糖、糖脂非还原末端唾液酸的水解酶，
利用该酶促反应可以将多唾液酸神经节苷脂转化
生成ＧＭ１［９］。生物转化法制备ＧＭ１的关键问题是
酶的底物特异性和转化效率。
本论文以无ＧＭ１神经节苷脂作为唯一Ｃ源，筛
选能高效转化产生ＧＭ１的菌株，并通过单因素实验
和响应面分析，优化唾液酸酶的生成条件，为高效
地将多唾液酸神经节苷脂转化为ＧＭ１提供基础。
１ 材料与方法
１．１ 材料
１１１ 土壤试样
采于华东理工大学校园。
１１２ 富集培养基（ＬＢ培养基）
酵母粉 ５ｇ／Ｌ，蛋白胨１０ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ。ｐＨ
７．０，１２１℃灭菌２０ｍｉｎ。
１１３ 筛选培养基
酵母粉０．５ｇ／Ｌ，蛋白胨１０ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ，
无ＧＭ１神经节苷脂 １０ｇ／Ｌ。ｐＨ７．０，１２１℃灭菌
２０ｍｉｎ。
１１４ 其他药品
神经节苷脂混合体 本实验室制备；４ 甲基伞
形基 Ｎ 乙酰神经氨酸（４ＭＵＮｅｕＡｃ）Ｓｉｇｍａ公司；
１６ＳｒＤＮＡ引物：ＡＣＧＧＧＣＧＧＴＧＴＧＴＡＣ、ＣＣＴＡＣＧＧ
ＧＡＧＧＣＡＧＣＡＧ、Ｔａｑ酶、ｄＮＴＰ上海生物工程公司；
其他为分析纯试剂。
１２ 方法
１２１ 菌种筛选
水中加入１０％土壤，搅拌过滤，转接到富集培
养基，３７℃、２００ｒ／ｍｉｎ，培养１６ｈ。
筛选培养基中转接１％富集的菌液，３７℃、２００
ｒ／ｍｉｎ，摇瓶培养。２４ｈ后，每隔 １２ｈ取样，１００００
ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ。上清液做薄层层析分析［１０－１１］。
如果检测到有ＧＭ１产生，则再以神经节苷脂为唯一
Ｃ源的筛选培养基进行多次转接，确定筛选结果，经
过４～５次初步筛选，证明其中确实存在能转化多唾
液酸神经节苷脂生成ＧＭ１的微生物。
将初筛的菌液稀释（内含玻璃珠），再进行梯度
稀释，涂于ＬＢ平皿，３０℃培养２４～３６ｈ。挑取单
菌落，转接至营养琼脂斜面保存，并在转化培养基
中进行神经节苷脂底物转化实验。经过多次的菌
种分离纯化和底物转化验证实验，得到能转化多唾
液酸神经节苷脂为ＧＭ１的微生物纯培养。
１２２ 菌种鉴定
观察所挑出的微生物单菌落，根据其形态特征
以及微生物染色特性进行微生物种类的初步鉴定。
通过１６ＳｒＤＮＡ鉴定菌种分类。１６ＳｒＤＮＡＰＣＲ
扩增反应体系 ２５μＬ：１０ ×ＰＣＲ缓冲液（包含
Ｍｇ２＋）２５μＬ，４×ｄＮＴＰ（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）１５μＬ，
上下游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ）各１５μＬ，模板ＤＮＡ０５
μＬ，双蒸水１７５μＬ，Ｔａｑ酶（５Ｕ／μＬ）０２μＬ。反
应条件为：９４℃ ３ｍｉｎ，９４℃ １ｍｉｎ，５５℃ １ｍｉｎ，
７２℃ ２ｍｉｎ（３５个循环），７２℃ １０ｍｉｎ。ＰＣＲ反应
在ＰＴＣ ２００型热循环仪上进行。反应结束后取５
μＬ反应液在质量分数１％琼脂糖凝胶上进行电泳
检测。得到的ＰＣＲ产物送交测序。
１２３ 唾液酸酶酶活测定方法
以４ＭＵＮｅｕＡｃ作为测定酶活底物。１０μＬ１
ｍｍｏｌ／Ｌｏｆ４ＭＵＮｅｕＡｃ，１０μＬ待测唾液酸酶溶液，
８０μＬ２００ｍｍｏｌ／ＬｐＨ５８的乙酸钠缓冲液，３７℃
反应１０ｍｉｎ后加入２００μＬ的１ｍｏｌ／ＬｐＨ１０４甘
氨酸 氢氧化钠缓冲液终止反应。在波长３５５ｎｍ／
４６０ｎｍ下，用 ＴｈｅｒｍｏｌＦｌｕｏｒｏｓｃａｎｓｐｅｃｔｒｏｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ
检测４ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｉｆｅｒｏｎｅ（４ＭＵ）的荧光值。唾液
酸酶酶活和检测荧光值成正比［１２］。以煮沸的酶液
作为对照。每分钟水解１μｍｏｌ底物定义为１个比酶
活单位（Ｕ／ｍＬ）。
１２４ 神经节苷脂薄层层析分析
展开剂 Ｖ（三氯甲烷）∶Ｖ（甲醇）∶Ｖ（０２％
ＣａＣｌ２）＝５５∶４５∶９。
显色剂１０ｍＬ，质量分数２％间苯二酚 ＋８０ｍＬ
浓盐酸＋０２５ｍＬ０１ｍｏｌ／ＬＣｕＳＯ４加水到１００ｍＬ，
４℃保存可使用 １周。展层后吹干薄板上的展层
剂，将显色剂均匀地喷在薄板上，放置于１１０℃烘箱
中显色２０ｍｉｎ，神经节苷脂呈现蓝紫色斑点。用岛
津薄层扫描仪 ＣＳ９３００在 ５８０ｎｍ下扫描分析神经
节苷脂各组分相对含量。
１２５ 培养基组成优化
优化所筛选微生物发酵产酶及生物转化条件。
单因素实验培养条件：２００ｒ／ｍｉｎ、３７℃培养２４ｈ，接
种量５％，神经节苷脂混合体粗品加量为１ｇ／Ｌ；其
他培养条件及培养基组成按设计中所取的水平。
１２６ 转化粗品的提取
将转化结束后的发酵液１００００ｒ／ｍｉｎ离心 １５
ｍｉｎ，弃去菌体。利用旋转蒸发仪将上清浓缩，加入
３倍丙酮沉淀，烘干，得到转化后神经节苷脂粗品。
１４ 第４期 曹 丹等：产唾液酸酶微生物的筛选及产酶条件的优化
１２７ ＧＭ１的质谱检测
使用ＨｉｔａｃｈｉＭ８０质谱仪，测试电喷雾（ＥＳＩ）。
２ 结果与讨论
２１ 菌种筛选
根据采集土样微生物的摇瓶初筛结果，加入神
经节苷脂为唯一Ｃ源的培养基，对有转化作用的微
生物进行富集培养和菌种分离纯化，经过４～５次转
移培养和神经节苷脂转化验证，筛选到５株能转化
生产ＧＭ１的微生物（表１）。其中１株菌（ＹＺ ２）
具有较好的转化效果，其菌落形态为柠檬黄色、圆
形湿润的菌落，菌体形态为短杆菌，革兰氏染色阳
性。通过５９３ｂｐ１６ＳｒＤＮＡ序列与ＮＣＢＩ比对（登录
号ＥＵ７４７０５１），并经上海市疾病预防中心鉴定为溶
黄嘌 呤 厄 菌 （Ｏｅｒｓｋｏｖｉａ ｘａｎｔｈｉｎｅｏｌｙｔｉｃａ，ＣＣＴＣＣ
Ｍ２０４０３２），以此菌进行下一步的转化条件优化。
表１ 筛选微生物转化结果
Ｔａｂｌｅ１ Ｂｉｏｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｂｙｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ
转化
产物 底物
菌株
ＹＺ １ＹＺ ２ ＹＺ ３ ＹＺ ４ ＹＺ ５
ＧＭ２ — — — — — ＋
ＧＭ１ — ＋＋＋＋＋＋ ＋ ＋ ＋
ＧＤ１ａ ＋＋＋ ＋ ＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋
ＧＤ１ｂ ＋＋ ＋ － ＋＋ ＋＋ ＋＋
ＧＴ ＋＋ — ＋ ＋ ＋ ＋
注：１—“＋”检测表示有产物产生，“—”表示无；２—Ｇ表示
神经节苷脂；Ｍ表示带有１个唾液酸；Ｄ表示带有２个唾
液酸；Ｔ表示带有３个唾液酸。
２２ 培养条件优化
唾液酸酶是通过诱导产生的胞外酶，其诱导酶
活产生的水平受培养基和培养条件等多种因素的
影响，并进而影响底物的转化效果。因此对产酶条
件的优化是必要的。
２２１ 培养温度对酶活产生的影响
将发酵液分别置于２８、３０、３７、４０℃培养，测定
生物量及比酶活（图１）。由图１可知，当培养温度
达到３７℃时，最高比酶活为１６８６Ｕ／ｍＬ。
２２２ 培养基 ｐＨ对酶活产生的影响
调节转化培养基的初始ｐＨ，培养后测定生物量
及比酶活（图 ２）。由图 ２可知，初始 ｐＨ控制在
７０～９０，对菌体生长影响不大，但对于酶的生成影
响较大。当ｐＨ为８０时，最高比酶活为１７９Ｕ／ｍＬ。
图１ 温度对产唾液酸酶的影响
Ｆｉｇ．１ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｓｉａｌｉｄａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
图２ ｐＨ对产唾液酸酶的影响
Ｆｉｇ．２ ＥｆｅｃｔｓｏｆｐＨｏｎｓｉａｌｉｄａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２２３ 底物加入时间对酶活的影响
使用转化培养基，在转化培养过程中的不同时
间加入质量分数１％等量底物。培养结束后测定生
物量及比酶活的变化（图３）。由图３可知，随着神
经节苷脂底物加入时间的延迟，菌体浓度呈上升趋
势，而酶活则是先上升后下降，在７ｈ加入时达到最
高。可以看出，底物（或其中的杂质）可被菌体利用
而促进其生长，加入晚则更能延续菌体的生长，提
高了最终的生物量，而酶活的产生与菌体生长过程
和诱导时间有关，而加入过晚（对数期后）则不利于
产酶。
图３ 加入底物时间对产唾液酸酶的影响
Ｆｉｇ．３ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｓｕｂｓｔｒａｔｅａｄｄｉｔｉｏｎｔｉｍｅｏｎ
ｓｉａｌｉｄａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２４ 生 物 加 工 过 程 第７卷
２３ 培养基优化
２３１ 酵母粉加量对酶活的影响
酵母粉质量浓度分别为０、１０、２０、３０、４０ｇ／Ｌ，蛋
白胨１０ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ进行培养，测定生物量和
比酶活（图４）。由图４可知，酵母粉能较好被菌体
利用，促进酶活的产生。酵母粉加量达３０ｇ／Ｌ时，
最高比酶活为４４７Ｕ／ｍＬ。
图４ 酵母粉含量对产唾液酸酶的影响
Ｆｉｇ．４ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｙｅａｓｔｐｏｗｅｒｏｎｓｉａｌｉｄａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２３２ 蛋白胨质量浓度对酶活的影响
蛋白胨质量浓度分别为０、５、１０、２０、３０ｇ／Ｌ，酵母
粉３０ｇ／Ｌ，ＮａＣｌ１０ｇ／Ｌ进行培养，测定生物量和比酶
活（图５）。由图５可知，蛋白胨质量浓度超过５ｇ／Ｌ
时，能促进菌体的生长，但对唾液酸酶影响较小。蛋
白胨加量达５ｇ／Ｌ时，最高酶活为４５１Ｕ／ｍＬ。
图５ 蛋白胨质量浓度对产唾液酸酶的影响
Ｆｉｇ．５ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｐｅｐｔｏｎｅｏｎｓｉａｌｉｄａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
２３３ ＮａＣｌ质量浓度对酶活的影响
ＮａＣｌ质量浓度分别为０、２５、５、１０、２０、３０ｇ／Ｌ，
酵母粉３０ｇ／Ｌ，蛋白胨５ｇ／Ｌ进行培养，测定生物
量和比酶活（图６）。由图６可知，ＮａＣｌ质量浓度为
１０ｇ／Ｌ时，比酶活最高，达到４５１Ｕ／ｍＬ。
２３４ 响应面法优化酶活
针对ＬＢ培养基３个成分，以单因素实验中结
果最佳值为中心，设定响应面实验因素水平［１３］（表
２）。采用Ｍｉｎｔａｂ软件的响应面分析和中心组合分
图６ ＮａＣｌ质量浓度对产唾液酸酶的影响
Ｆｉｇ．６ ＥｆｅｃｔｓｏｆＮａＣｌｏｎｓｉａｌｉｄａｓｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ
析进行分析。分析设计和酶活实验结果见表３。
表２ 响应面中心组合设计的因素及水平
Ｔａｂｌｅ２ Ｖａｌｕｅｓｏｆｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｖａｒｉａｂｌｅｓａｔｄｉｆｅｒｅｎｔ
ｌｅｖｅｌｓｏｆｔｈｅｄｅｓｉｇｎ ｇ·Ｌ－１
因素 因子
水 平
－１６８２ －１ ０ １ １６８２
酵母粉 Ｘ１ ２１６ ２５ ３０ ３５ ３８４
蛋白胨 Ｘ２ １６４ ３ ５ ７ ８３６
ＮａＣｌ Ｘ３ １６ ５ １０ １５ １８４
响应面分析结果如表４所示。根据响应面实验
分析的各因素效应结果，由 Ｍｉｎｔａｂ软件拟合得回归
方程为：ｙ＝６００８８０－２５８１７ｘ１ ＋２６５６５ｘ２ －
１７７３９ｘ３ －１６１７２ｘ
２
１ －１１３８１ｘ
２
２ －２７４６８ｘ
２
３ －
３２８８ｘ１ｘ２－１６７８７ｘ１ｘ３＋１１１１２ｘ２ｘ３
在α＝００５水平上，决定系数（Ｒ２）＝９０１９％，
表明９０１９％的酶活变化可由此模型解释，可用于
唾液酸酶产酶条件的预测。运用 Ｍｉｎｔａｂ寻求到最
大比酶活量及相应的因素水平，回归模型的中心
点，得到优化后的培养基组分：酵母粉、蛋白胨、ＮａＣｌ
量分别为２４５、８０、１１６ｇ／Ｌ，该模型预测的最高比
酶活力为６３２Ｕ／ｍＬ。在优化后的培养基和培养条
件下进行３组平行实验，得到唾液酸酶比酶活的平
均值为６３６Ｕ／ｍＬ。与回归方程所得的预测相接近，
说明回归方程能较好地预测实际酶活情况。
优化后的产酶培养基组成为（ｇ／Ｌ）：酵母粉
２４５，蛋白胨８０，ＮａＣｌ１１６。培养条件：发酵温度
为３７℃，培养基起始ｐＨ８０，摇床转速２００ｒ／ｍｉｎ，
接种量为５％，培养７ｈ后加入１％底物，培养２４ｈ，
比酶活可以达到 ６３６Ｕ／ｍＬ，比优化前提高了
４８９倍。
３４ 第４期 曹 丹等：产唾液酸酶微生物的筛选及产酶条件的优化
表３ 响应面中心组合和实验设计及结果
Ｔａｂｌｅ３ Ｃｅｎｔｒａｌｃｏｍｐｏｓｉｔｅｄｅｓｉｇｎｆｏｒｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｄｅｓｉｇｎａｎｄｐｒｅｄｉｃｔｅｄｒｅｓｕｌｔｓ
编号
因 子
编码水平 实际水平／（ｇ·Ｌ－１）
ｘ１ ｘ２ ｘ３ Ｘ１ Ｘ２ Ｘ３
比酶活／
（Ｕ·ｍＬ－１）
１ －１ １ １ ２５ ７ １５ ６２３６
２ ０ １６８２ ０ ３０ ８３６ １０ ５７４５
３ ０ －１６８２ ０ ３０ １６４ １０ ５３７７
４ ０ ０ ０ ３０ ５ １０ ５９８８
５ ０ ０ ０ ３０ ５ １０ ６０８９
６ １ １ １ ３５ ７ １５ ５４１９
７ －１６８２ ０ ０ ２１６ ５ １０ ５９２７
８ ０ ０ ０ ３０ ５ １０ ５９７５
９ ０ ０ １６８２ ３０ ５ １８４ ４８７９
１０ １ －１ １ ３５ ３ １５ ４４６６
１１ ０ ０ ０ ３０ ５ １０ ５９６８
１２ ０ ０ ０ ３０ ５ １０ ６０３９
１３ ０ ０ ０ ３０ ５ １０ ６０３７
１４ １ １ －１ ３５ ７ ５ ５９０３
１５ １６８２ ０ ０ ３８４ ５ １０ ４９２４
１６ －１ １ －１ ２５ ７ ５ ６１３７
１７ －１ －１ １ ２５ ３ １５ ５２４０
１８ １ －１ －１ ３５ ３ ５ ５４８３
１９ ０ ０ －１６８２ ３０ ５ １６ ５３３３
２０ －１ －１ －１ ２５ ３ ５ ５４９７
表４ 回归模型系数估计
Ｔａｂｌｅ４ Ｅｓｔｉｍａｔｅｄｃｏｅｆｉｃｉｅｎｔｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎｍｏｄｅｌ
方差来源 回归系数 标准误差 Ｔ值 Ｐ值
常量 ６００８８０ ８５７８ ７００４８ ００００
ｘ１ －２５８１７ ５６９１ －４５３６ ０００１
ｘ２ ２６５６５ ５６９１ ４６６８ ０００１
ｘ３ －１７７３９ ５６９１ －３１１７ ００１１
ｘ１ｘ１ －１６１７２ ５５４０ －２９１９ ００１５
ｘ２ｘ２ －１１３８１ ５５４０ －２０５４ ００６７
ｘ３ｘ３ －２７４６８ ５５４０ －４９５８ ０００１
ｘ１ｘ２ －３２８８ ７４３６ －０４４２ ０６６８
ｘ１ｘ３ －１６７８７ ７４３６ －２２５８ ００４８
ｘ２ｘ３ １１１１２ ７４３６ １４９４ ０１６６
２４ 生物转化
在优化后的转化条件下，以神经节苷脂粗品为
底物进行微生物转化。将转化产物浓缩、沉淀、烘
干后得转化产物，转化收率为７０％，ＧＭ１相对含量
０—神经节苷脂混合体；
１—ＧＭ１标准品；２—转化后产物
图７ ＧＭ１神经节苷脂转化结果ＴＬＣ分析
Ｆｉｇ．７ ＣｏｎｖｅｒｓｉｏｎｒｅｓｕｌｔｓｏｆｃｒｕｄｅＧＭ１ｂｙＴＬＣ
从１０％提高到８３７％（图７）。转化试样经硅胶层
析分离纯化后做质谱分析，ｍ／ｚ结果显示试样有２
４４ 生 物 加 工 过 程 第７卷
种相对分子质量物质１５４５和１５７３（由于脂肪酸链
的不同，分别为 Ｃ１８和 Ｃ２０），试样的质谱图谱与
ＧＭ１的图谱一致。
３ 结 论
以无ＧＭ１的神经节苷脂为唯一Ｃ源，从土壤中
筛选到１株产唾液酸酶微生物，经鉴定为溶黄嘌呤
厄菌。在培养过程中加入神经节苷脂可诱导该菌
产唾液酸酶，能够转化多唾液酸神经节苷脂生成
ＧＭ１。以ＬＢ培养基为基础，通过优化，最大比酶活
提高到６３６Ｕ／ｍＬ，相对于初始比酶活提高了４８９
倍。根据此优化培养基，通过微生物转化混合体中
的多唾液酸神经节苷脂为ＧＭ１，其相对含量从１０％
提高到８３７％，收率可达到７０％。该菌产唾液酸酶
专一性好，转化效率高，适用于ＧＭ１的工业化制备。
参考文献：
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ｍｅｔａｂｏｌｉｃａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｒａｔｓｗｉｔｈｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｍｏｎｏｎｅｕｒｏｐ
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５４ 第４期 曹 丹等：产唾液酸酶微生物的筛选及产酶条件的优化