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ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.10No.3
May2012
doi:10.3969/j.issn.1672-3678.2012.03.010
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Porcinepancreaticlipaseimmobilisedonnanosilvermesoporous
activatedcarboncomposite
YANGBo,WANGWei,ZHUKai,WANGHuan,HANPingfang
(ColegeofBiotechnologyandPharmaceuticalEngineering,NanjingUniversityofTechnology,Nanjing210009,China)
Abstract:Thestudywascariedouttoimmobilizeporcinepancreaticlipase(PPL)onnanosilvermeso
porousactivatedcarbon(AgMAC).MACwaspreparedfromricehuskbyatwostageprocessandnano
silverwasabsorbedonthesurface.PPLwasthenimmobilizedonAgMACandconditionswereopti
mized.Resultsshowedthatundertheconditionsofthesilvernitrateconcentrationof001mol/L,immo
bilizationtimeof6h,reactivephosphatesolutionofpH6.0,reactiontemperature25℃,thelipaseac
tivityincreasedby3.2times.Meanwhile,N2adsorptiondesorption(BET),scanningelectronmicroscopy
(SEM),Fouriertransforminfraredspectroscopy(FTIR)wereusedtoanalyzeexperimentalresults,and
confirmtheefectsofAgMACinexperimentsoflipaseimmobilization.
Keywords:mesoporousactivatedcarbon;immobilization;nanosilver;porcinepancreaticlipase
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M©6u
:
[1] SivozhelezovV,BruzzeseD,PastorinoaL,etal.Increaseofcata
lyticactivityoflipasetowardsoliveoilbylangmuirfilmimmobi
lizationoflipase[J].EnzymMicrobTech,2009,44(2):7276.
[2] GhiaciM,AghaeiH,SoleimanianS,etal.Modifiedbentoniteasa
newandeficientsupportforimmobilizationofCandidarugosa
lipase[J].ApplClaySci,2009,43(3/4):289295.
[3] QuintanaP,BaldessariA.Lipasecatalyzedregioselectiveprepara
tionoffatyacidestersofhydrocortisone[J].Steroids,2009,74
(13/14):10071014.
[4] GutierezA,CareliA,FrreiraM.Relationbetweenlipasestruc
turesandtheircatalyticabilitytohydrolysetriglyceridesand
phospholipids[J].EnzymMicrobTech,2007,41(1/2):3543.
[5] MacedoJ,OtuboL,FereiraP,etal.Biomorphicactivatedporous
carbonswithcomplexmicrostructuresfromlignocelulosicresidues
[J].MicroporMesoporMat,2008,107(3):276285.
[6] GaneshA,SwarnalathaS,KamatchiP,etal.Immobilizationof
highcatalyticacidproteaseonfunctionalisedmesoporousactiva
tedcarbonparticles[J].BiochemEngJ,2009,43(2):18590.
[7] GaneshA,PerinbamK,KamatchiP,etal.Insituimmobilization
ofacidproteaseonmesoporousactivatedcarbonpackedcolumn
fortheproductionofproteinhydrolysates[J].BioresTech,2010,
101(4):13771379.
[8] RamaniK,BoopathyR,VidyaC,etal.Sekaran.Immobilizationof
Pseudomonasgesardiacidiclipasederivedfrombeeftalowonto
mesoporousactivatedcarbonanditsapplicationonhydrolysisof
oliveoil[J].ProcBiochem,2010,45(6):986992.
[9] KandasamyR,KennedyLJ,VidyaC,etal.Immobilizationof
acidiclipasederivedfromPseudomonasgesardiontomesoporous
activatedcarbonforthehydrolysisofoliveoil[J].JMolCatalB:
Enzym,2010,62(1):5966.
[10]
lÐÑ
,
Ò©A
.
Ý ÒYåiPþVM¶·¸¹>Æ
Ç
[J].
Xoo*
,2002,60(3):393397.
[11]
A¥Þ
,
ÓvÔ
,
ÀW
,
ø
.Ag/P(St2MMA)
Yûi
-üm¢£Xqr¿öXV>ÆÇ
[J].
XÑÄ
,2007,15
(1):912.
[12] KennedyLJ,VijayaJJ,SekaranG.Efectoftwostageprocesson
thepreparationandcharacterizationofporouscarboncomposite
fromricehuskbyphosphoricacidactivation[J].IndEngChem
Res,2004,43(8):18321838.
[13] LiYanjing,ZhouGuowei,QiaoWenting,etal.Immobilizationof
porcinepancreaslipaseonfiberlikeSBA15mesoporousmaterial
materials[J].MatSciEngB,2009,162(2):120126.
[14] DingHaomin,LeiShao,LiuRunjing,etal.Silicananotubesforly
sozymeimmobilization[J].JColIntSci,2005,290(1):102106.
[15] KatiyarA,JiL,SmirniotisP,etal.Proteinadsorptionontheme
soporousmolecularsievesilicateSBA-15:efectsofpHandpore
size[J].JChromat,2005,1069(1):119126.
[16] VinuA,MurugesanV,TangermannO,etal.Adsorptionofcyto
chromeconmesoporousmolecularsieves:influenceofpH,pore
diameter,andaluminumincorporation[J].ChemMat,2004,16
(16):30563065.
[17] CrespilhoFN,IostRM,TravainSA,etal.Enzymeimmobiliza
tiononAgnanoparticles/polyanilinenanocomposites[J].Biosens
Bioelectr,2009,24(10):30733077.
[18] KrajewskaB.Mono(Ag,Hg)anddi(Cu,Hg)valentmetalions
efectsontheactivityofjackbeanurease:probingthemodesof
metalbindingtotheenzyme[J].EnzymInhibMedChem,2008,
23(4):535542.
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