全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 月
生"物"加"工"过"程
-:@CE0E]BHFC,.BDY@B1FBIE00TCJ@CEEF@CJ
bB.2! +B2#
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GB@"&%2(/*/6_2@00C2&*$ =(*!2$%&%2%#2%%!
收稿日期"$%&% =%# =%&
基金项目"国家自然科学基金重点资助项目#$%/(*%%$$%国家重点基础研究发展计划#/( 计划$资助项目#$%%/-Y$#%)$%国家高技术研究
发展计划#!*( 计划$资助项目#$%%*55%$P$(!$
作者简介"孟"彦#&/!(&$男浙江绍兴人硕士研究生研究方向"生物催化与转化%杨立荣#联系人$教授TRA,@.".FK,CJc9_H2EGH2IC
固定化脂肪酶催化制备 , 薄荷醇
孟"彦吴坚平徐"刚杨立荣
#浙江大学 化学工程与生物工程学系杭州 (&%%$$
摘"要"用大孔树脂+N5固定高选择性的脂肪酶催化有机相中转酯化反应从而拆分八异构体消旋薄荷醇来制
备 ! 薄荷醇( 研究 14)载体与酶比例对固定化酶制备的影响及固定化酶的反应稳定性%考察温度)转酯化过程醇
酯比例)及底物醇异构组成变化对拆分效果的影响( 结果表明"固定化酶的最适 14为 !载体与酶的比例为)p&时
所得固定化酶的反应稳定性比游离酶的反应稳定性提高了约 )%i%转酯化反应的最优温度为 #% e醇酯比例为
&d)p&时最佳改进八异构体消旋薄荷醇组分比例后非对映体选择率 2%
1
达到了 /)d&i(
关键词"固定化脂肪酶%! 薄荷醇%转酯化
中图分类号"f7%((""""文献标志码"5""""文章编号"&*$ =(*!#$%&%$%# =%%(/ =%*
W42I3:F.2/27,VG0/F-26JA .GG2J.6.H0I0/HAG0V:5F56AH0I
I.51F04021060:F.Z0F45/101F04.7.:5F.2/
T`+OL,C[W]@,CR1@CJSWO,CJL5+OV@RFBCJ
#3E1,F?AEC?BD-:EA@I,.,CG Y@B.BJ@I,.TCJ@CEEF@CJ P:E_@,CJWC@\EF0@?K 4,CJ9:BH (&%%$-:@C,$
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?F,C0E0?EF@D@I,?@BC Z,0@C\E0?@J,?EG2f:E@AAB8@.@9EG .@1,0E8KA,IFB1BFBH0FE0@C +N5Z,0H0EG ,0?:E
I,?,.K0?2f:E@CD.HECIE0BD14F,?@BBDFE0@C I,F@EF?BEC9KAEBC ?:E1FE1,F,?@BC BD@AAB8@.@9EG EC9KAE
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I:,CJEBD0?EFEB@0BAEF0BDAEC?:B.BC ?:EFE0B.H?@BC ZEFE@C\E0?@J,?EG ,0ZE.2f:EB1?@AHA14F,?@BBD
I,F@EF?BEC9KAEZEFE! ,CG )p&FE01EI?@\E.K2f:E0?,8@.@?KBD?:E@AAB8@.@9EG EC9KAEZ,0@A1FB\EG
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Z:@.E?:EF,?@BBDAEC?:B.?BE0?EFZ,0&d)p&?:ED@C,.2%
1
FE,I:EG /)d&i Z@?: ?:E@A1FB\EG 0H80?F,?E2
K0A L24I1"@AAB8@.@09EG .@1,0E% !RAEC?:B.% ?F,C0E0?EF@D@I,?@BC
"" 薄荷醇#-
&%
4
$%
>相对分子质量 &)*$又名薄荷
脑是一类存在于自然界中的天然环萜醇为薄荷精
的主要成分( 薄荷醇分子存在 ( 个手性中心因此理
论上存在 !个立体异构体#结构如图 & 所示$( 其中
! 薄荷醇因味香且具有清凉作用常被广泛应用于
糖类产品)药品)口腔健康护理品)化妆品)茶类和烟
草产品中具有很高的工业应用价值( ! 薄荷醇主
要从天然的薄荷叶中提取由于受到耕地和气候的限
制天然薄荷醇的产量会受到影响不能满足市场日
益增加的需求( 因此利用化学法或者生物法实现
! 薄荷醇的工业化生产具有重要的现实意义(
""相比化学法合成 ! 薄荷醇酶法拆分制备因具
有较高的立体选择性)温和的反应条件)成本较低
等优点*& =$+而受到很多研究者的关注( 而目前研究
主要集中在以 A! 薄荷醇#酯$为底物进行生物拆
分的研究*( =&$+ 当获得目标产物 ! 薄荷醇#酯$后
剩余的A 薄荷醇#酯$无法再利用( 而如果以消旋
薄荷醇#酯$#含 ! 个立体异构体$为底物进行拆分
得到 ! 薄荷醇#酯$后剩余未转化的消旋薄荷醇
#酯$能够通过消旋催化剂进行消旋反应将其转化
为与初始组分比例相同的消旋薄荷醇#酯$( 理论
上来说通过多次循环可以将消旋薄荷醇#酯$完
全转化为 ! 薄荷醇#酯$( 因此直接以含有 ! 个异
构体的消旋薄荷醇为底物进行拆分制备 ! 薄荷醇
具有更好的应用价值但同时这也对生物催化剂的
选择性提出了更高的要求(
利用吸附固定化技术对脂肪酶进行修饰有时
会对酶的选择性和稳定性产生很大的提高*&( =&*+ (
研究认为采用疏水性载体吸附脂肪酶时能够使
脂肪酶的活性构象打开并被保持住可能是固定化
酶获得高活力和高稳定性的原因(
本文利用+N5大孔树脂对脂肪酶#来源于 9/:
4./0($)4%/012$进行吸附固定化显著提高其催化活
力和稳定性制得了具有高效催化选择性转酯化反
应的固定化脂肪酶催化消旋薄荷醇的转酯化拆
分获得了高光学纯度的 ! 薄荷醇(
图 D?薄荷醇的 > 个异构体
N.;=D?#.;-F1F0402.12G04127G0/F-26
D?材料与方法
D D^?材料与仪器
""材料"脂肪酶 9/4./0($)4%/012中科院微生物
所%含有 ! 个异构体的消旋薄荷醇由百里酚加氢制
得*&+ 其中各异构体组成如表 & 所示%大孔树脂天
津兴南允能高分子科技有限公司%其余试剂均为分
析纯国药集团化学有限公司(
""仪器"Wb /&%% 分光光度计北京瑞利分析
仪器厂%电子天平 5Y$%# & E`?.EFfB.EGB公司%
O-//% 气相色谱仪浙江温岭福立仪器有限
公司(
表 D?消旋薄荷醇中异构体的组成
E5J60D?,2G921.F.2/27F-045:0G.:G0/F-26 a
异构体 试样5 试样Y
I#A! 异薄荷醇$ $*d% &d%
I#A! 新异薄荷醇$ &!d* d/
I#A! 薄荷醇$ )&d$ !d/
I#A! 新薄荷醇$ (d$ (d$
%# 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
D B^?酶活测定
""酶活单位#W$定义为"#% e时每分钟催化生
成 &
"
AB.薄荷醇乙酸酯所需要的酶量( 比酶活为
单位质量酶蛋白所具有的酶活W6J(
""酶活的具体测定方法为") AV有机溶剂中加
入 &%% AAB.6VA! 薄荷醇和 $%% AA.6V乙酸乙烯
酯)$ 粒分子筛#孔径为 %d( CA$)%d%) J固定化酶
于 #% e)$$% F6A@C)反应 %d) :#有效转化率小于
)i$后检测薄荷乙酸酯的产量计算酶活(
""固定化酶总活力回收"制得固定化酶的总活力
与加入游离酶酶活之比( 蛋白吸附率为固定在树
脂上的蛋白量与加入的总蛋白量之比(
D M^?蛋白浓度的测定
""蛋白浓度的测定采用考马斯亮蓝法*&!+ ( 固定
化酶用 4
(
;>
#
缓冲液冲洗至无蛋白洗出为止( 初
始加入蛋白量减去固定化过程残液中蛋白量和洗
脱液中蛋白量即为树脂吸附的蛋白量(
D @^?固定化酶的制备
""树脂的预处理"工业级大孔吸附树脂使用前必
须进行预处理以去除树脂中所含少量的低聚物)
有机物及有害离子( 首先用 $ 倍体积的 $i+,>4
溶液洗涤并浸泡 # k! :再清水洗至中性%然后用 $
倍体积的 /)i乙醇洗涤并浸泡 ! k&$ :用清水洗
后用 $ 倍体积的 )i4-.溶液洗涤并浸泡 $ k# :
再用清水洗至中性( 将处理好的树脂干燥后保存
备用( 使用时称取一定干质量的树脂用 $ 倍体积
的 )i乙醇溶胀 # :后清水洗净(
""脂肪酶表面有很多疏水性的基团大孔吸附树
脂是 & 个多孔而且具有高比表面积的疏水性载体
因此通过疏水区域的相互作用可以使酶较易被吸
附固定于载体上(
""酶液的制备"称取 & J酶粉溶解于 &%% AV
%d%$) AB.6V的4
(
;>
#
缓冲液中存储于# e冰箱备用(
""固定化酶的制备及评价"将一定质量的树脂和
&% AV酶液混合后在 $%% F6A@C)$% e下恒温振荡
$# :%用4
(
;>
#
缓冲液冲洗至无蛋白洗出为止树脂
真空干燥至恒质量不再减少( 主要用蛋白吸附率)
总活力回收和比酶活来评价固定化过程的效率(
D P^?固定化酶催化转酯化反应
""在 $) AV密闭反应瓶中加入 ) AV正己烷)$
粒分子筛#孔径为 %d( CA$)一定量的消旋薄荷醇和
乙酸乙烯酯) %d%) J树脂固定化酶在 #% e)
$%% F6A@C下反应(
D Q^?分析方法
""采用气相色谱法进行测定面积内标法十二
烷为内标( 利用 3Y$&% 极性柱可以直接测定反应
的转化率"
有效转化率 m7#初始 ! 薄荷醇$ =7#剩余
! 薄荷醇$67#初始 ! 薄荷醇$ j&%%i(
测定非对映体过剩值#2%
1
$需要先将反应产物
用硅胶柱层析分离得到薄荷醇乙酸酯再用 -;手
性柱检测确定各异构体含量"
2%
1
m7#! 薄荷醇乙酸酯$ =7#非 ! 薄荷醇
乙酸酯$67# ! 薄荷醇乙酸酯$ l7#非! 薄荷醇
乙酸酯$ j&%%i(
其中非 ! 薄荷醇乙酸酯包括"A 薄荷醇乙酸
酯)A! 异薄荷醇乙酸酯) A! 新薄荷醇乙酸酯以
及 A! 新异薄荷醇乙酸酯(
B?结果与讨论
B D^?大孔树脂的筛选
""选用 ) 种弱极性和非极性的大孔吸附树脂固定
酶#性能如表 $ 所示$实验发现平均孔径最大的 S
) 树脂的固定化蛋白结合率最高( 因为在固定化
过程中较大的孔径能够使酶更容易进入孔隙内产
生吸附( 酶活的高低与蛋白的结合率高低相关具
有相似蛋白吸附量的5Y !)3#%$%)+N5也具有相
近的酶活其中又以 +N5固定化酶酶活最高(
4&%( 的蛋白结合率要明显低于其他几种树脂因此
它的酶活也较低( 4&%( 的孔径是 ) 种树脂中最小
的过小的孔径不利于酶的扩散而导致吸附率的降
低( 对于蛋白结合率较高的树脂考察其固定化酶
的操作稳定性( 用+N5固定化酶和用 5Y ! 固定
化酶都有着较好的反应稳定性半衰期都在 (%% :
以上要明显好于平均孔径最大的 S ) 树脂( S
) 树脂有较大的孔径在长时间的反应中更容易泄
漏而导致酶的损失( 3#%$% 与 5Y ! 有着类似的
孔径但是反应稳定性却相差很大研究发现由于
在反应的过程中 3#%$% 易遭到有机溶剂正己烷的
腐蚀而导致其结构变化酶活损失( 综合考虑选择
性)酶活和稳定性选择 +N5大孔树脂作为最适的
固定化载体进行后续研究(
B B^?固定化9"对固定化酶催化活性的影响
""在其他条件不变的情况下用不同 14的缓冲液配
制酶液进行固定化并测定固定化酶的比酶活结果如
表 (所示( 由表 (可以看出"在 14* k!范围内固定
&#"第 # 期 孟"彦等"固定化脂肪酶催化制备 ! 薄荷醇
化酶的比酶活略有增加%在 14为 ! 时最大可达
*d* W6J且总活力回收也达到最大为 )d& 倍%当 14
继续升高比酶活)总活力回收和蛋白吸附率下降比较
明显( 因此确定制备固定化酶的最佳 14为 !(
表 B?不同载体固定化酶性能的比较
E5J60B?W04724G5/:0:2G954.12/27.GG2J.6.H0I0/HAG0JA I.7040/F:544.041
树脂
比表面积6
#A
$
!J
=&
$
平均孔径6
CA
酶活6
W
半衰期6
:
有效转化率为
)%i的%%
1
6i
蛋白结合率6
i
5Y ! #!% k)$% &( k&# %d$! ((% /d /$
S ) )%% k*%% $/ k(% %d(& &!% /!d& /
4&%( & %%% k& &%% !d) k/d) %d&$ % /!d( (
3#%$% )#% k)!% &% k&%d) %d(% &)% /d! /&
+N5 )% k)/% $% k$$ %d($ (%% /!d$ /$
表 M?9"对固定化酶比酶活)总活力回收)
蛋白吸附率的影响
E5J60M?#70:F1279"2/F-05:F.Z.FA2Z04V56A.06I5/I
942F0./5I1249F.2/27F-0.GG2J.6.H0I0/HAG0
14 比酶活6#W!J=&$ 总活力回收6倍 蛋白吸附率6i
* *d% #d* /$
*d# #d/ /(
! *d* )d& /$
/ )d# #d$ !)
&% #d$ (d$ !
B M^?固定化载体和酶比例对固定化酶活性的影响
""考察酶与 +N5树脂载体的比例对固定化酶活
力的影响结果如表 # 所示( 由表 # 可知当酶与载
体比例为#&p)$ k#&p&%$时比酶活及总活力回收
最高且投入的游离酶基本已经全被吸附固定到了
载体上%当载体比例小于 &p)或者大于 &p&% 时酶
的比活和总活力回收都有所降低( 可见载体对酶
活力的影响是多方面的( 一方面载体对酶能够起
到良好的分散作用增加其与底物之间的接触面
积从而提高反应速率%另一方面载体的存在增加
了酶的空间位阻影响底物在酶活性中心区域的接
近和定位从而降低了酶的催化效率( 当酶与载体
比例过高#如 &p&$时载体表面容易形成酶聚集体
甚至多层酶导致酶的有效利用率降低%研究表明"
在酶的吸附固定化过程中当酶的相对浓度较低
时酶分子倾向于最大限度地与载体接触而在酶
相对浓度较高时则倾向与载体发生较小的接
触*&#+ ( 当酶与载体比例过低#如 &p&)$若表面覆
盖蛋白质少于单层蛋白质分子可能会通过变形和
伸展以获得对载体表面的最大接触( 由于蛋白质
构象发生变化最终导致酶活力的损失在此情况
下载体对酶的空间位阻效应也比较严重( 同时
吸附在载体上的酶分子有可能因为较强的疏水作
用而产生不利的构象扭曲也会导致酶活力的降低(
表 @?在不同比例下制得的固定化酶性能比较
E5J60@?W04724G5/:0:2G954.12/27.GG2J.6.H0I0/HAG0
3/I04I.7040/F:544.041b0/HAG045F.21
7#游离酶$p
7#树脂$
总活力回收6
倍
蛋白吸附率6
i
比酶活6
#W!AJ
=&
$
&p& )d& /$ %d((
&p$ d( /) %d#*
&p) &%d! u// %d*)
&p&% !d* u// %d)$
&p&) *d( u// %d(!
"注"游离酶比活为 %d%* W6AJ(
B @^?温度对固定化酶促拆分反应的影响
""当环境温度高于或低于酶的最适温度时酶的活
性就会下降( 在不同的温度下以 &%% AAB.6V的消
旋薄荷醇试样5和 $%% AAB.6V乙酸乙烯酯为底物
加入 %d%) J固定化酶反应 &% :结果如图 $所示( 由
图 $可以看出随着温度的升高转化率显著升高而
反应选择性 2%
1
略有降低%当温度从 () e升至 #% e
时有效转化率从 %i提高到 !(i2%
1
则降低了
%d)i( 综合考虑温度对有效转化率和非对映体选择
率的影响选择了 #% e为最佳反应条件(
B P^?底物比例对固定化酶促拆分反应的影响
""如图 ( 所示随着底物比例从 %d)p&到 &d)p&不
断地增大有效转化率明显增加当比例高于 &d)p&
时有效转化率增加很小此过程中 2%
1
基本不变说
$# 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
图 B?温度对酶促拆分结果的影响
N.;=B?#70:F127F0G9045F3402/F-0401263F.2/
270/HAG5F.:405:F.2/
明 &d) 倍的乙酸乙烯酯加入量已经足够( 其中底物
比例为 (d)p&时代表的是以乙酸乙烯酯作为溶剂
的极端情况发现 2%
1
明显地下降说明乙酸乙烯酯
并不是很好的反应溶剂( 因此乙酸乙烯酯对八异
构体消旋薄荷醇的最佳比例为 &d)p&(
图 M?底物比例对酶促拆分结果的影响
N.;=M?#70:F12713J1F45F045F.212/F-0
401263F.2/270/HAG5F.:405:F.2/
B Q^?改变消旋薄荷醇异构体组成对固定化酶促拆
分反应的影响
""在以上优化条件下以消旋薄荷醇试样 5为底
物进行酶促拆分反应制备 ! 薄荷醇发现 2%
1
仅
达到 !&di与实际应用还有一定的距离( 对产物
中各异构体组成进行分析结果表明异薄荷醇和新
异薄荷醇乙酸酯的含量较高说明酶对这两组异构
体的选择性不佳是导致产物 2%
1
值较低的关键因素(
因此对消旋薄荷醇试样5进行精馏预处理适量除
去底物中含量较高的异薄荷醇和新异薄荷醇乙酸
酯得到了消旋薄荷醇试样Y并以之为底物在优化
条件下再次进行酶促拆分结果如表 ) 所示( 由表
) 可知底物Y的酶促拆分结果要远好于底物5达
到了很高的 2%
1
#/)d&i$即产物中 ! 薄荷醇含量
达到了 /d)i以上( $ 个拆分过程的 %%
1
都为
/d(i说明虽然其他几对异构体的含量改变了但
并未影响固定化酶对A! 薄荷醇的对映体选择性(
以Y为底物虽然有效转化率有所降低但是实际的
底物转化量却要高于 5作为底物的反应原因是 Y
中! 薄荷醇的含量要高于 5( ! 薄荷醇在底物中
是优先转化的构型根据酶反应动力学的基本原
理在不产生底物抑制时如果底物浓度没有特别
过量则此时底物浓度的提高会带来反应速率的
增加(
表 P?消旋薄荷醇异构体组成对酶促拆分结果的影响
E5J60P?#70:F127F-045:0G.:G0/F-26:2G921.F.2/
2/F-0401263F.2/270/HAG5F.:405:F.2/
底物
7#固定
化酶$6
J
&#! 薄
荷醇$6
AAB.
有效
转化率6
i
%%
1
6
i
2%
1
6
i
5 %d%) %d&%) !# /d( !&d
Y %d%) %d&#% *# /d( /)d&
B R^?固定化酶操作稳定性的考察
""以相同初始酶活的固定化酶和游离酶为催化
剂在连续催化过程中分时段测定固定化酶和游离
酶酶活结果如图 # 所示( 由图 # 可知在优化反应
条件下固定化酶连续催化反应 (%% : 后测定其酶
活酶活降为初始酶活的约 )%i%而在相同条件下
用相同酶活的游离酶连续催化其酶活降为初始酶
活的 )%i时的反应时间为 &)% :固定化酶的半衰
期较游离酶延长了 &)% :( 因此用+N5树脂固定化
酶对维持酶的反应稳定性有显著的效果(
图 @?固定化酶与游离酶操作稳定性比较
N.;=@?+9045F.2/1F5J.6.FA :2G954.12/J0FL00/
.GG2J.6.H0I0/HAG05/I74000/HAG0
M?结?论
""通过比较几种不同的大孔吸附树脂的固定化
(#"第 # 期 孟"彦等"固定化脂肪酶催化制备 ! 薄荷醇
酶的性能发现 +N5大孔吸附树脂固定化脂肪酶
#来源于9/4./0($)4%/012$有着最佳的效果并通过
条件优化使+N5固定化脂肪酶在有机相中催化消
旋薄荷醇和乙酸乙烯酯的转酯化反应得到高光学
纯的 ! 薄荷醇#2%
1
u/)i$( 相对于游离酶固定
化脂肪酶有显著的活力和稳定性的提升总活力回
收高达 )d& 倍反应稳定性提高了 )%i( +N5大孔
吸附树脂作为优秀的吸附载体如对其进行进一步
的改进如表面修饰等极有可能进一步提升其固定
化酶的性能对规模化制备 ! 薄荷醇的有效催化剂
有重要的参考意义(
参考文献"
*&+"孙志浩2生物催化工艺学* +`2北京"化学工业出版社$%%)"
/R&%2
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## 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"