全 文 ：第７卷第３期
２００９年５月
生 物 加 工 过 程
ＣｈｉｎｅｓｅＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｐｒｏｃｅｓｓＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ．７Ｎｏ．３
Ｍａｙ２００９
收稿日期：２００８－０５－０４
基金项目：国家自然科学基金资助项目（２０７７６１０５）
作者简介：任梦远（１９８０—），女，山西太原人，硕士研究生，研究方向：酶工程；白 姝（联系人），副教授，Ｅｍａｉｌ：ｓｂａｉ＠ｔｊｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
离子液体中固定化脂肪酶催化拆分（±）薄荷醇
任梦远，白 姝，孙 彦
（天津大学 化工学院，天津 ３０００７２）
摘 要：以自制的平均粒径为４５μｍ磁性高分子微球为载体，采用离子交换法固定化Ｃａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａ脂肪酶，催化
（±）薄荷醇的酯化反应，以考察反应时间、ｐＨ、反应温度、水活度等因素对酶的固定化以及酯化反应的影响。在固
定化反应１５０ｍｉｎ、ｐＨ５０、酯化反应温度３０℃、固定化酶的水活度为０７８的条件下，所制备的固定化脂肪酶在离
子液体［ｂｍｉｍ］ＰＦ６中催化拆分（±）薄荷醇的效果最佳，与游离酶相比固定化脂肪酶的立体选择性有很大的提高，对
映体过量率可达９３％，对映体选择值为３５。
关键词：磁性高分子微球；固定化脂肪酶；离子液体；手性拆分；薄荷醇
中图分类号：Ｑ８１４２ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－３６７８（２００９）０３－００１６－０５
Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆ（±）ｍｅｎｔｈｏｌｉｎｉｏｎｉｃｌｉｑｕｉｄｃａｔａｌｙｚｅｄｂｙｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｌｉｐａｓｅ
ｏｎｍａｇｎｅｔｉｃｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ
ＲＥＮＭｅｎｇｙｕａｎ，ＢＡＩＳｈｕ，ＳＵＮＹａｎ
（ＳｃｈｏｏｌｏｆＣｈｅｍｉｃａｌＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＴｉａｎｊｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００７２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｏｆ（±）ｍｅｎｔｈｏｌｗａｓｃｏｎｄｕｃｔｅｄｂｙｔｈｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｌｉｐａｓｅｃａｔａｌｙｚｅｄ
ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎａｎｅｗｔｙｐｅｏｆｇｒｅｅｎｓｏｌｖｅｎｔ，ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｏｎｉｃｌｉｑｕｉｄ［ｂｍｉｍ］ＰＦ６．Ｍａｇ
ｎｅｔｉｃｐｏｌｙｍｅｒｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓｗｉｔｈａｍｅａｎｐａｒｔｉｃｌｅｄｉａｍｅｔｅｒｏｆ４５μｍｗｅｒｅｐｒｅｐａｒｅｄｖｉａｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｐｏｌｙ
ｍｅｒｉｚａｔｉｏｎａｎｄｕｓｅｄｆｏｒｔｈｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｆＣａｎｄｉｄａｒｕｇｏｓａｌｉｐａｓｅｂｙｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅ．Ｅｆｅｃｔｓｏｆｖａｒｉｏｕｓ
ｒｅａｃｔｉｏｎｐａｒａｍｅｔｅｒｓ，ｓｕｃｈａｓｒｅａｃｔｉｏｎｔｉｍｅ，ｐＨｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ａｎｄｗａｔｅｒａｃｔｉｖｉｔｙｏｎｔｈｅｉｍｍｏ
ｂｉｌｉｚａｔｉｏｎａｓｗｅｌａｓｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙｗｅｒｅｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ａｓａｒｅｓｕｌｔ，ｂｅｔｅｒｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙｃｏｕｌｄｂｅｅｘ
ｐｅｃｔｅｄｆｏｒｔｈｅｒｅａｃｔｉｏｎｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅａｔ３０℃ ｃａｔａｌｙｚｅｄｂｙｔｈｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｌｉｐａｓｅｗｉｔｈｗａｔｅｒａｃｔｉｖｉｔｙｏｆ
０７８ｐｒｅｐａｒｅｄｉｎａｂｕｆｅｒ（ｐＨ５０）ｆｏｒ１５０ｍｉｎ．Ａｎｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃｅｘｃｅｓｓｏｆ９３％ ａｎｄａｄｉａｓｔｅｒｅｏｍｅｒｉｃ
ｒａｔｉｏｏｆ３５ｗｅｒｅｏｂｔａｉｎｅｄ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍａｇｎｅｔｉｃｐｏｌｙｍｅｒｍｉｃｒｏｓｐｈｅｒｅｓ；ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｌｉｐａｓｅ；ｉｏｎｉｃｌｉｑｕｉｄ；ｅｎａｎｔｉｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙｒｅｓｏｌｕ
ｔｉｏｎ；ｍｅｎｔｈｏｌ
作为传统有机溶剂的替代品，一种新型绿色溶
剂———离子液体（ｉｏｎｉｃｌｉｑｕｉｄｓ，ＩＬ）在生物催化领域
的应用研究已引起人们的高度重视［１－３］。有报道指
出［４］，在ＩＬ中脂肪酶的对映体选择性要比在一般有
机溶剂中提高２５倍。然而，酶在非水相中的不溶
性、易结块，使酶的效率下降。因此，固定化酶已普
遍应用于非水相中的酶催化反应。磁性高分子微
球是一种极具实用价值的新型固定化载体，它除了
具有高分子微球的特性外，还具有很高的磁响应
性，可通过磁场方便地实现固定化酶的回收、循环
使用及载体再生，有利于大规模连续化生产。目
前，在ＩＬ中的酶促催化反应，仅限于商品化固定化
脂肪酶的应用研究，而以自制的磁性高分子微球为
载体、固定化脂肪酶用于ＩＬ中进行酶促反应方面的
研究尚未见报道。
（±）薄荷醇是薄荷的主要成分之一，而具有药
用和香料价值的仅限于（－）薄荷醇。因此外消旋
薄荷醇的拆分具有重要的应用价值。已有文献报
道脂肪酶可在有机相及离子液体中催化（±）薄荷
醇优先酯化合成（－）薄荷醇酯，从而达到拆分外消
旋薄荷醇的目的［５］。
本研究以自制的磁性ＧＭＡ ＥＤＭＡ高分子微球
为载体，采用离子结合法固定化脂肪酶，进一步以该
酶用于催化离子液体［ｂｍｉｍ］ＰＦ６中（±）薄荷醇的不
对称酯化反应，考察反应时间、ｐＨ、反应温度、水活度
等因素对于酶的固定化以及拆分效果的影响。
１ 材料与方法
１１ 实验材料
二乙胺乙基（ＤＥＡＥ）、脂肪酶（ＣＲＬ，来自 Ｃａｎｄｉ
ｄａｒｕｇｏｓａ，ＴｙｐｅⅦ，８１９Ｕ），购于Ｓｉｇｍａ公司；（±）薄
荷醇和（－）薄荷醇均购于Ａｌｄｒｉｃｈ公司；丙酸酐、双甲
基丙烯酸乙二醇酯（ＥＤＭＡ），购于 Ｆｌｕｋａ公司；
ＦｅＳＯ４·７Ｈ２Ｏ、ＦｅＣｌ３·６Ｈ２Ｏ、甲基丙烯酸缩水甘油酯
（ＧＭＡ）、偶氮二异丁腈（ＡＩＢＮ）、聚乙烯醇（ＰＶＡ）、十
二醇、十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）等试剂均为国产分析
纯，未经处理直接使用。
１２ 实验方法
１２１ 载体的制备
采用化学共沉淀法合成纳米 Ｆｅ３Ｏ４磁流体
［６］。
称取磁流体（湿质量１００ｇ）、ＧＭＡ（１５０ｇ）、ＥＤＭＡ
（２１０ｇ）、十二醇（０４０ｇ）、ＡＩＢＮ（０３０ｇ）配成油
相。称取ＳＤＳ（０８０ｇ）加入３００ｍＬ的质量分数１％
ＰＶＡ水溶液配成水相。在５００ｍＬ三口烧瓶中，将油
相引入水相，置于８０℃恒温水浴，机械搅拌转速为
１００ｒ／ｍｉｎ。反应进行５ｈ后，直接用永磁体收集磁性
微球，分别用丙酮、无水乙醇及蒸馏水依次反复洗
涤，收集得到 ＧＭＡＥＤＭＡ磁性高分子微球。进一
步与ＮａＢＨ４溶液反应，以使微球表面的环氧基充分
还原为羟基。然后再经 ＤＥＡＥ修饰，制得核壳型磁
性ＤＥＡＥＧＭＡＥＤＭＡ阴离子交换剂，其平均粒径为
４５μｍ，可作为固定化酶的载体。
１２２ 脂肪酶（Ｃａｎｄｉｄａｒｏｇｕｓｅ）的固定化
称取相同质量 （干质量）的载体分别用
５０ｍｍｏｌ／Ｌ的不同ｐＨ缓冲溶液洗涤２次，再将其悬
浮于装有各自不同 ｐＨ缓冲溶液的１０ｍＬ密封离心
管中，然后按照载体与酶１∶１的质量比加入脂肪酶，
于２５℃，１５０～１７０ｒ／ｍｉｎ摇床进行固定化反应。定
时取样，用永磁体将固定化酶分离出来，各自用不
同ｐＨ缓冲液洗涤２次，最后将固定化酶真空冷冻
干燥后，存于－２０℃冰箱中备用。
１２３ 离子液体［ｂｍｉｍ］ＰＦ６的制备
采用经典的两步合成法制备疏水性离子液体
［ｂｍｉｍ］ＰＦ［７］６ 。
１２４ 酯化反应
在１０ｍＬ密封的离心管中先加入１ｍｍｏｌ（±）薄
荷醇，３ｍＬ疏水性离子液体［ｂｍｉｍ］ＰＦ６，再加入
１ｍｍｏｌ的丙酸酐，最后加入一定活力单位的固定化
脂肪酶。３０℃、２００ｒ／ｍｉｎ恒温摇床进行薄荷醇的酯
化反应２４ｈ。反应结束后，使用永磁铁将固定化酶
分离回收，可以反复使用。薄荷醇的酯化拆分过程
如图１所示。
图１ （±）薄荷醇的酯化反应
Ｆｉｇ．１ Ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆ（±）ｍｅｎｔｈｏｌ
７１ 第３期 任梦远等：离子液体中固定化脂肪酶催化拆分（±）薄荷醇
１２５ 不同水活度固定化酶的制备
将在ｐＨ５０的柠檬酸缓冲液中制备的固定化
酶，未经干燥前分装，再使用真空冷冻干燥仪（Ｃｈｒｉｓｔ
Ａｌｐｈａ型，德国Ｃｈｒｉｓｔ公司）进行固定化酶的冷冻干
燥，定时取样，测定其水活度，密封后于－２０℃冰箱
中保存备用。
１２６ 蛋白质含量和脂肪酶活性的测定
采用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定蛋白的含量［８］。采用橄榄
油乳化法测定脂肪酶的活性［９］。酶活力单位定义：
在３７℃、ｐＨ７０条件下，每分钟催化产生１μｍｏｌ脂
肪酸的酶量为一个酶活单位（Ｕ）。
１２７ 气相色谱分析
采用气相色谱仪（６８９０Ｎ型，Ａｇｉｌｅｎｔ公司）分析
酯化反应产物，可定性和定量测定产物的旋光性和
浓度，由此计算酯化反应的对映体过量率 ｅｅ（ｅｎ
ａｎｔｉｏｍｅｒｉｃｅｘｃｅｓｓ）、对映体选择值Ｅ（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃｒａ
ｔｉｏ）和转化率Ｃ［５］。
利用正己烷从反应体系中萃取待分析的试样，
并且稀释至１７×１０－３ｍｍｏｌ／ｍＬ。气相色谱条件：
进样口温度２００℃；检测器温度２５０℃；载气流速
（Ｎ２）２ｍＬ／ｍｉｎ；柱温为初始 ９０℃，保温１０ｍｉｎ，随
后以２℃／ｍｉｎ升温至１５０℃，再以５℃／ｍｉｎ升温至
１６５℃，程序共计运行４３ｍｉｎ。保留时间分别为：
（±）薄荷醇２６３ｍｉｎ，（－）薄荷醇酯３０５ｍｉｎ，（＋）
薄荷醇酯 ３１５ｍｉｎ。
２ 结果与讨论
２１ 固定化时间对酶固定化的影响
在 ｐＨ为５０的柠檬酸缓冲溶液中进行 ＣＲＬ
的固定化，考察反应时间对脂肪酶固定化效果的
影响，结果见图２。由图２可知，在最初３０ｍｉｎ内，
脂肪酶快速地吸附到载体上，酶活的增长与固定
化时间呈线性增长的关系；随着反应时间的延长，
固定化酶活继续升高，但速度趋缓，至１５０ｍｉｎ，固
定化的酶活达到最大值，每 ｇ载体固定化酶活为
４５２Ｕ，此时溶液中残留的游离酶活性也降至最
低。进一步延长固定化时间，发现固定化酶活略
有下降，而残余酶活降低的速度趋于平缓。这是
由于在反应的开始阶段（３０ｍｉｎ内），脂肪酶通过
离子交换作用吸附到载体上，固定化酶活力随着
反应时间的延长而迅速增大，但超过一定时间后
（１５０ｍｉｎ），一方面载体表面可结合位点已基本上
被酶所覆盖，由于空间位阻的存在，再延长固定化
反应时间也不会使固定化酶活提高；另一方面，理
论上认为，当１５０ｍｉｎ后载体吸附酶基本达到饱和
时，反应体系中上清液的残余酶活应显著增大，但
实验结果显示，无论是固定化酶还是残余酶活都
在１５０ｍｉｎ后随时间的延长而减小。这可能是由于
固定化的时间过长引起酶的变性失活。因此，固
定化最佳反应时间为１５０ｍｉｎ。
图２ 固定化时间对酶固定化的影响
Ｆｉｇ．２ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｒｅａｃｔｉｏｎｔｉｍｅｏｎｌｉｐａｓｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
２２ ｐＨ对酶固定化的影响
分别在不同ｐＨ的缓冲溶液中进行ＣＲＬ的固定
化，考察ｐＨ对固定化酶催化能力的影响，结果如图
３所示。
图３ ｐＨ对酶固定化的影响
Ｆｉｇ．３ ＥｆｅｃｔｓｏｆｐＨｏｎｌｉｐａｓｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ
由图３可见，ｐＨ对固定化脂肪酶的活性和比酶
活都有很大的影响，并且脂肪酶在载体上的吸附量
与固定化酶的酶活性并非呈现正比关系。在 ｐＨ
７０时固定化酶的活性最高，每 ｇ载体固定化酶活
为４５２Ｕ，在ｐＨ５０比酶活最高（１２４０３１Ｕ／ｇ）；在
ｐＨ８０时酶活和比酶活均最低，每 ｇ载体固定化酶
活为３２０Ｕ，比酶活仅为６１４２０Ｕ／ｇ。这可能是由于
商品化的 ＣＲＬ脂肪酶，包含同工酶 ＣＲＬＡ、ＣＲＬＢ以
及杂蛋白３种组分，前两者的等电点分别为５６和
８１ 生 物 加 工 过 程 第７卷
４２［１０］，而杂蛋白的大部分等电点大于５０。因此，
在ｐＨ为５０时，只有ＣＲＬＢ带负电荷被选择性地吸
附到载体上，即固定化的过程同时又有酶的纯化作
用，虽然酶蛋白的吸附量及固定化酶活性都相对最
低，但比活性却最高。同理，ｐＨ７０时，２种同工酶
都可被固定化，但同时某些杂蛋白也被吸附，所以
导致酶活最高，比酶活较高。而在ｐＨ８０的碱性环
境中，脂肪酶在大于等电点时带负电荷最多，所以
酶的吸附量最大，但此时酶的二级或三级结构可能
发生了改变，使得固定化酶的活性和比酶活均最
低。这一结果与 Ｐｒｏｎｋ等［１１］所报道的脂肪酶 ＣＲＬ
在ｐＨ中性或略偏酸性的环境下活性较高的结论相
吻合。综合考虑固定化的酶活及比酶活，确定固定
化反应的 ｐＨ为５０。
２３ 反应温度对酯化反应的影响
分别在３０℃和４０℃下应用固定化脂肪酶在离
子液体［ｂｍｉｍ］ＰＦ６中进行（±）薄荷醇酯化反应，结果
见图４。由图４可知，随着反应时间的延长，温度升
高，薄荷醇的转化率略有上升，但是ｅ．ｅ．值却有显著的
下降。曾有报道指出［１２］，采用吸附法固定化脂肪酶
可以提高酶的最适反应温度范围。但本实验结果却
显示，温度的升高对于ｅ．ｅ．值有较大的负面影响，也就
是说，与游离酶实验结果相比［１３］，ＣＲＬ经固定化后最
适反应温度并没有发生改变。因此，酯化反应的温度
选择３０℃。
图４ 酯化反应温度的影响
Ｆｉｇ．４ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｏｎｔｈｅｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
２４ 固定化酶的水活度对酯化反应的影响
采用不同水活度的固定化酶进行酯化反应，
考察固定化酶的水活度对催化（±）薄荷醇拆分效
果的影响，结果见图 ５。由图 ５可知，固定化酶的
水活度对于酶的催化活性和立体选择性有很大的
影响。这是因为若将酶完全干燥除水，酶分子内
部的相互作用会将酶分子束缚，使其处于锁闭状
态，不具有催化活性和选择性；在限定范围内增加
水含量，可以使非水溶剂中原来刚性很强的酶的
构象增加柔软性和移动性，从而提高酶的立体选
择性。由图５可知，当固定化酶的水含量较高时，
对酶结构改变的影响很小，反应的ｅ．ｅ．值较高，这是
因为酶分子中大量水分子的存在使酶的柔性增
加，更易于识别手性不同的分子。
图５ 固定化酶的水活度对酯化反应的影响
Ｆｉｇ．５ Ｅｆｅｃｔｓｏｆｗａｔｅｒａｃｔｉｖｉｔｙｏｎｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｂｙ
ｔｈｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄｌｉｐａｓｅ
同时由于反应体系中水含量的增加，离子液体
［ｂｍｉｍ］ＰＦ６的黏度显著下降，进行动力学考查时发
现反应达到平衡的速度较快［１３］。但是水含量的增
加也使反应平衡向水解的方向移动，导致反应的酯
化转化率较低。因为本研究的主要目的是手性拆
分，所以应首先考虑酶的立体选择性。故确定固定
化酶反应的最佳水活度为０７８。
２５ 固定化酶的操作稳定性
采用上述确定的固定化 ＣＲＬ以及酯化反应的
最佳 条 件，重 复 进 行 固 定 化 酶 在 离 子 液 体
［ｂｍｉｍ］ＰＦ６中拆分 （±）薄荷醇的反应，并同时与游
离酶进行对照，考察固定化酶的操作稳定性，结果
列于表１。由表１可见，虽然固定化酶的反应转化
率并不十分理想，但是立体选择性显著提高。将固
定化酶和游离酶重复使用３次后，发现二者催化活
性降低的程度相同，均为约６０％，但固定化脂肪酶
的ｅ．ｅ．值还保持在较高的水平，为７６３％，说明制备
的固定化酶在离子液体［ｂｍｉｍ］ＰＦ６中的立体选择性
很高，且由于其便于回收的特性，适合于离子液体
中的手性拆分反应。
９１ 第３期 任梦远等：离子液体中固定化脂肪酶催化拆分（±）薄荷醇
表１ 固定化酶和游离酶的操作稳定性
Ｔａｂｌｅ１ Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓｔａｂｉｌｉｔｙｏｆｔｈｅｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄａｎｄ
ｆｒｅｅｌｉｐａｓｅｓ
重复
次数
反应
时间／ｈ 脂肪酶
转化率／
％
ｅｅ／
％ Ｅ值
第１次 ２４ 固定化 １９４ ９３１０ ３５１１
游离 ４０２ ８４５０ ２１０４
第２次 ２４ 固定化 １１３ ８７６５ １６９６
游离 ２１９ ７３７０ ８０７
第３次 ２４ 固定化 ８５ ７６３０ ７９８
游离 １９１ ６７００ ５９０
３ 结 论
在以ＥＤＭＡ为交联剂的 ＧＭＡ悬浮聚合反应体
系中加入油酸稳定化的磁性纳米粒子 Ｆｅ３Ｏ４，合成
了平均粒径为４５μｍ的磁性高分子微球，经 ＤＥＡＥ
修饰后制得磁性阴离子交换剂载体。采取离子结
合法固定化脂肪酶 ＣＲＬ，并且应用该固定化酶在离
子液体［ｂｍｉｍ］ＰＦ６中，催化（±）薄荷醇的手性拆分。
在固定化反应１５０ｍｉｎ、ｐＨ５０、酯化反应温度３０℃、
固定化酶的水活度为０７８的条件下，所制备的固定
化脂肪酶在离子液体［ｂｍｉｍ］ＰＦ６中催化拆分（±）薄
荷醇的效果最佳，与游离酶相比固定化脂肪酶的立
体选择性有很大的提高，ｅ．ｅ．值可达９３１％，Ｅ值为
３５１１。结果表明，本研究制备的固定化脂肪酶用于
新型绿色溶剂离子液体［ｂｍｉｍ］ＰＦ６中催化（±）薄荷
醇的手性拆分，具有潜在的应用前景。
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０２ 生 物 加 工 过 程 第７卷