全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 && 月
生"物"加"工"过"程
*cF/3! 8F3#
8FM3$%&%
DFC"&%37#7 ,^3C11L3$ ?#6!3$%&%3%#3%%(
收稿日期"$%&% ?%( ?&6
作者简介"沈慧慧$&7!%#女#湖北仙桃人#硕士#研究方向"食品生物技术与酶工程&李"春$联系人%#教授#Z-J@C/"/CA氨基酸对无外源激素悬浮培养肉苁蓉细胞
合成苯乙醇苷的影响
沈慧慧&#$#易丽娟&#李"春&
$&3新疆兵团化工绿色过程重点实验室#石河子 !$%%& $3阿克苏出入境检验检疫局#阿克苏 !0%%%%
摘"要"通过不添加外源激素进行肉苁蓉细胞悬浮培养#考察 0 种氨基酸对无外源激素悬浮培养肉苁蓉细胞生长
和产苯乙醇苷$=HV1%的影响( 结果表明"苯丙氨酸$=$5EK%和精氨酸$.EX%的促进效果较弱( 在培养的第 &$ 天向无外源激素液体培养基中分别添加 %g JJF/,N=%g% JJF/,N5KE#=HV1产量$按细胞干质量计%均达到了最高#为 &g&7 X,N#是添加生长调节剂激动素$)5%和吲哚
乙酸$O..%培养的细胞$简称S*%的 $g%$ 倍( %g JJF/,N=时#肉苁蓉细胞=HV1产量分别为 (g0 X,N和 (g&# X,N#分别是对照S*的 &g07 倍和 &g0& 倍(
关键词"氨基酸&肉苁蓉&培养&激素&=HV1
中图分类号"9!&""""文献标志码".""""文章编号"$ ?#6!$$%&%%%# ?%%$$ ?%#
#770:F1275I./2 5:.G12/S0%1724I5F.2/./:0613190/1.2/:36F340127
.$)/,01#-2-)-*/$1&3, ./F-05J10/:0270V2;0/231-24I2/01
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M0K N24G1"@JCLF@ACD&"-7#2+4,%,-,&7+($#&AG/BGEH&""肉苁蓉$"-7#2+4,%,-,&7+($# U3*3Q@%为多年生
寄生草本植物#名贵的中药材#主要产于内蒙古)新
疆)甘肃)陕西和宁夏等地( 肉苁蓉含有生物碱)黄
酮)苯乙醇总苷)肉苁蓉多糖和环烯醚萜苷类等多
种生物活性天然产物#具有补肾壮阳)抗衰老)抗疲
劳)增强人体免疫功能和抗肿瘤等功效#素有.沙漠
人参/之美誉*&+ (
""肉苁蓉细胞培养生产苯乙醇苷$=HV1%#是一种
潜在的大规模生产=HV1的重要途径#然而和其他植
物细胞培养一样#必须通过添加外源激素来促进细
胞的分化生长和促进代谢产物的形成*$+ ( 利用悬
浮培养的植物细胞作为食品)医药的加工原料#培
养基中添加外源激素对人体健康可能造成潜在危
害( 激素又是植物细胞培养基中价格最昂贵的成
分#无外源激素条件下培养植物细胞可以有效降低
培养成本( 因此#开展无外源激素培养肉苁蓉细胞
的研究#在中草药细胞培养和食品加工领域具有极
其重要的意义(
""植物组织培养以无机 8源为主#有时辅以有机
8源#氨基酸是常用的有机 8源之一*+ ( 喂饲目的
产物的合成前体#是提高植物细胞次级代谢产物产
量的常用策略#在植物细胞培养体系中加入目的化
合物的合成前体#有利于提高目的产物的产量*0+ (
色氨酸$5EK%是植物生长素吲哚乙酸$O..%合成的
前体#对植物细胞分裂和生长起着重要的作用*(+ (
精氨酸$.EX%在植物中除作为一种重要的8元素贮
藏营养物供再利用外#还是生成多胺$=.%和一氧化
氮$8+%等的前体物质#而 =.和 8+都是植物中重
要的信使分子#参与包括生长发育)抗逆性等在内
的几乎所有的生理生化过程*# ?!+ ( 另外考虑到
=HV1生物合成的代谢途径中#苯丙氨酸$=氨酸$5KE%是=HV1合成的前体物质*7 ?&%+ #为进一步
优化细胞生长条件#提高 =HV1产量#本研究分别添
加5EK).EX)5KE和=肉苁蓉细胞#考察 0 种氨基酸在不同添加浓度范围)
添加时间对无外源激素肉苁蓉悬浮细胞系中 =HV1
合成的影响(
D?材料与方法
D=D?材料
""肉苁蓉采自新疆库尔班通古特沙漠南缘的荒
漠#由新疆兵团化工绿色工程重点实验室诱导形成
愈伤组织*&&+ (
D=B?培养基及培养条件
""无外源激素培养基$ (`
%
%" (` 培养基中不添加
任何外源激素#蔗糖 % X,N( 2S(g!(
""有激素培养基$ (`
&
%" (`
%
培养基中添加 $ JX,N
激动素$)5%和 %g( JX,NO..( 2S(g!(
""培养条件"愈伤组织在 (`
%
上连续培养#以继代
&% 代的稳定细胞为种子#接种于装有 0% JN (`
%
培
养基的 &(% JN三角瓶中#接种量为 &%f( 以 (`
&
中
细胞为对照#置于转速为 &&% E,JCL的摇床上#$( j
暗培养(
D=O?P 种氨基酸添加浓度的确定
""分别配制 &$g JJF/,N的 5EK).EX)5KE和 =母液( 在培养第 &$ 天#分别向 (`
%
中添加不同浓度
的 0 种氨基酸( 以 (`
&
中培养的细胞为对照#测定
细胞生物量及=HV1质量分数(
D=P?细胞生物量的测定
""抽滤除去悬浮培养肉苁蓉细胞试样表面水分#
经真空冷冻干燥至恒质量#得细胞干质量(
D=R?S0%1质量浓度的"ST,检测
""称取试样#充分研磨#通过响应面法优化得到
的最佳工艺*&$+ "乙醇体积分数 (%f#超声功率
$%% [#超声时间 &0 JCL#液料比 7%l&条件下超声提
取#萃取溶液通过 %g0(
#
J微孔滤膜过滤后 S=N*
检测(
""色谱条件"色谱柱 ]相柱$0g#
#
J#0g# JJp&(% JJ%#流动相 >$甲
醇%l>$乙酸% n$l#流速 %g! JN,JCL#柱温 $! j#
进样量 &%
#
N#检测波长 ( LJ#通过外标法对
=HV1质量浓度进行定量(
B?结果与讨论
B=D?无外源激素悬浮培养肉苁蓉细胞的生长与
S0%1合成
""肉苁蓉细胞悬浮培养过程中#细胞生长和
=HV1积累的动态变化见图 &( 从图 & 可以看出"无
外源激素培养的肉苁蓉细胞$简称 SY*%与添加生
长调节剂 )5和 O..培养的细胞$简称 S*%生长
曲线趋于一致#延滞期较短#随后细胞快速生长进
入指数期( SY*在第 &$ 天干质量就达到了最高#
$&g(! X,N#而 S*在第 &( 天干质量才达到最高
$&g$ X,N( 在细胞培养前期#=HV1质量分数持续
降低#SY*# D 后 =HV1开始大量积累#而 S*7 D
后 =HV1质量分数才逐渐升高( 随着干质量的增
长#=HV1产量呈上升趋势#在第 &! 天 SY*和 S*
均达到了最大值#分别为 g6 和 g& X,N( 这表
明在同样养分条件下#设计的不添加外源激素的
肉苁蓉细胞悬浮培养方案#不但不影响细胞的生
$"第 # 期 沈慧慧等"氨基酸对无外源激素悬浮培养肉苁蓉细胞合成苯乙醇苷的影响
长#而且还加速了 =HV1的积累( 从图 & 结果来
看#肉苁蓉细胞自身可以迅速诱导细胞内部自行
合成内源激素#满足了肉苁蓉细胞的生长需要(
可见无外源激素培养的条件下植物细胞也能够正
常生长#由于不含人工合成激素#细胞的安全性提
高#培养成本下降(
图 D?肉苁蓉悬浮细胞生长和S0%1合成
Q.;=D?%42NF-2713190/G0G:065/GS0%1
J.21K/F-01.1./.42-)-*/$1&3,
""杨万年等*&+认为#细胞脱分化成愈伤组织细胞
时#激素合成可能在特定的培养条件下受到诱导而
恢复活性( 因此即使是培养基中缺少外源激素#也
可能会诱导内源激素合成途径重新启动#激素代谢
途径从而得以加强而有利于细胞的分裂和生长(
)HMHE1等*&0+报道称#不依赖于外源激素的甜菜驯化
细胞中内源激素水平与依赖于外源激素的非驯化
细胞之间没有显著差别( 而肉苁蓉悬浮细胞不需
要添加外源激素也能够正常的生长和代谢#其干质
量与次生代谢产物产量都增加较快( 可能的原因
一是肉苁蓉为寄生植物#它与依靠寄主释放出的激
素激活内部的寄生组织发生寄生关系有很关键的
作用&二是因为肉苁蓉细胞受植物本身的遗传性和
激素水平的制约#设计的无外源激素培养基可诱导
其自身产生内源激素#维持细胞的生长*&(+ (
B=B?P 种氨基酸添加浓度对无外源激素培养肉苁
蓉悬浮细胞生长和S0%1合成的影响
""在对数生长期后期至稳定期开始阶段加入合
适浓度的诱导子#有利于刺激次级代谢产物的合
成( 因此#实验选定肉苁蓉悬浮细胞培养的第 &$ 天
加入不同浓度的氨基酸#$& D 后取样分析生物量和
=HV1质量浓度#研究氨基酸作为前体添加物对=HV1
合成的影响#结果见图 $ i((
""从图 $ 可看出"在无外源激素的培养条件下不
添加5EK$即SY*%时#干细胞质量浓度和=HV1产量
分别为 &%g( X,N和 %g#( X,N( 随着添加外源 5EK
浓度的增加#干细胞质量浓度呈先上升后下降的趋
势#而 =HV1产量却一直呈升高趋势#当 5EK浓度为
%g$ JJF/,N时干细胞质量浓度达到最高#为 &$g$6
X,N#而=HV1的积累并没有同步达到最高( 为了寻
找细胞生物量和 =HV1产量之间的平衡点#最终以
=HV1产量作为主要衡量指标( 当 5EK浓度为 %g
JJF/,N时 =HV1产量达到最高 %g#$ X,N#可见 5EK
对无外源激素悬浮培养肉苁蓉细胞有促生长作用#
但对=HV1合成的促进作用并不明显( 分析其原因
可能是肉苁蓉细胞本身具有合成及调节激素水平
的因子#其生长受外界 5EK含量及激素水平的影响
较小(
""不同浓度的.EX对细胞的干质量影响不大$图
%#但随着浓度的增加#=HV1产量先升高后降低#当
浓度为 %g& JJF/,N时#=HV1质量分数和产量达到
了最高#分别为 #g(&f和 %g6$ X,N#是对照 S*的
&g$ 倍和 &g$& 倍(
图 B?E4K对肉苁蓉悬浮细胞生长和S0%1合成的影响
Q.;=B?#70:F127E4K 2/F-0:06;42NF-27
.42-)-*/$1&3, 5/GS0%1J.21K/F-01.1
./13190/1.2/:36F340
""=添加到无外源激素培养体系中#细胞干质量浓度与
对照S*相比没有显著性差异#但对=HV1的合成有
很好的促进作用$图 0)图 (%( ==HV1的积累呈正相关#在浓度为 %g JJF/,N时
=HV1产量达到最高#是对照 S*的 $g%$ 倍&而随着
5KE浓度的升高 =HV1产量降低#在浓度为 %g%
JJF/,N时=HV1产量达到最高#为 &g&7 X,N#是对照
S*的 $g%$ 倍(
0$ 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
图 O?*4;对肉苁蓉悬浮细胞生长和S0%1合成的影响
Q.;=O?#70:F127*4; 2/F-0:06;42NF-27
.42-)-*/$1&3, 5/GS0%1J.21K/F-01.1
./13190/1.2/:36F340
图 P?S-0对肉苁蓉悬浮细胞生长和S0%1合成的影响
Q.;=P?#70:F127S-02/F-0:06;42NF-27
.42-)-*/$1&3, 5/GS0%1J.21K/F-01.1
./13190/1.2/:36F340
图 R?EK4对肉苁蓉悬浮细胞生长和S0%1合成的影响
Q.;=R?#70:F127EK42/F-0:06;42NF-27
.42-)-*/$1&3, 5/GS0%1J.21K/F-01.1
./13190/1.2/:36F340
""无外源激素不添加氨基酸时$即 SY*%干细胞
质量浓度)=HV1质量分数和产量分别最高达到了
&%g( X,N)#g$f和 %g#( X,N#是对照 S*的 %g7
倍)&g$ 倍和 &g&& 倍( 可见在无外源激素的条件下
不添加氨基酸前体饲喂肉苁蓉细胞合成 =HV1的能
力较强#这种培养方式既安全又能降低生产成本#
具有很好的经济效益( 而通过添加氨基酸作为前
体物质时#5EK和 .EX的效果不是很显著#但 =5KE对=HV1合成具有很明显的促进作用#=HV1产量
均达到了最高 &g&7 X,N#是对照 S*的 $g%$ 倍( 因
此选择 =大大提高#同时又降低了生产成本(
BWO?氨基酸添加时间对细胞生长和S0%1合成的
影响
""外源前体在细胞培养的不同时间添加#其对细
胞生长和次生代谢物合成的影响也有所不同( 当
外源前体在最佳时间加入时#培养物的次生代谢物
的产量要高于在其他时间加入时的产量*&#+ ( 因此#
选择=生长和=HV1合成的影响#在肉苁蓉细胞无外源激素
悬浮培养过程中#分别考察于不同培养时期加入
%g JJF&,N的 =续到第 $& 天#结果如表 & 所示(
表 D?氨基酸添加时间对无外源激素悬浮培养肉苁蓉细胞
生长和S0%1合成的影响
E5J60D ?#70:F1275I./25:.G700G./; F.I02/F-0:06
;42NF-27.42-)-*/$1&3, 5/GS0%1J.21K/F-01.1
2/-24I2/0H7400I0G.3I
氨基酸 7,D "
$干细胞%,
$X!N
?&
%
;$=HV1%,
f
"
$=HV1%,
$X!N
?&
%
=&6g%7
@
&g6#
@
(g0
@
=&0g#!
:
$(g(%
:
g60
A
=&(g06
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g!$
A
5KE !
&6g%
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$(g%$
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5KE &$
&#g#6
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%g7(
@
(g&#
@
5KE &#
&(g&%
:
$g7&
:A
g#&
A
对照$SY*% $&
&6g$$
@
$#g00
:
0g(#
:
对照$S*% $&
&#g!#
@
$&g#
A
g#(
A
"注"上标字母表示 \GLA@L 新复极差检测在 (f水平差异
不显著(
""由表 & 可知"在添加外源激素的对照实验$S*%
中#肉苁蓉细胞培养 $& D 后的干细胞质量浓度为
&#g!# X,N#=HV1质量分数为 $&g#f#=HV1产量为
g#( X,N( 而空白实验$SY*%中#肉苁蓉细胞培养
$& D后的干细胞质量浓度为 &6g$$ X,N#=HV1质量
分数为 $#g00f#=HV1产量为 0g(# X,N( 从前体物
的添加时间来看#=($"第 # 期 沈慧慧等"氨基酸对无外源激素悬浮培养肉苁蓉细胞合成苯乙醇苷的影响
和=HV1的积累#当在第 ! 天添加 %g JJF/,N=时#培养结束后干细胞质量浓度达到了最高$&6g%7
X,N%#同时=HV1质量分数和产量也达到了最高#分
别为 &g6# f和 (g0 X,N#是对照S*的 &g06 倍和
&g07 倍( 当在第 &$ 天添加 %g% JJF/,N5KE时#培
养至第 $& 天#=HV1质量分数 $%g7(f% 和产量
$(g&# X,N%都达到了最高#分别是对照 S*的 &g0
倍和 &g0& 倍( 而在其他时间添加效果均不明显(
""陈永勤等*&6+在云南红豆杉细胞培养第 &$ 天
时#向培养基中添加 =可显著提高细胞中紫杉醇的质量分数( 同对照相
比#紫杉醇产量均明显增加#但在培养的其他时间
添加效果均不佳(
O?结?论
""&%设计的无外源激素悬浮培养模式#既不影响
肉苁蓉细胞的生长#也不影响主要次生代谢产物
=HV1的合成#而且提高了悬浮培养细胞用于食品和
药物的安全性#降低了培养成本(
""$%=5EK和.EX的促进效果并不显著( 在培养的第 &$ 天
向无外源激素液体培养基中添加 %g JJF/,N=和 %g% JJF/,N5KE#=HV1产量均达到了最高$&g&7
X,N%#是对照S*的 $g%$ 倍(
""%%g JJF/,N=添加时间分别为第 ! 天和第 &$ 天#培养结束时肉苁
蓉细胞 =HV1产量分别为 (g0 X,N和 (g&# X,N#是
对照S*的 &g07 倍和 &g0& 倍(
参考文献"
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通讯#$%%#7$#%"(!7-(7&3
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<@L OL1BCB*##############################################
7&-703
国外动态
日本科学家从智齿牙胚组织中培养.万能细胞/
日本产业技术综合研究所的研究小组已成功从智齿的.牙胚/细胞中制造出能培育多种组织细胞的.万
能细胞/$C=]细胞%( 用牙胚细胞培育C=]细胞#比用皮肤细胞培育C=] 细胞的效率要高出百倍以上( 研究
小组已经确认能够从牙胚细胞中培育肠)软骨)神经和心肌等组织的细胞(
研究小组从被冷冻保存的 名十多岁少年的牙胚细胞中培育出了 C=] 细胞#培养过程中并未使用能提
高培养效率的原癌基因AQKA( 在不使用AQKA的情况下#用皮肤细胞的培育效率低于 %g%%&f#而用齿胚细
胞有时会超过 %g&f(
从同一牙胚组织中提取的细胞中#=.PO=& 基因较为活跃的细胞特别容易培育C=] 细胞( 该小组今后将
对这一基因进行分析#以求解析出能高效率培养C=] 细胞的组织( 这一研究成果已在美国,]ACHLAH-杂志上
发表(
法国用诱变育种技术替代转基因农作物
为改良传统农作物的品种和性能#法国采用植物诱发突变技术育种已有近 !% 年的历史( 据世界粮农组
织估计#$%%6 年全球共种植 $ ((% 种诱变育种农作物#其中近一半为粮食作物#生态农田也采用诱变育种的
农作物品种( 诱变育种农作物与转基因农作物不同#主要利用物理或化学的因素处理作物#使其发生基因
突变( 基因突变是作物变异进化的根本来源#为作物进化提供了最初的原材料(
从自然的角度讲#诱变育种的过程相对单纯#在提高农作物产量)保持土地肥力及保护环境方面都有很
大优势( 比如法国近年通过诱变技术选育的油葵#由于基因突变对咪唑啉酮类和磺酰脲类除草剂均产生了
耐受性#因此有效抑制了杂草生长( 在收割完油葵后#只需对农田翻耕除草即可#与之前农民播种时盲目撒
药相比#每 &% %%% J$ 农田除草剂用量可以减少 $,( 这与法国环境问题多方协商会议所确定的目标一致#
也有助于实现法国政府制定的 $%&! 年化学剂用量减少 (%f的目标(
$文伟河%
6$"第 # 期 沈慧慧等"氨基酸对无外源激素悬浮培养肉苁蓉细胞合成苯乙醇苷的影响