全 文 ：第6卷第5期
2008年9月
生物加工过程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Sep．2008
· 21 ·
姬松茸胞内多糖碱提取工艺
丁重阳1⋯，张笑然2，张 梁1’2，王玉红1，一，张志才2⋯，石贵阳∽，章克昌1刀
(I．江南大学工业生物技术教育部重点实验室，无锡214122；
2．江南大学 生物工程学院，无锡214122；
3．江苏大学 食品与生物工程学院，镇江212013)
摘要：为了进一步提高姬松茸胞内多糖得率，采用单因素实验和响应曲面法，对姬松茸茵丝体胞内多糖碱提取工
艺进行了研究。结果表明优化的碱提取工艺为提取时间4．63h，碱液浓度1．03moVL，提取温度60．90℃。液料比
85．85mL／g，在此条件下胞内多糖的提取得率为(273．49±1．59)mg／g干茵体，明显高于水提取所得到的胞内多糖
得率。这为姬松茸碱提胞内多糖理化性质、生理活性等方面进一步的研究提供切实可行的高效提取方法。
关键词：姬松茸；提取；多糖；响应曲面法；液体发酵
中图分类号：Q819；Q539 文献标志码：A 文章编号：1672—3678(2008)05—0021—06
Alkalineextractionprocessofintracellularpolysaccharides
fromAgaricusblazeiMurill
DINGChong-yan91一，ZHANGXiao—ran2，ZHANGLian91一，
WANGYu—hon912，ZHANGZhi—cai2’3，SHIGui．yan91·2，ZHANGKe．chan91’2
(1．KeyLaboratoryofIndustrialB otechnologyofMinistryofEducation，JiangnanUniversity，Wuxi214122，China；
2．SchoolfBiotechnology，JiangnanUniversity，Wuxi214122，China；
3．SchoolfFoodScienceandBiotechnoiogy，JiangsuUniversity，Zhenjiang212013，China)
Abstract：Alkalineextractingof tracellularpo ysaccharides(IPS)fromAgaricusblazeiMu illwasin．
vestigatedusingresponsesurfacemethodology．Theresultss owedthatheoptimalextractingprocess
conditionsareasfollows：extractionime4．63h。baseconcentration1．03m t／L．temperature60．90
℃，liquidtosolidratio85．85mL／g．Underthoptimalconditions．theextractingratioofcrudeIPSfrom
AgaricusblazeiMurillWaS(273．49±1．59)mg／gdrymycelium．Theet odisbetterthanthatofwater
extractingandfutherstudyofthecharacteristicsofIPSseffeetive．
Keywords：AgaricusblazeiMurrill；extracting；polysaecharide；responsesurfacemethodology；sub—
mergedculture
姬松茸(AgaricusblazeiMurrill)，原产于巴西，又
名巴西蘑菇，是一种珍稀的药食用真菌。近年来，
国内外研究发现姬松茸具有抑制肿瘤‘¨、调节免
疫‘2|、抗氧化‘3|、护肝损伤‘43等生物活性。尤其是
·收稿日期：2008-02-27
基金项目：国家863计划资助项目(2007AAIOZ346)
作者简介：丁重阳(1975一)，男，江苏南通人，博士，研究方向：生物资源与能源。
联系人：章克昌，教授。E—mail：zhtm98586@yeah．net
万方数据
· 22· 生物加工过程 第6卷第5期
其中所含的多糖具有很强的抗肿瘤活性b‘7]，具有
广阔的应用前景和较大的开发价值。
同固体栽培相比，液体发酵具有生产周期短，
产量稳定，更易于大规模培养等特点¨J，而研究表
明液体生产的姬松茸菌丝体与固体栽培生产的子
实体具有相似的抗肿瘤和免疫活性一J。因此，液
体发酵是一种开发姬松茸活性多糖的有效
方法‘1，101。
但是，无论是子实体还是菌丝体，有关姬松茸
多糖的提取主要集中在水提取工艺研究方面，而鲜
有关于碱提取工艺的研究报道。碱提取工艺是提
取真菌多糖、植物多糖的方法之一，有关对金耳‘1¨、
灵芝¨21等菌丝体多糖碱提取的研究表明该种提取
方式在提高多糖得率、减少多糖活性损失等方面具
有一定的优势。相关研究表明姬松茸碱提多糖同
样具有很强的抑制肿瘤的效果∞。7J，因此有必要对
其提取工艺进行研究。本文通过单因素实验和响
应曲面法考察r影响姬松茸胞内多糖(Intracellular
polysaccharide，IPS)提取得率的相关因素并进行工
艺优化。
1材料与方法
1．1 菌种
姬松茸(AgaricusblazeiMurrill)：由江南大学生
物资源研究室筛选保藏。
1．2培养基组成
斜面培养基：马铃薯葡萄糖培养基(PDA)。
液体种子培养基(∥L)：玉米粉20，麸皮粉10，
蔗糖20，KH2P042，MgS04·7H20l，VBl0．1
发酵培养基成分(g／L)：玉米粉20，麸皮粉10，
蔗糖10，KH2P043，MgS04。7H201．5，VBl0．1
1．3姬松茸菌丝体胞内多糖碱提取工艺流程
将通过深层培养获得的姬松茸菌丝体用蒸馏
水冲洗干净，60℃烘干至恒重。用研钵磨碎成千
粉，称重，加入50mL锥形烧瓶中，按照一定的液料
比(体积质量比，mL／g)加入一定浓度的NaOH溶
液，在恒温水浴锅中加热一定时间，布氏漏斗抽滤，
用纯水洗涤残渣3次，定容至100mL，用DNS法测
还原糖浓度¨引，苯酚．硫酸法测总糖浓度‘14|。
1．4胞内多糖提取得率的计算
提取液中的多糖质量浓度(g／L)=总糖质量浓
度(g／L)一还原糖质量浓度(∥L)
多糖得率(ms／g)=提取液中多糖质量浓度
(∥L)×提取液总体积(mL)／菌丝体干质量(g)
2结果与讨论
2．1 碱液浓度对胞内多糖提取得率的影响
选择0．25—1．25moVL浓度的NaOH溶液对
胞内多糖进行提取。由图l可见，在
0．25—0．5mol／L的浓度区间内，多糖的提取得率随
着浓度的增加而迅速上升；在0．5—1．25mol／L的
浓度区间内，虽然提取得率依旧呈增长趋势，但这
种增势随浓度升高而逐渐减缓。
∞
∞200
褂
啦160
襄
嫡
O．2 0．4 0．6 0．8 1．0 1．2 1．4
c(NaOH)／(mol·L-1)
图l 碱溶液浓度对多糖提取得率的影响
Fig．1Effectofbase—concentrationonthe
extractingratioofcrudeIPS
利用一定浓度的碱溶液作为提取剂，在适当的
温度下，破坏细胞膜结构，可以使胞内多糖尽可能
得以释放，但过高的碱浓度又会引起糖结构的变化
和破坏¨2|，因此选择碱浓度在0．75一1．25moL／L为
宜。
2．2液料比对胞内多糖提取得率的影响
对于浸提工艺过程，液料比是必须考虑的因素
之一[1¨12J。过低的液料比会导致多糖不能充分溶
出，而过高的液料比在工业生产上会造成不必要的
浪费。图2显示，随着液料比从20mL／g增至
80mL／g，多糖得率也随之升高，而在80mL／g和
100mL／g的液料比条件下多糖得率没有明显的区
别，因此液料比控制在80mL／g较好。
2．3提取温度对胞内多糖提取得率的影响
在30一70℃的范围内考察温度对碱提取多糖
得率的影响，结果如图3所示，提取得率随提取温度
的升高呈递增趋势，在70℃达到最大值。虽然适当
加热有利于菌丝体中多糖物质的溶出，但在过高的
温度下，在碱性溶液中的糖也更易于发生分解和碳
万方数据
2008年9月 丁重阳等：姬松茸胞内多糖碱提取工艺 · 23
架断裂。因此考虑到能耗及保护多糖的结构稳定
性，提取温度应控制在50—70℃。
f
∞
●
曼
碍
眨
蛰
嫡
图2液料比对多糖提取得率的影响
Fig．2Effectofliquid-solidratioontheextracting
ratioofcrudeIPS
，
∞
●
∞
E
≮
辫
皿廿
磐
蚺
图3提取温度对多糖提取得率的影响
Fig．3Effectof emperatureOntheextracting
ratioofcrudeIPS
2．4提取时间对胞内多糖提取得率的影响
在70℃、液料比80mL／g、碱浓度1mol／L的条
件下，对提取时间进行了考察，图4表明提取5h多
糖得率达到最高值251．12mg／g，进一步延长提取
时间则多糖得率反而下降。这表明，多糖溶解于提
取液中有个过程，时间过短，产物溶解不充分，但时
间过长，又易引起产物结构的破坏和生物活性的丧
失，并使生产效率降低。
，
∞
●
E
≤
於
靶
舞
媳
图4提取时间对多糖提取得率的影响
Fig．4Effectofexactingtimeonthe
extractingratioofcrudeIPS
2．5碱提取工艺的优化
在上述单因素实验的基础上，采用全因子中心
组合设计对提取工艺进行优化，本实验考察因子
(自变量)为提取时间、碱液浓度、提取温度、液料
比，其实际水平分别以x。、置、墨和x。代表，其编码
水平分别以A、B、C、D代表，各自变量的实验水平
及其编码范围见表l，其中a=1．68，评价指标(响
应值)为姬松茸胞内多糖提取得率(theextractingra—
tio fcrudeIPS，ERCI)。实验设计辅助软件为De—
signExpea(Version6．0．5)，实验设计及结果见
表2。
表l 实验因素水平及编码
Table1 Levelandcodeofvariablescho enforFull．factorialCCD
表中自变量编码值与真实值之间的关系分别为：J4=(五一5)／1，B=(x：一1)／0．25，c=(也一60)／10，
D=(墨一80)／20。
万方数据
24· 生物加工过程 第6卷第5期
表2全因子中心组合设计以及多糖得率
的实测值和预测值
Table2 CCDmatrixofthefourvariableswiththe
experimentala dpredictedvaluesofERCI
利用七述软件，对表2实验数据进行二次多项
回归拟合，获得了多糖提取得率预测值多对自变量
提取时间(A)、碱液浓度(曰)、提取温度(C)、
液料比(D)的多元回归方程：
；=268．27—10．44A+7．33B+1．75C+
5．86D一16．61A2—16．7982—15．52C2—
12．07D2—1．22AB一1．52AC一1．67AD+
2．128C一10．05占D一3．67CD
对上述方程进行方差分析(表3)，该方程极显
著(P=0．0035)，其校正决定系数(《。i)为0．9648，
表明此模型拟合度好，多糖提取得率仅有3．52％，
不能由此模型进行解释。各项回归系数显著性检
验表明：试验因素对多糖提取得率的曲面效应皆显
著；提取时间和碱液浓度的线性效应显著；而所选
诸因素之间，除了碱液浓度和液料比的交互影响显
著外，其他之间均相互独立，交互作用不显著(数据
未显示)。
表3回归方程方差分析
Table3 ANOVAforthequadraticpolynomialmodel
变异源 平方和 自由度 均方 F值P值
模
失
误
总和10839．95 18
墨三竺竺!!三竺竺!＆三坚竺!
根据模型方程所作的响应曲面图及其等高线
图见图5。等高线的形状可反映出交互效应的强弱
大小，椭圆形表示两因素交互作用显著，而圆形则
与之相反¨4】。由图5可直观地看出，当提取时间和
提取时间位于最佳值，即4．63h和60．90℃时，碱
液浓度和液料比对多糖提取得率的交互影响效应，
交互作用较显著。通过对模型方程及响应面的分
析，碱提胞内多糖得率最大值在以下条件下得到：
提取时间4．63h；碱液浓度1．03mol／L；提取温度
60．90℃；液料比85．85mL／g，预测此最大得率为
271．06mg／g。经实验验证，在此条件下提取得率为
(273．49-I．-1．59)mg／g，与预测值相符。
f
∞
●
一
点
≥Ⅱ
龚
嶷
●●
o
图5 碱液浓度和料液比交互影响多糖提取得率的曲面图及其等高线
Fig．5ResponsesurfacendtheircontourplotsofERClversusthebase—concentrationandliquid—solidrat o
5
9
3
7∞町
O
0
5
3
8
8
4
1
2
l
8
0
O
4
8
8：合铂4
1，4
2
2
I
"∞∞
6
3
9
l
l
7
l
0
型项项拟差
万方数据
2008年9月 丁重阳等：姬松茸胞内多糖碱提取工艺 · 25·
3结论
1)响应曲面法是一种优化生物过程的统计学
实验设计方法，采用该法不仅可以建立连续变量曲
面模型，对影响生物过程的因子及其交互作用进行
评价，确定最佳水平范围，而且所需的试验组数相
对较少，可节省人力物力，因此该法已被成功地应
用于各种各样的生物优化过程中¨5。。本实验优化
得到的姬松茸菌幺幺体胞内多糖碱提取工艺为提取
时间4．63h，碱液浓度1．03mol／L，提取温度60．90
℃，液料比85．85mL／g，在此条件下提取得率为
(273．49±1．59)mg／g干菌体。
2)实验结果表明，在相同的发酵培养条件下。
采用水提取法所得到的姬松茸胞内多糖得率仅为
16．15mg／g干菌体¨0|，远低于碱提法的多糖得率。
而与其他有关姬松茸胞内多糖水提取法的报道相
比¨卜"1，本文采用碱提取法，其多糖得率也明显
提高。
3)相关研究表明姬松茸碱提多糖同样具有很
强的抑制肿瘤的效果旧。J，而本研究提供了高效可
行的碱提取方法，这为姬松茸胞内碱提多糖的理化
性质、抗肿瘤活性等方面的后继研究奠定了物质
基础。
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世界将建首套废物制乙醇装置
加拿大政府部门宣布，将在阿尔伯达省埃德蒙顿市建设世界上第一套用城市固体垃圾制乙醇的工业规
模装置。目前，埃德蒙顿市已与加拿大最大的乙醇生产商绿野(GreenField)乙醇公司和领先的生物燃料技
术企业Enerkem公司签署了为期25a的合同。该项目拟于2010年启动。
这套投资为7000万加元的生产装置初期将年产3．6×107万L生物乙醇燃料，并可使阿尔伯达地区的
CO：在今后25a内减少超过600万t，相当于每年1．2万辆汽车在道路上行驶的排量。
瑞典公司计划利用松油提炼生物柴油
瑞典精炼商Preem公司表示将与森林主SodraSkogsagarna公司和Sveaskog公司共同出资建设一个工
厂，计划开始用松树油生产生物柴油。
Preem将投资2．5亿瑞典克朗。其中5000万瑞典克朗将用于新厂的建设，另外约2亿瑞典克朗将用于
改造旧厂设备。
三井物产将在巴西建生物乙醇生产基地
13三井物产与巴西PetroleoBrasileiro国营石油公司签约，建立一家新的生物燃料公司，采用从种植甘蔗
原料到生产乙醇的配套体制。该项目总投资约300亿13元，巴西PetroleoBrasileiro公司与13本三井物产各出
资20％；巴西当地农家以土地作为投资的公司出资60％。该合资公司将以生物乙醇出口到日本为主要生产
目的，计划2009年下半年开始运转。
近年来，13各大公司纷纷在海外合资建立生物燃料基地，但这是首个以出口13本为主的大型生物燃料
项目。新公司设在巴西戈亚斯州依塔卢玛市，为了避免“生物燃料与粮食生产争夺土地”的舆论批评，公司
准备新开垦灌木丛种植什蔗田，总面积为3万hm2。生产工厂将在2013年达到20万L生物乙醇的产量，超
过日本政府在《京都议定书》中提出本国使用生物燃料总量的1／4。
(朱宏阳)
万方数据