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Effects of environmental conditions on pyruvate production

环境条件对丙酮酸分批发酵的影响



全 文 :第7卷第1期
2009年1月
生 物 加 工 过 程
ChineseJournalofBioprocessEngineering
Vol.7No.1
Jan.2009
收稿日期:20080501
基金项目:国家杰出青年基金资助项目(20625619);国家重点基础研究发展计划(973计划)资助项目(2007CB71403);国家自然科学基金资助
项目(30670066,20706025);国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(2006AA02Z201)
作者简介:许庆龙(1983—),男,湖北十堰人,硕士研究生,研究方向:发酵工学;刘立明(联系人),副教授,Email:mingl@jiangnan.edu.cn
环境条件对丙酮酸分批发酵的影响
许庆龙,许晓鹏,刘立明,史仲平,堵国成,陈 坚
(江南大学 工业生物技术教育部重点实验室,无锡 214122)
摘 要:考察了搅拌转速、pH和温度对丙酮酸分批发酵的影响。高转速(500r/min)下,丙酮酸产率较高(71%),
但葡萄糖消耗速度较慢(123g/(L·h));低转速(300r/min)下,细胞消耗葡萄糖的速度加快(195g/(L·h)),而
丙酮酸产率(048%)却明显下降。将搅拌转速恒定在400r/min可在一定程度上获得较高的丙酮酸产率(062%)
和葡萄糖消耗速度(166g/(L·h))。CaCO3调节 pH时,较多碳流从丙酮酸节点转向 α-酮戊二酸节点和细胞生
长,最终丙酮酸产量比NaOH调节pH时的发酵结果低387%;NH3·H2O调节pH时最终细胞浓度和丙酮酸产量仅
为NaOH调节时的778%和909%。pH55时最利于丙酮酸的合成。较高的发酵温度加速 T.glabrata积累丙酮
酸,但同时会导致α-酮戊二酸的提前积累;而较低的温度下甘油和α-酮戊二酸积累较少,丙酮酸发酵的最适温
度为28~30℃。
关键词:丙酮酸;pH;搅拌转速;温度;光滑球拟酵母
中图分类号:Q815    文献标志码:A    文章编号:1672-3678(2009)01-0013-06
Efectsofenvironmentalconditionsonpyruvateproduction
XUQinglong,XUXiaopeng,LIULiming,SHIZhongping,
DUGuocheng,CHENJian
(KeyLaboratoryofIndustrialBiotechnologyofMinistryofEducation,SchoolofBiotechnology,
JiangnanUniversity,Wuxi214122,China)
Abstract:Theefectofstiringspeed,pHandtemperatureonthepyruvateproductionbyT.glabrata
CCTCCM202019,wasinvestigatedinbatchcultureprocessusinga7Lfermentor.Highpyruvateyieldof
71% wasachievedat500r/minwithslowglucoseconsumptionrateof123g/(L·h),andtheglucose
consumptionratewas195g/(L·h)at300r/min,butthepyruvateyielddecreasedto48%.Whenthe
stiringspeedwascontroledat400r/min,highpyruvateyieldof62% andhighglucoseconsumptionrate
of166g/(L·h)wereachieved.TheefectofpHbuferagentonpyruvateproductionwasalsostudied.It
wasfoundthatNaOHwasbeterforbothcelgrowthandpyruvateproduction.WhenthepHwascontroled
byCaCO3,thecarbonfluxwasdirectedtoαketoglutarateaccumulationandpyruvateproductionwasde
creasedby409% comparedwiththecorespondvalueofNaOH.Thetimecoursesofthecelgrowthand
thepyruvateproductionweresimilarbetweenNaOHandNH3·H2O.However,thefinalDCWandpyruvate
productionwereonly778% and901% oftheformerone,respectively.Atarangeof50to60,55
wastheoptimalpHforthepyruvateproduction.Theefectofthetemperature,from26℃to34℃,onthe
pyruvateproductionina7LstiredfermentorbyT.glabrataCCTCCM202019wasinvestigated.Hightem
peraturesfastenedtheformationofglycerolandαketoglutarate,andtheirconcentrationswerehigherat
highertemperature.Theoptimaltemperatureforthepyruvateproductionwas28℃ to30℃.
Keywords:pyruvate;pH;stiringspeed;temperature;Torulopsisglabrata
  丙酮酸不仅在生物能量代谢中具有十分重要的
作用,而且是多种有用化合物的前体,在化工、制药和
农用化学品等领域有着广泛的用途[1-2]。生物技术
法生产丙酮酸是满足丙酮酸应用需求的根本途
径[3-4]。烟酸、硫胺素、吡哆醇和生物素4种维生素
的营养缺陷型菌株T.glabrataCCTCCM202019是发
酵法生产丙酮酸的首选菌株[5]。
微生物发酵的生产水平不仅取决于生产菌种
本身的性能,而且要在合适的环境条件下才能充分
发挥出发菌株对目标产物的生产能力[6-8]。光滑球
拟酵母(Torulopsis)的维生素营养缺陷型以葡萄糖
为底物积累丙酮酸时,溶氧是一个很重要的影响因
素[9-10]。发酵过程中培养基的pH也是一项重要的
控制参数,pH控制水平和调节方式将对丙酮酸的产
量产生影响[11-13]。此外,在发酵过程中需要保持菌
体生长和产物合成所需的最适温度[14-16]。本文通
过7L发酵罐系统研究溶氧、pH和温度等环境因素
对T.glabrataCCTCCM202019分批发酵生产丙酮
酸的影响,以确定较为合适的丙酮酸分批发酵条件。
1 材料与方法
11 菌 种
光滑球拟酵母 T.glabrataCCTCCM202019,
NA、Bio、B1、B64种维生素营养缺陷型,且丙酮酸脱
羧酶活性组成型降低,为本研究室选育[5]。
12 培养基
参见文献[5]。
13 培养方法和分析方法
参见文献[5]。根据不同实验改变搅拌转速、
pH调节剂、控制方式及温度等。
14 数据处理
葡萄糖比消耗速率(σ)、细胞比生长速率(μ)
和丙酮酸比合成速率(π)计算参见文献[9]。
2 结果与讨论
21 溶氧对丙酮酸分批发酵的影响
图1显示的是在不同搅拌转速下 T.glabrata
CCTCCM202019分批发酵生产丙酮酸过程中溶氧
的变化趋势。在控制不同转速的发酵过程中,溶氧
均表现出相似的变化规律。在发酵初期(0~16h),
菌体耗氧速率明显快于供氧速率,表现为溶氧迅速
下降;而16h后,耗氧速率和供氧速率则基本保持
平衡;在发酵末期(64h)以后,溶氧逐渐回升,表明
菌体耗氧逐渐停止。
1—500r/min;2—400r/min;3—300r/min
图1 不同搅拌转速下发酵过程的溶氧变化趋势
Fig.1 Profileofdissolvedoxygenconcentrationsat
diferentagitationrates
不同搅拌转速下的丙酮酸发酵过程参数随时
间的变化情况如图2所示。硫胺素浓度很低时,细
胞消耗葡萄糖的速率完全由细胞的能量水平控制。
当溶氧(DO)很高时,一方面 NADH几乎全部通过
呼吸链氧化,使得ATP通量明显提高;另一方面,生
物合成需要的ATP量又非常少,使得大量ATP剩余
在细胞内部,在这种高能状态下,细胞降低了葡萄
糖的消耗。相反,当溶氧较低时葡萄糖消耗速率较
快。因此,当搅拌转速控制在400r/min时,丙酮酸
生产强度最佳(101g/(L·h))。
22 pH对丙酮酸分批发酵的影响
221 不同pH调节剂对丙酮酸发酵的影响
在确定溶氧条件的基础上,分别利用NH3·H2O、
CaCO3和NaOH3种物质调节发酵液pH,实验结果如
图3所示。当用NaOH调节pH时,丙酮酸的质量浓
度最高为678g/L,分别为CaCO3和NH3·H2O调节
pH时的163和11倍。不同物质调节pH时的细胞
生长过程也不尽相同:使用NaOH调节pH时整个过
程细胞平稳生长,最终细胞质量浓度达到156g/L;
41 生 物 加 工 过 程   第7卷 
而采用CaCO3作为pH调节剂时细胞经历了比较长
的生长延滞期后才获得较大的生长速度,最终细胞
浓度与使用 NaOH时接近;而采用 NH3·H2O调节
pH时细胞生长过程与使用NaOH相近,但最终细胞
量仅为前者的778%。由于 Ca2+能提高丙酮酸羧
化酶的活性,从而造成碳流量从丙酮酸向 α-酮戊
二酸和细胞生长的转变[17];过高浓度的 NH+4对酵
母细胞的抑制作用强于等量的Na+[18-19],尽管流加
NH3·H2O能避免丙酮酸发酵后期的 N源供应不
足[20],但是在N源充足时,过高的NH+4将显著抑制
细胞生长和产酸。
图2 不同搅拌转速下的丙酮酸分批发酵参数
Fig.2 Timecoursesofbatchpyruvicacidfermentationatdiverseagitationrate
图3 pH调节剂对丙酮酸发酵过程影响曲线
Fig.3 TimecourseofpyruvatefermentationprocessatdiferentpHcontrolmode
222 控制不同pH时的丙酮酸发酵过程
使用 NaOH作为 pH调节剂,研究不同 pH对
丙酮酸分批发酵的影响。图4给出了不同 pH条
件下,T.glabrataCCTCCM202019分批发酵生产
丙酮酸的过程曲线。结果表明,该菌能够在较宽
的 pH范围内进行生长并合成丙酮酸,但不同 pH
条件下的情况又不尽相同。各过程参数在 pH55
以下时呈现上升趋势,而高于55时又有所下降,
在 pH55时各参数(残留葡萄糖浓度除外)均达
到最大值。可见,恒定 pH为55对发酵丙酮酸较
为有利。
23 温度对丙酮酸分批发酵的影响
231 温度对丙酮酸发酵过程的影响
前期摇瓶实验表明光滑球拟酵母的生长温度
上限为37℃。图5所示的是在26~34℃范围内,
发酵生产丙酮酸过程中细胞生长(A)、丙酮酸合成
(B)、葡萄糖消耗(C)和 N源消耗(D)情况。结果
表明:随着温度的升高,发酵初期胞内的能荷水平
较高,保证了菌体合成代谢所必需的能量,葡萄糖
消耗速度明显加快,N源(NH4Cl)的消耗规律与葡
51 第1期 许庆龙等:环境条件对丙酮酸分批发酵的影响
萄糖类似。但随着发酵的进行,较高的温度使细胞
提早进入稳定期,造成细胞的后继产酸耗糖能力不
足。相对而言,较低发酵温度下发酵初期细胞生长
和产酸的延滞期较长,而发酵后期细胞可以维持较
强的产酸能力。28~30℃下细胞浓度和丙酮酸产
量相对较高。
图4 不同pH下丙酮酸发酵过程曲线
Fig.4 TimecourseofpyruvicacidfermentationprocessatdiferentpH
图5 温度对细胞生长(A)、丙酮酸合成(B)、葡萄糖消耗(C)和NH4Cl消耗(D)的影响
Fig.5 Efectsoftemperatureoncelgrowth(A),pyruvateproduction(B),
glucoseconsumption(C)andNH4Clconsumption(D)
232 温度对丙酮酸发酵过程副产物形成的影响
丙酮酸发酵过程中会形成2种主要的副产物:
α-酮戊二酸[10]和甘油[21]。由图6(A)可以看出,较
高的发酵温度会导致α-酮戊二酸提前积累,温度为
34℃时α-酮戊二酸的积累量(541g/L)为26℃时
(06g/L)的9倍。甘油的积累总量和积累速度也同
样显著依赖于温度(图6B),发酵结束时不同温度下
发酵液中的甘油积累量相差653倍。因此,为减少
丙酮酸发酵副产物的积累,应在发酵后期适当降低发
酵温度,使代谢流持续高效地流向丙酮酸节点。
61 生 物 加 工 过 程   第7卷 
图6 温度对代谢副产物α-酮戊二酸(A)和甘油合成(B)的影响
Fig.6 Efectsoftemperatureonbyproductincludingαketoglutarate(A)and
glycerol(B)accumulationinpyruvatefermentation
3 结 论
1)考察了分批发酵中不同搅拌转速对 T.gla
brataCCTCCM202019产丙酮酸性能的影响。高转速
(500r/min)下,丙酮酸产率较高(71%),但葡萄糖消
耗速度较慢(123g/(L·h));低转速(300r/min)下,
细胞消耗葡萄糖的速度加快(195g/(L·h)),然而丙
酮酸产率(48%)却明显下降。将搅拌转速恒定在
400r/min可在一定程度上获得较高的丙酮酸产率
(62%)和葡萄糖消耗速度(166g/(L·h));
2)CaCO3调节pH时,较多碳流从丙酮酸节点转
向α-酮戊二酸节点和细胞生长,最终丙酮酸产量比
NaOH控制pH时的发酵结果低387%;NH3·H2O调
节pH时细胞生长过程与NaOH相近,但最终细胞浓
度和丙酮酸产量仅为前者的778%和909%;在pH
50~60范围内,pH55时最有利于丙酮酸的合成;
3)较高的发酵温度会导致 α-酮戊二酸的提
前积累,甘油的积累总量和积累速度也同样显著依
赖于温度。丙酮酸发酵的最佳温度为28~30℃。
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2000.
国内简讯
60万t生物柴油项目在黄陂武湖投产
用油厂下脚料、城市地沟油等废弃油料制成的生物柴油,将大批量在黄陂武湖投产出油。据承担年产
60万t生物柴油重大科技攻关及产业化建设项目的湖北钧生生物科技公司透露,试投产的首组生产线将年
产柴油3万t。该项目较国内同行业生产工艺时间缩短8h,每吨生产成本下降800元,产品质量达到欧洲II
类标准。
科学家发现生物质新用途
一个由中美科学家组成的研究小组研发出了一种新的催化剂,它能将纤维素这种生物质中最常见的形
式直接转化为乙二醇。
这种催化剂经过改良后一旦商业化,就将能够降低乙二醇的生产费用。此外,研究人员说,因为其起作
用的原材料不是粮食,它也不会威胁到粮食安全。
但是,将纤维素转化成乙二醇的过程目前仍十分缓慢,且需要包括铂类金属在内的几种贵重的反应介
质。由碳化钨和镍组成的新的催化剂可以极大地简化这一过程,并且将纤维素百分之百地转化。碳化钨和
镍的组合将乙二醇在最终产品中的含量提高到了61%,而单纯使用碳化钨产生的乙二醇只占最终产品的
27%。同现有的铂类金属催化剂相比,这种新的催化剂很有可能将乙二醇的生产成本降低50倍。尽管目前
对这一催化剂的前景下结论还为时过早,但是类似的研究对任何国家都有“战略意义”,特别是在当前面临
能源短缺和日益增长的食品需求的情形下。
谷氨酸市场面临新利好新机会
目前我国谷氨酸总发酵能力已接近160万 t,约占全球谷氨酸产能的75%;而日本的谷氨酸产能,即包
括日本味之素株式会社在本土和海外分公司产能在内合计只有不到60万t;韩国的谷氨酸发酵能力在20~
25万t。再加上我国台湾地区的谷氨酸发酵能力,可以认为,亚洲谷氨酸厂商基本上主宰了国际谷氨酸
市场。
与此同时,我国已取代日本成为全球最大的味精(谷氨酸钠)出口国。而西方国家逐渐改变对味精使用
的观念,估计对今后的谷氨酸市场将是一个大好消息。
(文伟河)
81 生 物 加 工 过 程   第7卷