全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 月 生"物"加"工"过"程 -:@CE0E]BHFC,.BDY@B1FBIE00TCJ@CEEF@CJ bB.2! +B2# ]H.K$%&%
GB@"&%2(/*/6_2@00C2&*$=(*!2$%&%2%#2%&&
收稿日期"$%&% =%( =%& 基金项目"国家自然科学基金资助项目#$%(*%*&$%!%*%#$%中国博士后科学基金面上资助项目#$%%/%#)%&&*$
作者简介"于海峰#&/)&$女山东昌乐人博士副教授研究方向"功能性食品与食品添加剂TRA,@."K:D%!(&cK,:BB2IBA2IC 均匀设计法优化发菜细胞悬浮培养条件 于海峰&贾士儒$
#&2山东轻工业学院 山东省微生物工程重点实验室济南 $)%()(%$2天津科技大学 天津市工业微生物重点实验室天津 (%%#)$摘"要"通过摇瓶发酵实验研究了培养温度)光照强度等培养条件对发菜细胞悬浮培养生物量和代谢产物发菜多 糖累积的影响通过均匀设计试验对培养条件进行了优化( 结果表明"在培养温度$# e)培养基初始 14!d%)光照
强度 *%
"
AB.6#A
0$)转速 &)% F6A@C的条件下培养$% G发菜细胞生物量#细胞质量浓度$达到 &d(# J6V胞外多 糖产量达到$%!d($AJ6V%与优化前相比发菜细胞生物量和胞外多糖产量分别提高$d(i)&&&d&i(
关键词"胞外多糖%发菜%悬浮培养%均匀设计
中图分类号"7/#/d$""""文献标志码"5""""文章编号"&*$ =(*!#$%&%$%# =%%) =%)
+9F.G.H5F.2/2713190/1.2/:36F.Z5F.2/272)"5)#6*(7%*6)&8%
:061JA 3/.724GI01.;/
LW4,@RDECJ
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$2f@,C_@C NEKV,8 BDMCGH0?F@,.` @IFB8@B.BJK f@,C_@C WC@\EF0@?KBDQI@ECIErfEI:CB.BJK f@,C_@C (%%#) -:@C,$
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1B.K0,II:,F@GE,IIHAH.,?@BC BD"0,40)5*$6%*50/7%IE.0ZEFE0?HG@EG @C 0:,h@CJD.,0h DEFAEC?,?@BC2 WC@DBFAGE0@JC Z,0H0EG ?BB1?@A@9EIH.?HFEIBCG@?@BC0BD0H01EC0@BC IH.?@\,?@BC2f:EB1?@AHAIBCG@?@BC0 ZEFE$# e 14!d% .@J:?@C?EC0@?KBD*%
"
AB.6#A
$!0$ ,CG FB?,?@CJ01EEG &)% F6A@C25D?EF$% G IH.?@\,?@BC&d(# J6VIE.8@BA,00,CG$%!d($AJ6VT;Q K@E.G ZEFE@CIFE,0EG$d(i ,CG &&&d&i BD
?:EHCB1?@A@9EG IBCG@?@BC0 FE01EI?@\E.K2
K0A L24I1"E^?F,IE.H.,F1B.K0,II:,F@GE% "0,40)5*$6%*50/7%% 0H01EC0@BC IH.?@\,?@BC% HC@DBFAGE0@JC ""发菜#"0,40)5*$6%*50/7%$是一种生长在中国西 部干旱半干旱地区的陆生蓝细菌( 其热水浸提物 具有抗癌活性有效成分是一种酸性多糖该多糖 对包膜病毒有很强的抗病毒活性*&+ ( 发菜在自然 环境中生长十分缓慢大规模无节制地采收不仅使 其濒临枯竭而且破坏了生态系统( 为保护资源和 生态人们对发菜进行了人工培养的研究以发菜 原植体为研究对象发菜原植体在液体培养基里短 期内可以生长但易分解*$+ %土壤固相培养虽能够
生长但由于条件难于控制一年内发菜生物量仅
增长 *i*(+ ( 从天然发菜原植体中分离出细胞作为
种子进行悬浮培养*#+ 发现悬浮培养虽然较野生发
菜生长速度有了较大提高但培养时间长收获生
物量较低(
""均匀设计是一种用于多因素优化的实验设计
方法可用较少的实验次数完成复杂的科研课题和
新产品的研究开发( 均匀设计已经在微生物工程
等方面有较多的应用*) =+ ( 本研究在考察培养温
度)光照强度等培养条件对发菜细胞悬浮培养生物
量和多糖累积影响的基础上应用均匀设计方法对
发菜细胞悬浮培养条件进行优化以提高发菜细胞
的生物量和发菜多糖的产量(
D?材料与方法
D=D?藻种和培养基
&2&2&"藻种
""发菜细胞种由天津市工业微生物重点实验室
分离保存( 实验前经平板划线多次纯化挑取平板
上发菜细胞的纯培养菌落接入 YO&& 培养基中培
养得到发菜细胞培养液备用(
&2&2$"培养基 ""采用优化后的YO&&培养基配方#AJ6V$"+,+>
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与培养基其他成分分开单
独灭菌以防止产生沉淀(
D=B?实验方法
&2$2&"细胞培养方法 ""将处于对数生长期的发菜细胞种子液$% AV接
种到装有 &!% AV培养基的 )%% AV三角瓶中置于
4P7=7光照振荡器悬浮培养分别设置不同温度)
光照强度和转速(
&2$2$"测定方法
""生长量的测定用干质量法*!+ %胞外多糖#T;Q$含量的测定用改良的苯酚 硫酸法*/+ ( B?结果与讨论 B=D?培养温度对发菜细胞生物量和多糖累积的影响 ""在转速 &(% F6A@C)光照强度 *% " AB.6#A$
!0$) 培养基初始 14!d%)$) e的培养条件下将发菜细
胞在不同温度下悬浮培养 $% G其生物量和胞外多 糖产量结果如图 & 所示( ""从图 & 可以看出"$) e的条件下发菜细胞生
物量最高达到 &d%) J6V此时胞外多糖产量最高
达到 &&$d#& AJ6V( 故实验培养温度定为$) e(
图 D?温度对发菜细胞生物量和胞外多糖产量的影响
N.;=D?#70:F127F0G9045F3402/F-0;42LF-5/I#W!
942I3:F.2/272+6*(7%*6)&8%:061
""微生物的生长和代谢产物的合成都是在各种
酶的催化下进行而酶活与温度有密切关系( 温度
升高酶促反应速率加快细胞生长速率亦加快代
谢产物形成的生产期随之提前( 但是酶很容易因
为受热而失活温度越高酶失活越快( 同时温度
的改变也影响发菜细胞的光合呼吸速率苏建宇
等*&%+报道离体发菜细胞在 $) e时光合速率最大 而呼吸速率随着温度的升高而增加本实验从生物 量的角度验证了这一结论( B=B?光照强度对发菜细胞生物量和多糖累积的影响 ""在培养温度$) e)转速 &(% F6A@C 和培养基初
始 14!d% 的培养条件下光照强度对发菜细胞生长
影响显著结果如图 $所示( ""由图$ 可知"光照强度从 &%
"
AB.6#A
$!0$增
加到 *%
"
AB.6#A
$!0$ 时 细 胞 的 生 物 量 从
%d$J6V增加到 &d&# J6V胞外多糖产量也随之增 加最高达到 &&$d( AJ6V( 在实验条件范围内没
有 观 察 到 光 抑 制 现 象( 故 光 照 强 度 定
为*%
"
AB.6#A
$!0$(
图 B?光照强度对发菜细胞生物量和胞外多糖产量的影响
N.;=B?#70:F1276.;-F./F0/1.FA 2/F-0;42LF-5/I
#W!942I3:F.2/272+6*(7%*6)&8%:061
!) 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
B=M?初始9"对发菜细胞生物量和多糖累积的影响
""在光照强度 *%
"
AB.6#A
$!0$)培养温度 $) e) 转速 &(% F6A@C 的培养条件下发菜细胞在培养基 初始 14)d% k/d% 的范围内均能生长#图 ($(
""由图 ( 可知"在培养基初始 14!d% 时发菜细
胞生长最好生物量达到 &d%( J6V( 在 14)d% k
!d% 的范围内胞外多糖产量随着初始 14的升高而
增加14!d% 时多糖产量最高达到 &&$d(* AJ6V( 故选择 14为 !d% 为初始 14( 图 M?初始9"对发菜细胞生物量和胞外多糖产量的影响 N.;=M?#70:F127./.F.569"27G0I.3G2/F-0;42LF- 5/I#W!942I3:F.2/272+6*(7%*6)&8%:061 B=@?转速对发菜细胞生物量和多糖累积的影响 ""在光照强度 *% " AB.6#A$
!0$)培养温度$) e
和培养基初始 14!d% 的培养条件下不同转速条件
下发菜细胞的生长情况见图 #(
""由图 # 可知"转速为 &(% F6A@C时细胞生长最
好生物量达到 &d&$J6V( 增加转速可以提高培养 基中->$
的浓度促进细胞生长% 而太高的转速产
生剪切力过大不利于细胞生长( 胞外多糖产量随
转速的变化与生物量变化情况类似在转速为 &(%
F6A@C时胞外多糖产量最高达到 &&%d$# AJ6V( 故选择转速为 &(% F6A@C( 图 @?转速对发菜细胞生物量和胞外多糖产量的影响 N.;=@?#70:F12742F5F01900I2/F-0;42LF-5/I #W!942I3:F.2/272+6*(7%*6)&8%:061 B=P?均匀设计优化悬浮培养条件$2)2&"均匀设计试验方案及试验结果
""根据以上单因素实验结果采用均匀设计表中
的四因素九水平#拟水平$试验 / 组方案研究培养 温度)光照强度)转速和培养基初始 14对发菜细胞 生物量和胞外多糖产量的影响( 试验设计方案和 结果如表 & 所示( 表 D? ] #] @$均匀设计及试验结果
E5J60D?/.724GI01.;/5/I40136F1
试验号
因素
D
&
初始 14
D
$光照强度6 # " AB.!A =$
!0
=&
$D ( 温度6 e D # 转速6 #F!A@C =&$
F
&
!
#细胞$6 #J!V =&$
F
$! #胞外多糖$6
#AJ!V
=&
$& )d%$% $( &$% %d!* #d
$)d) #%$ &)% %d/% /d$( *d% *%$$/% %d// !/d# # *d) )%$* % %d#* #*d(
) d% &% $& &)% %d)* *!d/ * d) (%$) /% &d%$&%$d(
!d% )% $% &$% &d($&#(d$
! !d) #% $# *% %d!/ //d / /d% *%$! &$% &d$( &(!d*
/)"第 # 期 于海峰等"均匀设计法优化发菜细胞悬浮培养条件
$2)2$"试验数据的回归分析和方程建立
""试验结果经 Q;QQ&&d) 软件数据处理用逐步回
归法处理数据结果见表 $和表 (( 采用向后剔除 法逐步回归分析得出回归方程" ""F & m%d#(& & l%d%)* &D$
=%d%$! (D ( l %d%%$D
$( =%d%%% %&D$
#
=%d%%$D$
D
(
l%d%%% /D
&
D
$相关系数 >m%d/*#显著水平 #值为 %d%%! /( 对 应的最优培养条件"培养基初始 14d%培养温度$# e光照强度 #!
"
AB.6#A
$!0$转速 &## F6A@C
预测最优结果为 &d(# J6V( F
$m&(d# l$d*)&D
&
=
%d%%& )D
#
D
#
=%d!$(D & D ( l%d%&( !D$
D
#
相关系数
>m%d/*显著水平#值为 %d%&) 对应的最优
培养条件"培养基初始 14/d%培养温度 $% e光 照强度 *% " AB.6#A$
!0$转速 &#/ F6A@C预测最优 结果为$%*d*( AJ6V(
表 B?逐步回归法处理均匀设计的9
D
结果
E5J60B?9
D
40136F127F405F0IJA 1F09L.1040;4011.2/
273/.724GI01.;/
因素 回归系数 偏相关 4检验 显著水平#
D
$%d%)* & %d/// ($*d%&/ ! %d%%& )
D
(
=%d%$! ( =%d/(($ $d)/ / %d&$&
D
$( %d%%$ %d//& ) d*&! * %d%&* !
D
$# =%d%%% %& =%d//* &$d()/ * %d%%* )
D
$D ( =%d%%$ =%d/// * (#d& / %d%%%
D
&
D
$%d%%% / %d/// ) ((d%%&$ %d%%% /
""根据各变量显著性检验 #值的大小可以排列
出各因素对细胞生物量影响的强弱程度#从大到
小$依次为D$
D
(
D
&
D
$D$
#光照强度$D$
#
D
$( D ( #温度$其中光照强度对细胞生物量的影响最为显
著%对胞外多糖产量的影响强弱程度#从大到小$依 次为D$
D
#
D
&
#初始 14$D & D ( D$
#
#转速$其中培 养基初始 14对胞外多糖产量的影响最为显著( 表 M?逐步回归法处理均匀设计的9 B 结果 E5J60M?9 B 40136F127F405F0IJA 1F09L.1040;4011.2/ 273/.724GI01.;/ 因素 回归系数 偏相关 "4=检验 显著水平# D &$d*)& % %d/% #d($) ) %d%% ) D$
#
=%d%%& ) =%d#( * $d$$# & %d%* D & D ( =%d!$( % =%d!)# $(d$!* % %d%$& ! D$
D
#
%d%&( ! %d/&! * #d*#! % %d%%) *
$2)2("摇瓶优化培养条件的验证试验 ""根据均匀设计试验优化结果综合考虑细胞生 物量和胞外多糖产量两个指标确定最优培养条 件"培养基初始 14!d%)光照强度 *% " AB.6#A$
!0$) 培养温度$# e和转速 &)% F6A@C( 在最优条件下进
行验证试验结果见表 #(
表 @?优化方案验证试验结果
E5J60@?#[904.G0/F40136F12729F.G3G942c0:F
指标 预测值 实验值 误差6i
!
#细胞$6#J!V=&$ &d(#( &d(( %d $$! #胞外多糖$6 #AJ!V =& $ $%*d*( $%!d($ %d!& ""由表 # 可以看出"实验值与预测值的误差在允 许范围之内说明均匀设计优化的培养条件准确可 信( 在最优条件下培养 $% G细胞生物量达到 &d(( J6V胞外多糖产量达到 $%!d($ AJ6V%与优化 前#培养温度 $) e)初始 14 d%) 光照强度 *% " AB.6#A $ !0$$ 得到的培养结果#生物量 &d%) J6V)
胞外多糖产量 /!d*) AJ6V$相比分别提高了$d(i)&&&d&i(
M?结?论
""分别以细胞生物量和胞外多糖产量为优化指
标在单因素实验的基础上通过均匀设计法对发菜
细胞悬浮培养条件进行了优化研究( 结果表明"在
优化后的 YO&& 培养基中培养温度 $# e)培养基 初始 14 !d%)光照强度 *% " AB.6#A$
!0$)转速 &)% F6A@C条件下培养$% G 细胞生物量达到
&d(( J6V胞外多糖产量达到 $%!d($ AJ6V( 本试
验结果还表明"用振荡培养控制合适的培养条件
有利于发菜细胞进行光合作用有利于促进发菜细
胞的生长和胞外多糖的累积为建立工业化悬浮培
养发菜细胞工艺提供了理论基础(
参考文献"
*&+"N,CEh@KBNVEE]Y4,K,0:@NE?,.24,K,0:@@0B.,?@BC BD,C ,CR
?@\@F,.1B.K0,II:,F@GECB0?BD.,C DFBA,?EFE0?F@,.IK,CB8,I?EF@HA
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*$+"O,BNQLE-;2-H.?HFEBD?:E?EFE0?F@,.IK,CB8,I?EF@HA"0,40) 5*$6%*50/7%#IK,CB1:KIE,E$HCGEF,XH,?@IIBCG@?@BC0*]+2]BHFR C,.BD;:KIB.BJK$%%((/"*&R*$(2 %* 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷" *(+"戴治稼2发状念珠蓝细菌研究的回顾*]+2宁夏大学学报"自 然科学版&//$&(#&$"&R*2 3,@P:@_@,2aE\@EZBD"0,40)5*$6%*50/7%FE0E,FI:*]+2]BHFC,.BD
+@CJ^@,WC@\EF0@?K"+,?HF,.QI@ECIETG@?@BC&//$&(#&$" &R*2
*#+"于海峰贾士儒苏建宇2发状念珠藻细胞液体悬浮培养的研
究*]+2化学工程$%%!(*#($")%R)#2
LH 4,@DECJ]@,Q:@FHQH ]@,CKH2V@XH@G 0H01EC0@BC IH.?@\,?@BC BD
"0,40)5*$6%*50/7%IE.0*]+2-:EA@I,.TCJ@CEEF@CJ$%%! (*
#($")%R)#2 *)+"李夏兰魏国栋王昭晶等2均匀设计法优化芥菜多糖提取工 艺的研究*]+2食品与发酵工业$%%)(&#!$"&%#R&%*2 V@S@,.,C[E@OHBGBCJ[,CJP:,B_@CJE?,.2>1?@A@9E?:EE^R ?F,I?@BC 1FBIE00BD?:E1B.K0,II:,F@GE0DFBA$,)$ P+&)%$ 8K?:E<brHC@DBFAGE0@JC*]+2UBBG ,CG UEFAEC?,?@BC MCGH0?F@E0$%%)(&
#!$"&%#R&%*2 **+"董函竹刘沛溢谭天伟2发酵生产 L 腺苷 ! 蛋氨酸培养条 件的优化研究*]+2微生物学通报$%%*((#&$"&&%R&&(2 3BCJ4,C9:HV@H ;E@K@f,C f@,CZE@2>1?@A,.0?HGKBC ?:EDEFR AEC?,?@BC IBCG@?@BC0BDLR,GECB0K.R!RAE?:@BC@CE*]+2 @`IFB8@B.BR JK$%%*((#&$"&&%R&&(2 *+"陶勇卜龙章富金虹等2均匀设计法对产几丁质酶细菌 -# 发酵条件的优化*]+2生物技术$%%#&##*$"##R#*2 f,BLBCJ8HVBCJP:,CJDH]@C 4BCJE?,.2>1?@A@9,?@BC BDDEFR AEC?,?@BC IBCG@?@BC BDI:@?@C,0ER1FBGHI@CJ8,I?EF@HA-# 8KHC@R DBFARGE0@JC*]+2Y@B?EI:CB.BJK$%%#&##*$"##R#*2 *!+"贾士儒2生物工艺与工程实验技术* +`2北京"中国轻工业出 版社$%%$2 */+"白雪娟苏建宇赵树欣等2发菜细胞培养液中多糖含量测定 方法的比较研究*]+2食品工业科技$%%#$)#&&$"&#* R&#/2
Y,@SHE_H,CQH ]@,CKHP:,BQ:H @^CE?,.2Q?HGKBC ?:EGE?EFA@R
C,?@BC AE?:BG0BDE^?F,IE.H.,F1B.K0,II:,F@GE@C IH.?HFEAEG@HABD
"0,40)B*$6%*50/7%IE.0*]+2QI@ECIE,CG fEI:CB.BJKBDUBBG MCR GH0?FK$%%#$)#&&$"&#*R&#/2
*&%+ 苏建宇何茜贾士儒2液体悬浮培养条件下发状念珠藻单体
细胞的光合速率和呼吸速率*]+8植物生理学通讯$%%*#$
#($"#&R#&/2 QH ]@,CKH4E7@,C]@,Q:@FH2;:B?B0KC?:E0@0,CG FE01@F,?BFKF,?E0 @C .@XH@G 0H01EC0@BC IH.?HFEIE.0BD"0,40)5*$6%*50/78BFC2E?D.,:
*]+8;.,C?;:K0@B.BJK-BAAHC@I,?@BC0$%%*#$#($" ############################################## #&R#&/2 国外动态 英国开发出癌症早期诊断新技术 英国诺丁汉大学发布公报说该校研究人员开发出一种癌症检测新技术只要对少量血样进行检测就 可在一周内获知结果( 这一技术适用于肺癌)乳腺癌)卵巢癌)结肠癌)前列腺癌等多种癌症与传统 S线检 测或-f扫描检测相比可提前 ) 年检测出癌症迹象( 这项技术的主要发明人)诺丁汉大学教授约翰!罗伯特森说-这项技术使我们可以用一种全新方式来 观察癌症即检测发生变化的蛋白质和人体免疫系统的反应它们就是肿瘤形成前身体发出的信号(.这是 因为发生癌变的细胞会释放一些被称为抗原的蛋白质这些蛋白质又会引发人体免疫系统释放相应抗体 通过检测血液中这些物质的含量就可提早抓住癌变的蛛丝马迹( 新型生物材料能逼真模仿肌肉弹性 加拿大不列颠哥伦比亚大学的研究人员应用人工蛋白质来模仿肌联蛋白#?@?@C$的分子结构成功研制
出一种新型固态生物材料可以非常逼真地模拟肌肉的弹性性质( 相关文章发表在 $%&% 年 ) 月 * 日出版的 /自然0杂志上( #文伟河$
&*"第 # 期 于海峰等"均匀设计法优化发菜细胞悬浮培养条件