全 文 ：第 ! 卷第 # 期
$%&% 年 月
生"物"加"工"过"程
-:@CE0E]BHFC,.BDY@B1FBIE00TCJ@CEEF@CJ
bB.2! +B2#
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GB@"&%2(/*/6_2@00C2&*$ =(*!2$%&%2%#2%%(
收稿日期"$%&% =%( =$)
基金项目"国家自然科学基金资助项目#(%%%(#$
作者简介"程永刚#&/!%&$男重庆人硕士工程师研究方向"生物化工%王世明#联系人$副教授TRA,@."Z,CJ0:@A@CJc?0@CJ:H,2BFJ2IC
假丝酵母产生物表面活性剂的研究
程永刚&$王世明&周"玲$徐"波$郭"伟$
#&2南京理工大学 化工学院 生物工程系南京 $&%%/#% $2太极集团西南药业股份有限公司重庆 #%%%(!$
摘"要"从扬子石化的废水淤泥中筛选到 & 株假丝酵母#1$&22$$其发酵上清液有较强的表面活性可将水的表
面张力从 $d( A+6A降到 ($d) A+6A( 发酵上清液经酸化)丙酮沉淀后得到浅黄色固体经 fV-)Ma)O- Q` 分
析表明"此种物质为脂肽类物质疏水基部分为十六碳酸和 / 十八烯酸亲水基部分含有多种氨基酸( 其临界胶
束质量浓度为 &)% AJ6V可耐受 &$% e高温和饱和浓度盐离子#质量分数为 (*i的+,l$14适应范围广#14$ k
&$$是一种极具应用前景的生物表面活性剂(
关键词"假丝酵母%生物表面活性剂%脂肽
中图分类号"7/(/d/""""文献标志码"5""""文章编号"&*$ =(*!#$%&%$%# =%%&$ =%)
W42I3:F.2/27J.213475:F5/F742G954577./JA 704G0/F5F.2/L.F--(./( #VB
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L,CJ9@;E?FB.EHA-B22f:E1FBGHIEG 0HFD,I?,C?GEIFE,0EG ?:E0HFD,IE?EC0@BC BDZ,?EFDFBA$d( A+6A
?B($d) A+6A2f:E8@B0HFD,I?,C?Z,0,?K1EBD.@1B1E?@GE?E0?EG 8KfV- Ma,CG O-R`Q Z:@I: IBC0@0R
?EG BD:KGFB1:B8@I1,F?0BD:E^,GEI,CB@I,CG /R\,IIEC@I,I@G0 ,CG ,:KGFB1:@.@I1,F?BD\,F@BH0,A@CB
,I@G02M?0IF@?@I,.A@IE.EIBCIEC?F,?@BC Z,0&)% AJ6V2M?0:BZEG 0?,8@.@?K@C 14$ ?B&$ ?B.EF,CIE@C
:@J: IBCIEC?F,?@BC BD+,-.#(*i$ ,CG IBH.G 0?,CG ?:E?EA1EF,?HFEBD&$% e2
K0A L24I1"1$&22$% 8@B0HFD,I?,C?% .@1B1E1?@GE
""生物表面活性剂是由细菌)酵母和真菌等多种微
生物产生的脂类物质它包括糖脂)脂肽6脂蛋白)脂
多糖)磷脂和取代脂肪酸等*& =$+ ( 通过微生物方法引
进了化学方法难以合成的新化学基团使生物表面活
性剂表面性能十分优越另外它还具有无毒)生物可
降解)专一和生产简便等其他化学表面活性剂无法相
比的优点因而广泛适用于石油开采)环保)医药及化
妆品等工业领域( 尤其利用微生物生产生物表面活
性剂进行 (次采油是目前研究者关注的焦点( 近年
来美)日)德等国已经有厂家利用微生物法大规模生
产生物表面活性剂但技术还不成熟*( =#+ 而我国目
前对于生物表面活性剂的研究尚处在起步阶段具有
很大的发展前景( 其中脂肽类生物表面活性剂系由
脂肪链和肽链构成具有独特的表面理化性质国内
外均有一定的报道*& =&#+ ( 南京理工大学生物工程实
验室报道了由 &株假丝酵母1$&22$ T $ 产生的生
物表面活性剂对其结构进行了初步分析确定其为
脂肽类生物表面活性剂并对其理化性质进行了初步
研究证明该假丝酵母为一种极具应用前景的生物表
面活性剂(
D?材料与方法
D D^?菌株来源
""假丝酵母1$&22$ T $分离于扬子石化废水
淤泥中(
D B^?培养基和培养条件
""发酵培养基 #J$"N4
$
;>
#
%d!+,-.%d&
+4
#
+>
(
%d%)酵母膏 %d%)蔗糖 %d%$尿素 %d&$
配制成 &%% AV的水溶液( 液体石蜡#体积分数$
&$i( 14d%)&$& e灭菌(% A@C其中液体石蜡和
尿素分开灭菌接种时加入(
"" 培养条件" 旋转式摇床摇瓶培养 转速
$%% F6A@C培养温度 (% e发酵周期 ) G(
D M^?主要仪器设备
""红外光谱仪# Y` &)#UfMa$加拿大YBAEA公
司%气相色谱仪 #O- &#Y$日本岛津公司%
O- Q`#Q,?HFC $%%%$美国 b,F@,C 公司%界面张力
仪#PV $$山东淄博同业仪器厂(
D @^?实验方法
&d#d&"生物表面活性剂物质的提取
""将发酵液 14调为 /d%&% %%% F6A@C 离心
&) A@C去除菌体用滤纸吸除上层的液体石蜡并
过滤残留物得黄绿色澄清液体( 调 14小于 $d%
有白色物质析出加入约 &6) 体积的丙酮白色物
质凝结为絮状沉淀离心收集沉淀用乙醚和 14
为 $d% 的 4-.水溶液分别洗涤 ( 次于 #% e以下
真空干燥得生物表面活性剂粗纯品fV-图谱为
单一斑点(
&d#d$"表面张力的测定
""界面张力仪于 $% e下测定*(+ (
&d#d("生物表面活性剂含量的测定
""标准曲线法"取去除菌体和液体石蜡的发酵液
&%% AV调 14小于 $d%析出产物在 )!% CA处测
出其光密度值@A
)!%
采用丙酮法提取产物#% e以
下真空干燥称质量得到@A
)!%
对应下产物浓度值(
取具有不同 @A
)!%
的发酵液得出各自 @A
)!%
对应的
产物质量浓度作图即可得到@A
)!%
和产物质量浓度
之间的关系曲线(
D P^?表面活性剂的理化性质分析测定
&d)d&"表面活性剂的临界胶束浓度#-` -$
""取表面活性剂粗纯品溶于 14为 /d% 的 +,>4
溶液中用 14为 /d% 的 +,>4梯度稀释测定不同
浓度下溶液表面张力(
&d)d$"14对表面活性剂稳定性的影响
""取表面活性剂纯品用 14为 /d% 的+,>4溶液
溶解后调不同 14处理 &d) :后测其表面张力(
&d)d("温度对表面活性剂稳定性的影响
""取表面活性剂纯品溶于碱性水溶液调 14为
d%在不同温度下处理 &d) : 后冷至室温测定其
表面张力(
&d)d#"+,-.浓度对表面活性剂稳定性的影响
""取表面活性剂纯品溶于碱性水溶液调 14为
d%加入不同浓度+,-.处理 &d) :后测定其表面
张力(
D Q^?表面活性剂的结构分析
&d*d&"红外分析#Ma$
""产物用NYF压片红外光谱仪测得红外光谱图(
&d*d$"薄板层析#fV-$
""取产物酸性混悬液用 G#氯仿$pG#甲醇$ m
$p&的溶剂萃取将萃取液减压挥发浓缩做硅胶板
层析展层剂组成为G#氯仿$pG#甲醇$pG#乙酸$ m
*)p$)p&显色剂为 /) AV含体积分数为 %d$i茚三
酮的正丁醇和 )i的冰醋酸混合液( 展层结束后
待板上溶剂完全挥发喷上显色液放入 &%% e的烘
箱&% A@C后观察硅胶板上的斑点(
&d*d("表面活性剂双重结构分析
""取薄板层析时硅胶板上产物斑点处的硅胶用
$% AV甲醇溶出产物置于 $) AV具塞比色管中通
入由+,-.与浓 4
$
Q>
#
反应生成的 4-.气体直至饱
和将试管密封置 /% e水浴锅内保温 &) :( 反应完
毕后减压蒸馏去除溶剂残留物用石油醚萃取取醚
相用双蒸水洗 (次再用无水+,
$
Q>
#
干燥最后通过
减压蒸馏去除乙醚得浅黄色油状物质( 气相色谱
质谱联用#O- Q`$分析得到表面活性剂的部分疏
水基结构( 亲水基部分的分析采用&% AB.6V4-.水
解产物薄板层析后用茚三酮显色(
B?结果与讨论
B D^?产量与吸光度之间的关系
""图 & 为表面活性剂产量与吸光度之间的关系曲
线( 由图 & 可知"产物在酸性条件下析出后的吸光
度值和对应的产量成正比关系其线性关系为 =m
%d*/* )H=%d%(# 其中=为产物质量浓度H为吸
光度值>$ m%d//# )(
(&"第 # 期 程永刚等"假丝酵母产生物表面活性剂的研究
图 D?吸光度与产物产量的关系曲线
N.;=D?,34Z02701F2 23F93F
B B^?表面活性剂的理化性质
$d$d&"表面活性剂的临界胶束浓度#-` -$
""图 $ 为表面活性剂质量浓度对表面活性剂的临
界胶束浓度的影响( 由图 $ 可知"当表面活性剂的
质量浓度由 & $%% AJ6V降到 &)% AJ6V时溶液的
表面张力几乎无变化但当表面活性剂的质量浓度
继续下降时溶液的表面张力急速上升此表面活
性剂的临界胶束质量浓度即为 &)% AJ6V(
图 B?表面活性剂的,_,值
N.;=B?,_,27F-0J.213475:F5/F
$d$d$"14对表面活性剂稳定性的影响
""图 ( 为 14对表面活性剂稳定性的影响( 从图
( 可以看出"14对产物的稳定性影响较小在 $d% k
d% 的范围内溶液表面张力几乎没有变化%在 14
为 !d% k&$d% 范围内仅有小幅上升( 说明产物在
14为 $d% k&$d% 范围内都适用尤其在酸性条件下
十分稳定和同类产物相比**+ 具有明显的优势(
$d$d("温度对表面活性剂稳定性的影响
""图 # 为温度对表面活性剂稳定性的影响( 从图
# 可以看出"该生物表面活性剂在 $% k&$% e下处
理 &d) : 后其表面张力几乎没有变化( 表明它对
温度具有极强的耐受力和在极端环境下应用的
潜力(
图 M?9"对表面活性剂稳定性的影响
N.;=M?#70:F1279"2/F-0J.213475F5/F
图 @?温度对表面活性剂稳定性的影响
N.;=@?#70:F127F0G9045F3402/F-0J.213475:F5/F
$d$d#"+,-.质量分数对表面活性剂稳定性的影响
""图 ) 为+,-.质量分数对表面活性剂稳定性的
影响( 从图 ) 可以看出"该生物表面活性剂对盐的
耐受力相当突出在 +,-.质量分数从 % 增至 (*i
#$% e时+,-.饱和质量分数$过程中表面张力值
仅有q$ A+6A的变化可见 +,-.溶液质量分数对
产物的稳定性几乎没有影响(
图 P?$5,6质量分数对表面活性剂稳定性的影响
N.;=P?#70:F127G51145F.2 27$5,62/F-0J.213475:F5/F
""综合以上结果还可知"此表面活性剂 14适应范围
为 $d% k&$d%能耐受 &$% e高温和饱和+,-.盐而国
内外报道稳定性较突出的同类生物表面活性剂虽然
#& 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"
在温度耐受能力上都较好但对 14和盐离子的耐受力
和本文表面活性剂相比均有一定差距( 如翟丽丽
等*+利用实验室分离选育的菌株产生的脂肽类生物表
面活性剂能耐受 &$& e高温14的适应范围为 $d% k
&$d%但盐离子+,l耐受质量分数只有 &*i(
B M^?表面活性剂的结构分析
$d(d&"红外分析
""产物的红外光谱如图 * 所示( 由图 * 可知"
( #$#d&* IA
=&是由分子间氢键引起的&+4&伸缩振
动%& *)#d$ IA=&处为酰胺
#
谱带%& )##d$! IA=&为酰
胺
!
谱带说明此物质含有肽键( 另外$ /$*d(! k
$ !)#d/! IA
=&的吸收带为脂肪族甲基和亚甲基
#-4
(
l-4
$
$ -&4伸 缩 振 动 所 引 起 & #% k
& (% IA
=&的吸收带为脂肪族甲基和亚甲基#-4
(
l
-4
$
$的-&4变形振动所引起而& (%d%! IA=&为酯
羰基谱带由此说明此种物质可能为脂肽类物质(
图 Q?产物红外光谱图
N.;=Q?)/74540I190:F45 27F-0J.213475:F5/F
$d(d$"薄板层析分析
""为了进一步确定这种物质是否为脂肽类物质
根据肽在弱酸性条件下与茚三酮反应会生成有色
物质对其进行fV-分析(
""从图 可以看出"在>5值为 %d** 处出现了紫色
斑点( 由此可知其含有肽链结合其表面活性特点和
Ma图谱#图 *$可进一步推断产物为脂肽类物质(
$d(d("双重结构分析
""若产物为脂肽类物质其分子中必然含有脂肪
部分和肽链部分( 通过对其进行双重结构分析得
知表面活性剂疏水基部分为十六碳酸和 / 十八烯
酸( 亲水基部分经薄板层析后出现明显的紫色斑
点#图 !$( 说明水解产物中含有氨基酸( 通过以上
( 种分析由此可以确定此种表面活性剂为脂肽类
物质(
图 R?试样薄板层析
N.;=R?ES,27F-0J.213475:F5/F
图 >?产物水解液中氨基酸硅胶板层析
N.;=>?ES,27F-05G./2 5:.I./-AI426AH01263F.2/27
F-0J.213475:F5/F
M?结?论
""通过对此株假丝酵母 1$&22$ T $ 所产生的
生物表面活性剂进行的初步研究得知其产物为脂
肽类物质亲水基部分为肽链疏水基部分为十六
碳酸和 / 十八烯酸-` -值为 &)% AJ6V14适应
范围为 $d% k&$d%能耐受 &$% e高温和饱和+,-.
化学性质和热稳定性相当突出( 这使它完全可以
应用于石油)环保)医药等多种极端环境是一种极
具应用潜力的表面活性剂(
参考文献"
*&+"张蒂根2生物表面活性剂的研究进展*]+2江西科学&//$&%
##$"$)&R$)!2
P:,CJ3@JEC2;FBJFE00BD8@B0HFD,I?,C?0FE0E,FI:*]+2]@,CJ^@QI@R
ECIE&//$&%##$"$)&R$)!2
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)&"第 # 期 程永刚等"假丝酵母产生物表面活性剂的研究
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**+"张翠竹梁凤来张心平等2一种脂肽类生物表面活性剂的理
化性质及对原油的作用*]+2油田化学$%%%&#$$"&$R&*2
P:,CJ-H@9:HV@,CJUECJ.,@P:,CJS@C1@CJE?,.2;:K0@IBRI:EA@I,.
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8@B0HFD,I?,C?*]+2>@.U@E.G -:EA@0?FK$%%%&#$$"&$R&*2
*+"翟丽丽侯红漫靳艳等2#,%+2070&$,3$*%/0&Q*S产脂肽生
物表面活性剂的分离纯化及特性研究*]+2食品与发酵工业
$%%((#($" #!R)$2
P:,@V@.@4BH 4BCJA,C]@C L,CE?,.2;HF@D@I,?@BC ,CG I:,F,I?EFR
@0?@I0BD.@1B1E1?@GE1FBGHIEG 8K#,%+2070&$,3$*%/0&Q*S*]+2
UBBG ,CG UEFAEC?,?@BC MCGH0?F@E0$%%((#($"#!R)$2
*!+"V@H S@,CJK,CJL,CJQ:@9:BCJ H` YB9:BCJE?,.2M0B.,?@BC ,CG
I:,F,I?EF@9,?@BC BD,-&$R.@1B1E1?@GE1FBGHIEG 8K<$)*+,,+(4*,
4Q>&$&*]+2]BHFC,.BD;E1?@GEQI@ECIE$%%!&#"!*#R!)2
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解正构烷烃的研究*]+2南京大学学报"自然科学版&//!(#
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*&(+ LBH00ED4+3HCI,C NT+,J.E3;E?,.2-BA1,F@0BC BDAE?:R
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*]+2]` @IFB8@B.` E?:BG0$%%#)*#($"((/R(#2
*&#+ LBH00ED+43HCI,C NT I`MCEFCEK`]2MA1BF?,CIEBD?:E(R
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?@\@?K*]+2511.TC\@FBC @`IFB8@B.$%%)&"
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国内简讯
环保木塑复合材料大规模推广应用
木塑复合材料是一种新型的健康环保材料以塑料和木质纤维素#包括木粉)秸秆等$为原料通过技术
处理制成类木材类产品( 由中国科学院青岛生物能源与过程研究所和中国科学院广州化学有限公司合作
开发的木塑复合材料获得了突破性进展并开始产业化推广并且在与安徽铜陵新遐胶辊有限公司联合成
立了-铜陵中科新生物材料有限公司.后共同投资研究)开发并大规模生产)销售了环保木塑复合材料及其
制品(
诺维信将与中石化及中粮集团联合在华兴建纤维素乙醇示范工厂
制剂生产商诺维信公司#+B\B9KAE056Q$表示将与中国石油化工股份有限公司#-:@C,;E?FB.EHAr
-:EA@I,.-B2 简称中国石化$和中粮集团有限公司#->U->V?G2$ 于 $%&& 年第三季度开始共同兴建中国最
大的纤维素乙醇示范工厂建成后每年将生产近 & 万 ?的纤维素乙醇(
诺维信称中国生物质资源丰富农业生产中的废弃物每年就超过了 亿?(
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*& 生"物"加"工"过"程"" 第 ! 卷"