为了研究国内制备的玉米赤霉醇单克隆抗体,与其同系物玉米赤霉烯酮交叉反应严重,实际检测存在假阳性的问题,本试验开展了玉米赤霉醇特异性识别单克隆抗体及其胶体金检测试纸的研制工作。试验采用玉米赤霉醇-16-羧丙基醚与牛血清白蛋白偶联,免疫雌性Balb/c系小鼠;利用单克隆抗体技术完成杂交瘤融合,并用非竞争及竞争ELISA法,对阳性克隆进行鉴定。杂交瘤诱生腹水后,经亲和纯化,用于15 nm胶体金标记,制作玉米赤霉醇胶体金检测试纸。融合细胞经筛选,最终对3株杂交瘤细胞建株,结果均为IgG1型。其中Mab-1A8诱生腹水效价高达1:1.28×107,对玉米赤霉醇抑制中浓度(I50)为10.25 ng·mL-1,检测灵敏度(I10)为1.96 ng·mL-1,线性检测范围在2.96~35.46 ng·mL-1,对同系物玉米赤霉烯酮的交叉反应率小于0.1%。试验研制的玉米赤霉醇胶体金试纸,检测阈值为2.5 μg·mL-1,检测时间为10 min。本研究制备了一种新型玉米赤霉醇特异性单克隆抗体,并研制了以单抗为基础的玉米赤霉醇胶体金快速检测试纸,为玉米赤霉醇残留快速检测提供了灵敏、便捷的新方法。
全 文 ：!核 农 学 报!"#$%!"&"# $$$#$ ($$#+
!"#$%&"()#*+&$,-$.*#/#$&0*.+%*+1
收稿日期!"#$)*#*",!!接受日期!"#$%*#$*"%
基金项目!国家自然科学基金",$"#$%,%# !江苏省社会发展项目"-0"#$"+%## !江苏省农业自主创新基金 Kc"$"#%#)")&)A 项目""#$$ BR%$,# !
江苏省自然科学基金"-i"#$,#+#$#
作者简介!刘媛!女!副研究员!主要从事农产品安全免疫分析技术研究% 01234$dX?2874;$,>:71
通讯作者!刘贤金!男!研究员!主要从事农药毒理及毒副作用监控技术研究% 01234$522@43=;522@>2:>:8
文章编号!$###*A%%$""#$%##*$$#$*#+
玉米赤霉醇特异性单克隆抗体及其胶体金
检测试纸的研制
刘!媛!文孟棠!张!霄!徐重新!杨晶祎!张留娟!王!恒!何!鑫
梁!颖!郑!勤!夏兴霞!刘贤金
"江苏省食品质量安全重点实验室H农业部食用农产品安全监控重点开放实验室!江苏 南京!"$##$)#
摘!要!为了研究国内制备的玉米赤霉醇单克隆抗体!与其同系物玉米赤霉烯酮交叉反应严重!实际检测
存在假阳性的问题!本试验开展了玉米赤霉醇特异性识别单克隆抗体及其胶体金检测试纸的研制工作#
试验采用玉米赤霉醇 B$ B羧丙基醚与牛血清白蛋白偶联!免疫雌性 -24]H:系小鼠$利用单克隆抗体
技术完成杂交瘤融合!并用非竞争及竞争 0` FI.法!对阳性克隆进行鉴定# 杂交瘤诱生腹水后!经亲和
纯化!用于 $% 81胶体金标记!制作玉米赤霉醇胶体金检测试纸# 融合细胞经筛选!最终对 , 株杂交瘤
细胞建株!结果均为 F9R$ 型# 其中 Z2] B$.A 诱生腹水效价高达 $l$G"A C$#
+!对玉米赤霉醇抑制中浓
度F%#(为 $#G"% 89&1`
B$!检测灵敏度F$#(为 $G& 89&1`
B$!线性检测范围在 "G& (,%G) 89&1` B$!
对同系物玉米赤霉烯酮的交叉反应率小于 #G$Q# 试验研制的玉米赤霉醇胶体金试纸!检测阈值为 "G%
"9&1` B$!检测时间为 $# 138# 本研究制备了一种新型玉米赤霉醇特异性单克隆抗体!并研制了以单抗
为基础的玉米赤霉醇胶体金快速检测试纸!为玉米赤霉醇残留快速检测提供了灵敏"便捷的新方法#
关键词!玉米赤霉醇$单克隆抗体$玉米赤霉醇 B$ B羧丙基醚$玉米赤霉烯酮$胶体金检测试纸
/EF$$#G$$A&H5>3@@8>$##*A%%$G"#$%G#>$$#$
!!玉米赤霉醇 "dX?2874!e0L#!在我国的商品名为
-畜大壮.!是一种有效的激素类动物生长促进剂!上
世纪 A# 年代在我国被广泛推广 $( % 作为外源性激素!
低浓度的玉米赤霉醇可促进牛)羊蛋白质合成!但对人
体生殖系统发育和血液中甲状腺素水平的变化有影
响 $( !也有研究显示玉米赤霉醇会刺激人类乳腺肿瘤
细胞的体外生长与分裂 "( % 在家畜饲养中使用该生
长促进剂!可在动物肝)肾等组织中积蓄或随尿液代谢
排出!其药物残留也可随环境)食物链等影响人类的健
康水平% "##" 年我国农业部第 ",% 号公告明确规定
e0L禁用于所有食品动物!所有可食动物组织及尿液
不得检出 ,( % 但由于玉米赤霉醇增重剂效果好!经济
回报高!仍有违法使用的现象% "#$# 年卫生部将玉米
赤霉醇列为食品中可能违法添加的非食用物质名
单 )( %
目前玉米赤霉醇的残留检测方法!主要是以液相
色谱)气相色谱及其质谱联用为代表的大型仪器分析
方法 % B+( % 色谱法灵敏度高!可准确定性)定量!但通
常需要复杂的前处理步骤且检测成本高!并不适合大
量样本的快速筛查检测!而免疫分析方法则可以弥补
这一不足 A B$#( % 抗体作为免疫分析的关键试剂!目前
已有 , 家实验室报道了玉米赤霉醇单克隆抗体的制
备 $$ B$,( % $&A) 年 K2TX?等 $$(率先采用 e0LB+ B半
琥珀酸酯与牛血清白蛋白"-I.#偶联以及 e0LB$ B
羧丙基醚与人血清白蛋白偶联用于制备 e0L单克隆
抗体% 在国内!王鹤佳等 $"(和魏万贵等 $,(分别采用
e0LB+ B半琥珀酸酯!以及在 e0L羰基功能团引入
羧基后与 -I.偶联作为免疫原制备单克隆抗体% 目
前国内报道的 " 种玉米赤霉醇单克隆抗体!由于其
半抗原设计没有充分暴露其结构特征!对镰刀菌属
$#$$
核!农!学!报 "& 卷
产生的常见谷物真菌毒素玉米赤霉烯酮存在较高的
交叉反应率% 若采用此种单抗用于检测!当检测结
果呈阳性时难以判断其是由动物饲养过程中埋植了
玉米赤霉醇所致或是由动物饲料受到玉米赤霉烯酮
污染所引起%
本研究采用玉米赤霉醇 B$ B羧丙基醚与常见载
体蛋白 -I.偶联作为免疫原!制备的新型玉米赤霉醇
单克隆抗体!对玉米赤霉烯酮不具交叉识别% 本研究
首次报道了基于单克隆抗体的玉米赤霉醇胶体金检测
试纸的研制!为玉米赤霉醇残留快速检测提供了灵敏)
便捷的新方法%
图 !"玉米赤霉醇"6#$玉米赤霉烯酮")#$玉米赤霉醇 ]!> ]羧丙基醚"I#结构式
/*01!"D.5GI.G54-;Z4569-,"6#& Z4656,49-94")# 698Z4569-,]!> ]I65)-W7 +5-+7,4.M45"I#
!"材料与方法
!#!"材料
半抗原 e0LB$ B羧丙基醚)免疫原"e0L*-I.#
和包被原"e0L*Em.#由江苏省农业科学院食品质量
安全与检测研究所合成 $)( % IS"H# 细胞株由江苏省农
科院兽医所夏兴霞老师惠赠% A 周龄雌性 -.` -H:系
小鼠购自扬州大学比较医学研究中心% 玉米赤霉醇
"含量% &+Q#购自桂林集琦生化有限公司% LJZF
$)# 培养液 "货号$$$A+% #来自美国 3`[XUX:687479<
公司!胎牛血清来自浙江天杭生物科技有限公司%
%#Q J0R溶液"分子量 $ )%##)A B氮杂鸟嘌呤)Y.U
和 YU添加组分)弗氏完全和不完全佐剂)鼠单抗亚型
鉴定试剂盒)玉米赤霉烯酮)#B玉米赤霉烯醇)$B玉
米赤霉烯醇)$B玉米赤霉醇和玉米赤霉酮标准品均
购自美国 I3912公司"图 $#% YLJ标记的羊抗鼠 F9R
由美国 iJ` 公司提供% Y3U?2S J?7TX38 RYJ柱购自美
国 R0YX24T6:2?X公司% 其它试剂为国产分析纯%
IZ,$ B"% JmK板)试纸条卡盒 "#11C+#11购自上
海金标公司!玻璃纤维膜 A11C$##1)吸水纸 $+11C
$##1)硝酸纤维素膜 "G%:1C$##1购自美国 Z343S7?X
公司% !!!
!#$"动物免疫与鼠多抗血清的监测
免疫对象为 , 只 A 周龄雌性 -.` -H:系小鼠% 每
只小鼠首免采用 "## "` 等体积弗氏完全佐剂与免疫
原的乳化物 "含有 %#"9e0L*-I.#!进行腹腔注射%
加强免疫将佐剂更换为弗氏不完全佐剂% 免疫间隔时
间为 $%P% 每次加强免疫后 +P!小鼠断尾取血!采用间
接非竞争及竞争 0` FI.对抗血清的效价及灵敏度变
化进行监测 $)( %
!#%"细胞融合
小鼠拉颈处死后!无菌操作取脾脏!置于 "## 目铜
网上研磨!用 $# 1` 不完全 LJZF$)# 研磨脾脏制备
脾细胞悬液!血球计数板计数得到 )G% C$#A 个脾细
胞% 用 "# 1` 不完全 LJZF$)# 培养基!重悬处于对
数生长期的 IS"H# 细胞!计数后吸取 )G% C$#+ 个 IS"H
# 细胞与脾细胞悬液混合!室温 $ #&" ?*138 B$离心
$# 138!弃净上清% 在 )#O水浴中!旋转含有混合细胞
的离心管!于 )% @内均匀加入 $1` %#Q J0R溶液!水
浴静置 #@% 然后在 &#@内加完 $% 1` 不完全 LJZF
$)#!终止融合反应!,+O静置 $# 138 后同样条件离
心!并用 "# 1` Y.U培养基重悬沉淀!$## "` 每孔加
入 " 块预先铺有饲养细胞的 & 孔细胞培养板%
!#<"杂交瘤细胞的鉴定
融合 $#P 后!对培养上清采用非竞争 0` FI.法进
行鉴定% 产出的阳性克隆!再采用竞争 0` FI.法鉴
定% 选择抑制率最高孔!进行 " (, 次亚克隆!完成杂
交瘤细胞建株% 非竞争)竞争 0` FI.以及交叉反应率
的测定方法按照参考文献$)(%
!#= 单抗亚型鉴定与腹水纯化
建株后的杂交瘤细胞分泌抗体!采用鼠单抗亚型
试剂盒进行鉴定% 采用体外诱生腹水法!大量制备单
克隆抗体!每只小鼠注射 $ C$# 个 Z2] B$.A 细胞!
AP 后采集腹水% 腹水用 Y3U?2S J?7TX38 RYJ柱亲和
纯化!按照参考文献 $%(!用 I/I*J.R0法鉴定抗体
纯度%
"#$$
! 期 玉米赤霉醇特异性单克隆抗体及其胶体金检测试纸的研制
!#>"玉米赤霉醇胶体金检测试纸的初步研制
采用柠檬酸三钠法制备 $% 81的胶体金!用于标
记亲和纯化的 Z2] B$.A 单抗% 优化后的胶体金标记
SY值为 AG%!抗体最小标记量为 )% "9*1` B$% 采用
-37P7TecB$#$# 胶体金点样系统在硝酸纤维素膜上
划线! 检 测 线 "U线 # 用 $ 19*1` B$ e0L*Em.!
$ "`*:1B$划线!质控线 "K线#采用 #G% 19*1` B$羊
抗鼠 F9R!$ "`*:1B$划线% 硝酸纤维素膜干燥后!浸
入 $Q -I.,+O封闭 ,# 138% 用含有 #G#%Q U\XX8
"# 的 J-IU洗涤 , 次!每次 $#@!,+O干燥!用于组装胶
体金试纸%
!#?"玉米赤霉醇胶体金检测试纸阳性结果判断标准
与检测阈值确定
将 $## "` 玉米赤霉标准品"$#Q甲醇 BJ-I 溶液
稀释#加入胶体金试纸的加样孔!室温下平放)静置 $#
138!观察 U线和 K线的显色结果% 胶体金检测试纸
的结果判断标准为$$#仅有 K线 $ 条红线!检测结果
超过阈值!呈阳性% "#U线)K线 " 条红线!检测结果
未超过阈值!呈阴性% , #仅有 U线!检测结果无效%
)#K线)U线均无!检测结果无效"图 B.#%
试纸检测阈值的确定$以完全抑制 U线的最低玉
米赤霉醇浓度!作为胶体金试纸的检测阈值%
$"结果与分析
$#!"鼠多抗血清监测结果
, 只-.` -H:小鼠经过 % 次免疫后!均取得了较好
的免疫应答效果"图 ")图 ,#% 经 0` FI.检测!小鼠抗
血清效价在 $$G) C$#) ($G"A C$#% 之间!其中 $ 号
鼠具有最高的抗血清效价及最低的 F%#值!玉米赤霉醇
对 $ 号鼠抗血清抑制中浓度"F%# #为 +A&G#, 89*1`
B$!
检测灵敏度"F$# #为 +)G$A 89*1`
B$!线性范围 "F"# (
FA##为 $,,G&+ () )G&& 89*1`
B$% 该小鼠脾脏可被
用于下一步的细胞融合%
$#$"杂交瘤筛选
细胞融合后第 $# 天!观察 " 块融合母板!共计
$A 孔可以观察到细胞集落形成!先采用间接非竞争
0` FI.法对细胞培养上清进行检测!以大于无杂交瘤
生长孔吸光值 , 倍作为阳性孔判断标准!检出阳性克
隆 ", 个!阳性率为 $"G)Q% 再对阳性孔采用竞争
0` FI.检测!$# "9*1` B$的玉米赤霉醇存在下!对培养
上清抑制率大于 %#Q的阳性孔有 $, 个!抑制率在 %Q
(%#Q的阳性孔 % 个!抑制作用小于 %Q孔 % 个% 选
择吸光值较高且抑制效果最佳的 , 个阳性克隆!采用
图 $"鼠抗血清效价测定
/*01$"@4.45A*96.*-9-;.*.45:-;A-G:469.*:45GA
图 %"鼠抗血清灵敏度测定
/*01%"@4.45A*96.*-9-;:49:*.*3*.7 -;A-G:469.*:45GA
有限稀释法进行 " (, 次亚克隆!最终建株 , 个稳定分
泌玉米赤霉醇单抗的杂交瘤细胞!分别命名为 Z2] B
$.A!Z2] B$KA!Z2] B$K$#%
$#%"单抗亚型鉴定$腹水的亲和纯化及特性分析
, 个建株的杂交瘤细胞株!分泌抗体经鉴定均为
F9R$ 型% 图 ) 显示了 Z2] B$.A 腹水亲和纯化后
I/I*J.R0鉴定结果!纯化抗体仅在 %# i/和 ,# i/
附近有清晰 " 条带!分别对应了抗体的重链和轻链!表
明杂蛋白基本去除%
经非竞争 0` FI.测定!Z2] B$.A 腹水效价高达
$l$G"A C$#+!腹水工作浓度为 $l, C$#% 亲和纯化抗
体效价为 $l$G"A C$#!较纯化前降低 $# 倍!但灵敏度
,#$$
核!农!学!报 "& 卷
略有提高% 图 % 显示了间接竞争 0` FI.法建立的玉
米赤霉醇标准抑制曲线!玉米赤霉醇对纯化的 Z2] B
$.A 抑制中浓度"F%# #为 $#G"% 89*1`
B$!检测灵敏度
"F$# # 为 $G& 89*1`
B$!线性范围在 "G& (,%G)
89*1` B$%
表 !"抗体的交叉反应率
L6),4!"N5-::546I.*3*.7 -;69.*)-8*4:
$#<"交叉反应率
试验测定了 Z2] B$.A 对玉米赤霉醇的 % 种结构
类似物的交叉反应率% 结果表明 Z2] B$.A 除了对
#B玉米赤霉烯醇有 $,Q的交叉反应率外!包括玉米
赤霉烯酮在内的其余 ) 种结构类似物交叉反应率均小
于 #G$Q"表 $#%
$#="胶体金检测试纸检测阈值测试
由图 B-可知!# 浓度样本由于没有游离的玉米
赤霉醇与包被于检测线的固相抗原 e0L*Em.竞争!
金标单抗在 U线与 e0L*Em.结合!形成肉眼可见的
红线% 过量的金标抗体继续迁移!在 K线与羊抗鼠
F9R结合也出现红线% "G% "9*1` B$的玉米赤霉醇是
可以完全抑制 U线的最低浓度!该浓度设定为试纸的
检测阈值%
%"讨论
%#!"半抗原选择与交叉反应率
分子量小于 $ ###/的化合物属于半抗原!需要与
载体蛋白偶联后制备抗体% 抗原偶联位点选择通常要
考虑两点!一是能够充分保留和暴露其结构特征!二是
具有免疫原性 $ B$&( % 玉米赤霉醇的同系物玉米赤霉烯
酮!由镰刀菌属分泌产生!是常见的谷物真菌毒素% 该
物质与玉米赤霉醇结构差别仅在于 K+ 号位酮基与羟基
的区别!以及 K$$ BK$"间的单双键不同% K2?TX?等
$$(
)#$$
核!农!学!报 "& 卷
%#$"单克隆抗体的筛选与性能分析
在半抗原特异性抗体制备中!由于需要将半抗原
与载体蛋白连接用于动物免疫!动物机体在免疫过程
中产生了大量针对载体蛋白的抗体% 为了避免蛋白抗
体的干扰!通常在建立检测方法时!合成的包被抗原会
换载体蛋白"本文免疫原采用 -I.!而包被抗原采用
Em.#% 在筛选到的 ", 个阳性孔中!有 % 个阳性孔对
e0L*Em.虽具有结合作用!但并不识别玉米赤霉醇%
通过进一步的研究表明!这些抗体不识别 -I.或
Em.!而对 e0L*-I.!e0L*Em.整体复合物具有识别
作用"数据未列出#% 这可能是由于这些抗体识别-半
抗原 B载体蛋白.整体复合物形成的特征表位!或-半
抗原 B载体蛋白.间手臂结构造成!因此通过更换载
体蛋白 -I.为 Em.的方法!不能完全去除半抗原非
特异性识别抗体!这也是鼠多克隆抗体灵敏度比单克
隆抗体大大减低的原因%
%#%"胶体金检测试纸
胶体金检测试纸具有便携)快速)无需仪器分析的
优点% 尤其适用于液体样本的现场快速检测与家庭自
测 "# B"%( % 但是由于其通常采用目测来判断结果!设定
为定性或半定量检测更为合适% 胶体金试纸灵敏度)
准确性和稳定性!也受到金标抗体)包被原)封闭液)硝
酸纤维素膜)玻璃纤维素膜)样品垫等诸多因素的
影响%
<"结论
本试验制备的玉米赤霉醇单克隆抗体!对其重要
同系物玉米赤霉烯酮的交叉反应率低于 #G$Q!特异
性优于国内前期报道的单克隆抗体!且其检测灵敏度
可达 $G& 89*1` B$! 灵敏度接近于国标液相色谱 B质
谱H质谱法 "R-U"$&A" B"##A # 中规定的灵敏度为
#G##$ 19*N9B$ "( % 此外!试验研制的玉米赤霉醇胶
体金检测试纸的检测阈值为 "G%"9*1` B$!检测时间为
$# 138!该试纸无需检测设备和专业化操作!可应用于
动物尿液或水环境样本的现场初筛检测%
参考文献!
$ (! 3`= b! e6289Ke! bfcb! e6289eb! e6289c! 3`= LL! 3`=
cV! R789eZ>/XaX47S1X8T28P Xa24=2T378 7[311=872@@2<[7?
dX?287438 ]7a38X=?38XV(>V7=?8247[e6X53289f83aX?@3T
" (! X`[X?@Y! M2X@]
EX@T?79X83:S7TX8:3X@7[eX?2874! 7X@T?2P374! P3XT6<4@T34]7X@T?74!
-3@S6X874*.28P 9X83@TX38$ 31S43:2T378@[7?X^S7@=?X2@@X@@1X8T7[
S7TX8T324X8P7:?38XP3@?=STX?@V(>Y=128 LXS?7P=:T378! "##$! $
"%# $$#,+ B$#)%
, (!彭涛! 李晓娟! 陈冬东! 代汉慧! 于静! 朱明达! 马微! 唐英章>
高效液相色谱 B串联质谱法同时测定动物肝脏中玉米赤霉醇及
其类似物残留量V(>分析化学! "#$#! ,A")# $)& B)+)
) (!谢继安!刘柏林>超高压液相色谱 B串联质谱法检测猪肉中玉
米赤霉醇类物质V(>食品安全质量检测学报! "#$,! ""$# $$%#
B$%A
% (!_289I! _289cY>.824
K78T21382T378! "##+! ")"# $ %+, B%A"
(!D289c! K6X8 V! R=7/! _289R>/XTX:T378 28P 3PX8T3[3:2T378 7[
dX?287438 :63:NX8 7??2]]3T43aX? ]< 43g=3P :6?712T79?2S6<*
X4X:T?7@S?2
F8TX?82T37824! "##"! A%")# $ A)$ BA)+
+ (!/3:N@78 `K! K7@T238 L! Z:iX8d3X/! DX@@X?.K! Z2:8X34V/>
W=28T3T2T3aX@:?XX83897[@T34]X8X@28P dX?287428P 3T@?X42TXP
?X@3P=X@28P 82T=?24S?X:=?@7?@38 aX2443aX?]<92@:6?712T79?2S6<*
12@@@SX:T?71XT?
A (!K77SX?iZ! U=71742Z! 2`6PX8SX?{I! |`a9?X8 U! 0437TKU!
iX88XP/XaX47S1X8T28P a243P2T378 7[P??X@74aXP [4=7?7311=872@@2<@[7?dX?287428P 24S62*dX2?24X874T72@@3@T
38 P3@T389=3@6389 dX?2874 2]=@X [?71 D=@2?3=1 @SS> T7^38
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及鉴定V(>中国兽医杂志! "##)! )# "$## $, B%
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米赤霉醇单克隆抗体的研制及初步应用V(>细胞与分子免疫
学杂志! "##+! ","$# $A B+$
$)(!刘媛! 刘贤金! 余向阳!张存政!陈育如!龚振明!周全>玉米赤
霉醇人工抗原合成及其多克隆抗体的制备V(>分析科学学报!
"##!"""$# $$ B)
$%(!刘蓉蓉>菌核净的免疫检测技术研究 /(>南京$南京农业大
学!"##)$)% B)
$(!Z7?7d7a2m I! X`a2@67a2. F! 0?X138XI .>/XTX?1382T378 7[
SX@T3:3PX@]
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识别机制中的应用V(>农药学学报!"##+!&",# $"#$ B"#A
$&(!吴建祥!王震成!金仁耀!刘欢! 周崇盈! 张少恩>抗氟喹诺酮类
抗生素单抗的研制及其检测应用 V(>核农学报! "#$,! "+
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