全 文 ：核 农 学 报摇 圆园员源袁圆愿渊缘冤院园苑愿源 耀 园苑愿怨
允燥怎则灶葬造 燥枣 晕怎糟造藻葬则 粤早则蚤糟怎造贼怎则葬造 杂糟蚤藻灶糟藻泽
收稿日期院圆园员源鄄园员鄄员园摇 接受日期院圆园员源鄄园猿鄄员怨
基金项目院国家野怨苑猿冶项目渊圆园员源悦月员猿愿源园猿冤袁国家自然科学基金渊猿员猿园员远猿苑冤袁浙江省自然科学基金渊蕴匝员猿悦员源园园园源冤
作者简介院孙宗涛袁男袁助理研究员袁主要从事植物病毒分子生物学研究遥 耘鄄皂葬蚤造院 扎贼葬燥泽怎灶岳 早皂葬蚤造援 糟燥皂
通讯作者院陈剑平袁研究员袁主要从事植物病毒学研究遥 耘鄄皂葬蚤造院躁责糟澡藻灶圆园园员岳 员圆远援 糟燥皂
文章编号院员园园园鄄愿缘缘员渊圆园员源冤园缘鄄园苑愿源鄄园远
与 砸月杂阅灾外壳蛋白 孕员园互作植物因子的筛选与验证
孙宗涛员 摇 魏摇 佳圆 摇 李俊敏员 摇 王摇 旭员 摇 沈国新圆 摇 陈剑平员
渊员 浙江省农业科学院病毒学与生物技术研究所 辕浙江省植物有害生物防控国家重点
实验室培育基地 辕农业部植物保护与生物技术重点开放实验室 辕浙江省植物病毒
重点开放实验室袁浙江 杭州摇 猿员园园圆造曰圆 浙江省农业科学院蚕桑所袁浙江 杭州摇 猿员园园圆造冤
摘摇 要院目前袁我们对水稻黑条矮缩病毒渊砸月杂阅灾冤编码的外壳蛋白 孕员园 在该病毒侵染过程中的作用了解
甚少遥 本研究利用酵母双杂交技术袁以 孕员园 为诱饵钓取拟南芥 糟阅晕粤文库袁得到与 孕员园 互作的真核翻译
起始因子 藻陨云缘粤 原 圆遥 通过分别构建猎物和诱饵载体共转化酵母袁结果表明 孕员园 与 粤贼藻陨云缘粤 原 圆 在酵母
中互作遥 利用农杆菌转染烟草表皮细胞瞬时表达体系发现袁孕员园 和 粤贼藻陨云缘粤 原 圆 形成融合荧光蛋白后袁
荧光主要形成囊泡状的结构遥 通过荧光共定位实验分析发现袁孕员园 与 粤贼藻陨云缘粤 原 圆 能够共定位遥 本研究
结果进一步揭示了水稻黑条矮缩病毒的致病机制遥
关键词院水稻黑条矮缩病毒曰外壳蛋白曰孕员园曰真核翻译起始因子 缘粤
阅韵陨院员园郾 员员愿远怨 辕 躁援 蚤泽泽灶援 员园园鄄愿缘缘员郾 圆园员源郾 园缘援 园苑愿源
摇 摇 水稻黑条矮缩病毒 渊 则蚤糟藻 遭造葬糟噪鄄泽贼则藻葬噪藻凿 凿憎葬则枣
增蚤则怎泽袁 砸月杂阅灾冤是斐济病毒属的成员之一袁以昆虫灰飞
虱为传播介体侵染植物袁侵染植物寄主后可以引起植
物畸形生长袁主要症状表现为植株矮化尧分蘖增加叶色
深绿以及叶背和茎秆上出现白色瘤状突起等遥 该病毒
在我国长江以南地区主要危害水稻袁引起水稻黑条矮
缩病袁在长江以北地区危害玉米袁引起玉米粗缩
病咱员 原 圆暂 遥 近年来随着气候变暖和耕作制度的改变袁传
播 砸月杂阅灾的介体昆虫灰飞虱的虫口数量大幅增加袁
导致水稻黑条矮缩病爆发流行袁严重危害我国粮食作
物的安全生产咱猿暂 遥
水稻黑条矮缩病毒基因组由 员园 条双链 砸晕粤 组
成袁根据它们在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的迁移率袁由慢
到快依次命名为 杂员 原 杂员园遥 病毒的全基因组由
圆怨员源员遭责 个核苷酸组成袁包含有 员圆 个开放阅读框
渊燥责藻灶 则藻葬凿蚤灶早 枣则葬皂藻袁 韵砸云冤袁共编码 员圆 个蛋白产物咱源暂 遥
其中基因组片段 杂员 被推测为编码 砸晕粤 依赖的 砸晕粤
聚合酶 渊 砸凿砸孕冤袁 杂缘袁 杂远袁 杂怨 原 员 是病毒毒质组成蛋
白咱缘暂 袁杂苑 原 员 编码管状结构蛋白咱远 原 苑暂 袁杂圆袁杂猿袁杂源袁杂愿袁
杂员园 编码病毒的结构蛋白袁其中 杂愿 和 杂员园 分别为病毒
的内外层外壳蛋白咱愿 原 怨暂 遥 杂苑 原 圆 和 杂怨 原 圆 功能目前未
知遥 病毒结构蛋白是病毒粒子构建的基本单位袁它们
在病毒生命循环中所涉及的一系列事件袁比如病毒的
进入尧复制尧转录尧以及组装中扮演着关键的角
色咱员园 原 员圆暂 遥 在植物病毒中外壳蛋白渊糟燥葬贼 责则燥贼藻蚤灶袁悦孕冤是
研究最早袁最广泛的病毒蛋白之一咱员猿暂 遥 目前关于水稻
黑条矮缩病毒外壳蛋白功能的研究比较少遥 陨泽燥早葬蚤 等
人利用免疫标记发现袁砸月杂阅灾 孕员园 抗体可以识别完整
的 砸月杂阅灾 病毒颗粒袁表明 孕员园 为 砸月杂阅灾 的外壳蛋
白咱员源暂 袁蕴蚤怎 等咱怨暂研究表明外壳蛋白 孕员园 具有自我互作
的能力遥 然而袁外壳蛋白 孕员园 在 砸月杂阅灾侵染过程中有
着怎样的作用袁以及哪些寄主因子参与了这些过程钥
目前国内外研究者还没有提供任何这方面的研究信
息遥 本研究拟通过利用酵母双杂交系统以 砸月杂阅灾 外
壳蛋白 孕员园 为诱饵对拟南芥 糟阅晕粤文库进行了互作蛋
白的筛选遥 通过筛选得到的植物互作因子袁初步了解
外壳蛋白 孕员园 在 砸月杂阅灾 侵染植物过程中可能具有的
生物学功能袁从而丰富同类病毒致病机制的理论研究遥
源愿苑
摇 缘 期 与 砸月杂阅灾外壳蛋白 孕员园 互作植物因子的筛选与验证
员摇 材料与方法
员郾 员摇 材料
孕悦砸产物回收试剂盒袁质粒 阅晕粤提取试剂盒购自
美国 孕则燥皂藻早葬 公司曰双元表达载体 责悦灾鄄藻郧云孕 和 责悦灾鄄
皂悦澡藻则则赠系本实验室保存曰常用限制性内切酶购自美
国 云藻则皂葬灶贼葬泽 酝月陨公司曰运韵阅 阅晕粤聚合酶尧逆转录酶购
自 栽燥赠燥遭燥公司曰重组酶 藻曾灶葬泽藻栽酝 购自南京诺唯赞公
司曰栽则蚤扎燥造试剂购自美国 陨灶增蚤贼则燥早藻灶公司曰引物由上海生
工生物工程有限公司合成曰测序由上海铂尚生物技术
有限公司完成遥 砸月杂阅灾 侵染的水稻病株样品采自浙
江嘉兴袁并保存于 原愿园益 冰箱备用遥
员郾 圆摇 方法
员郾 圆郾 员摇 砸晕粤的提取和 糟阅晕粤 的合成 摇 采用 栽则蚤扎燥造 法
分别提取水稻病株样品和拟南芥植株总 砸晕粤曰利用特
异性引物扩增得到病毒基因曰利用随机引物袁按照
栽燥赠燥遭燥试剂盒说明袁逆转录得到拟南芥 糟阅晕粤遥
员郾 圆郾 圆摇 引物设计摇 根据 晕悦月陨 公布的 砸月杂阅灾 浙江分
离物基因组片段 杂员园 序列袁分别设计上下游引物袁由上
海博尚生物技术有限公司合成袁引物序列如下院
克隆到酵母诱饵载体 责耘郧圆园圆 的引物
耘郧鄄孕员园 赃 云院 缘忆 原 粤粤悦郧郧悦郧粤悦栽郧郧悦栽郧郧粤粤栽鄄
栽悦粤栽郧郧悦栽郧粤悦粤栽粤粤郧粤悦栽悦 原猿忆
耘郧鄄孕员园赃砸院 缘忆 原 栽栽郧郧悦栽郧悦粤郧郧栽悦郧粤悦栽悦郧粤郧贼鄄
贼葬栽悦栽栽郧栽悦粤悦栽栽栽郧栽栽栽粤郧 原猿忆
克隆到酵母猎物载体 责允郧源 原 缘 的引物
耘郧鄄孕员园赃云院 缘忆 原 郧粤栽栽粤栽郧悦悦栽悦栽悦悦悦郧粤粤栽栽悦粤栽鄄
郧郧悦栽郧粤悦粤栽粤粤郧粤悦栽悦 原猿忆
耘郧鄄孕员园赃砸院 缘忆 原 粤郧粤粤郧栽悦悦粤粤粤郧悦栽栽悦栽悦郧粤郧贼鄄
贼葬栽悦栽栽郧栽悦粤悦栽栽栽郧栽栽栽粤郧 原猿忆
克隆到植物双元载体 责悦灾鄄藻郧云孕的引物
悦灾鄄孕员园 赃云院 缘忆 原 粤悦郧郧郧郧郧粤悦栽悦栽粤郧粤粤悦悦粤栽郧鄄
郧悦栽郧粤悦粤栽粤粤郧粤悦栽悦 原猿忆
悦灾 鄄孕员园赃砸院 缘忆 原 粤栽悦郧郧郧郧粤粤粤栽栽悦郧粤郧悦栽悦栽悦栽鄄
栽郧栽悦粤悦栽栽栽郧栽栽栽粤郧 原猿忆
根据酵母双杂交筛选得到与 孕员园 互作的拟南芥真
核翻译起始因子 粤贼藻陨云缘粤 原 圆袁分别设计上下游引物袁
引物序列如下院
克隆到酵母诱饵载体 责耘郧圆园圆 的引物
耘郧鄄缘粤圆赃云院 缘忆鄄粤粤悦郧郧悦郧粤悦栽郧郧悦栽郧郧粤粤栽栽悦粤栽鄄
郧栽悦栽郧粤悦郧粤悦郧粤郧悦粤悦悦鄄猿忆
耘郧鄄缘粤圆 赃 砸院 缘忆鄄栽栽郧郧悦栽郧悦粤郧郧栽悦郧粤悦栽悦郧粤郧贼鄄
糟葬栽悦郧粤粤栽悦悦粤粤郧悦悦栽悦粤栽悦栽郧悦鄄猿忆
克隆到酵母猎物载体 责允郧源鄄缘 的引物
耘郧鄄缘粤圆 赃 云院 缘忆鄄郧粤栽栽粤栽郧悦悦栽悦栽悦悦悦郧粤粤栽栽悦粤栽鄄
郧栽悦栽郧粤悦郧粤悦郧粤郧悦粤悦悦鄄猿忆
耘郧鄄缘粤圆 赃 砸院 缘忆鄄粤郧粤粤郧栽悦悦粤粤粤郧悦栽栽悦栽悦郧粤郧贼鄄
糟葬栽悦郧粤粤栽悦悦粤粤郧悦悦栽悦粤栽悦栽郧悦鄄猿忆
克隆到植物双元载体 责悦灾鄄皂悦澡藻则则赠的引物
悦灾鄄缘粤圆赃云院 缘忆鄄郧粤悦栽悦栽粤郧粤悦悦悦悦栽郧郧郧粤栽悦悦粤栽鄄
郧栽悦栽郧粤悦郧粤悦郧粤郧悦粤悦悦鄄猿忆
悦灾鄄缘粤圆 赃 砸院 缘忆鄄悦悦栽栽郧悦栽悦粤悦悦粤栽郧郧栽郧栽悦郧粤悦鄄
悦栽栽郧悦悦粤悦悦粤悦悦粤粤悦栽栽悦悦栽栽鄄猿忆
员郾 圆郾 猿摇 重组载体的构建摇 将上述设计好的引物以合
成的 糟阅晕粤为模板袁进行 孕悦砸扩增遥 扩增的 孕悦砸产物
与相对应酶切过的载体按照摩尔浓度 员颐 员的比例混合
加入重组酶 藻曾灶葬泽藻栽酝袁在室温条件下进行连接重组 猿园
皂蚤灶遥 重组产物转化 阅匀缘琢袁涂板培养后进行 孕悦砸筛选
阳性单菌落袁得到的重组质粒测序确认连接的正确性遥
员郾 圆郾 源摇 酵母文库的筛选摇 将构建正确的酵母诱饵质
粒 责耘郧鄄孕员园 与拟南芥 糟阅晕粤 文库质粒利用 孕耘郧鄄蕴蚤粤悦
法共转化酵母菌株 耘郧再源愿咱员缘暂 袁涂板三缺培养基渊 原
怎则葬 辕 原 澡蚤泽 辕 原 贼则责冤遥 三缺培养基上长出的阳性克隆使
用转印膜转移至含 载鄄早葬造 的三缺显色培养基上袁猿园益
培养 猿 凿 后袁挑取蓝色克隆袁于 圆 皂蕴 三缺液体培养基
中袁猿园 益振荡培养过夜袁进行质粒提取袁提取出的酵母
质粒转化大肠杆菌 运悦愿 感受态细胞袁于 粤皂责 蕴月 平板
上 猿苑 益培养过夜遥 粤皂责平板上长出的阳性克隆转移
至 酝怨 培养基渊 原 贼则责冤上袁过夜培养后长出的阳性克隆
即含有与诱饵蛋白互作的 责允郧源 原 缘 猎物质粒遥 钓出的
猎物质粒送公司测序袁测序结果于拟南芥基因库中比
对袁即可获得猎物蛋白信息遥
员郾 圆郾 缘摇 猎物与诱饵蛋白互作关系验证摇 根据上述构
建完成的猎物质粒渊责耘郧鄄孕员园 和 责耘郧鄄藻陨云缘粤圆冤和诱饵
质粒渊责允郧鄄孕员园 和 责允郧鄄 藻陨云缘粤圆冤袁分别一一对应转化于
酵母感受态细胞中袁进行互作关系验证袁在 载鄄早葬造 培养
基上显蓝的组合即可确认两者在酵母中存在相互作用
关系遥
员郾 圆郾 远摇 农杆菌介导转染烟草表皮细胞摇 将植物双元
表 达 载 体 责悦灾鄄藻郧云孕尧 责悦灾鄄孕员园院 藻郧云孕 和 责悦灾鄄
粤贼藻陨云缘粤圆院皂悦澡藻则则赠袁分别电转入农杆菌 悦缘愿悦员 中袁置于
圆愿 益摇床袁圆圆园 则窑皂蚤灶 原员培养 圆 澡曰之后涂布于 运砸栽平
板渊含 运葬灶 垣 尧砸蚤枣 垣 和 栽藻贼 垣 抗生素的 蕴月 固体培养
基冤袁平板置于 圆愿 益培养遥 挑取阳性单菌落于含上述
抗生素的 蕴月 液体培养基中培养约 圆园 耀 圆源 澡曰低速离
心收集菌体袁用缓冲液渊员园 皂酝 酝早悦造圆袁员园园 皂酝 酝耘杂袁责匀值 缘郾 远袁 员园园 滋酝乙酰丁香酮冤悬浮菌体袁调整菌液
缘愿苑
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
浓度至 韵阅远园园 为 员郾 园袁圆缘 益放置 猿 澡 以上遥 将上述菌
液以及 责悦灾鄄孕员园院藻郧云孕 和 责悦灾鄄粤贼藻陨云缘粤圆院皂悦澡藻则则赠 的
混合液用注射器对野生型的本氏烟渊晕援 遭藻灶贼澡葬皂蚤葬灶葬冤
进行注射浸润接种遥
员郾 圆郾 苑摇 激光共聚焦荧光显微镜观察摇 注射过的烟草
放于 圆缘 益环境培养袁源愿 澡后袁挑选较平整的叶片袁置于
共聚焦显微镜下袁分别观察经过 责悦灾鄄藻郧云孕尧责悦灾鄄孕员园院
藻郧云孕和 责悦灾鄄粤贼藻陨云缘粤圆院皂悦澡藻则则赠 注射的烟草表皮细胞
以及 责悦灾鄄孕员园院藻郧云孕 和 责悦灾鄄粤贼藻陨云缘粤圆院皂悦澡藻则则赠 混合
注射处理的样品遥 保存拍摄的图像袁进行分析遥
圆摇 结果与分析
圆郾 员摇 砸月杂阅灾 孕员园 诱饵载体和猎物载体的构建
分别利用所设计的两对引物渊耘郧鄄孕员园 原 云 和 耘郧鄄
孕员园 原 砸袁允郧鄄孕员园 原 云 和 允郧鄄孕员园 原 砸冤以 砸月杂阅灾 侵染的
水稻总 砸晕粤为模板进行 砸栽鄄孕悦砸 扩增袁琼脂糖凝胶电
泳结果显示袁可以特异性地扩增到约 员远园园 遭责 左右的
阅晕粤片段 渊图 员 原 粤冤遥 结果与预期的 责员园 基因产物的
大小一致遥 孕悦砸产物经过切胶纯化回收袁扩增产物在
重组酶的作用下分别与 耘糟燥砸陨 和 载澡燥陨 双酶切的诱饵
和猎物载体进行连接重组 渊图 员 原 粤冤袁转化涂板后袁
孕悦砸验证的阳性克隆进行测序渊图 员 原 月冤遥 在图 员 原 月
中所示袁孕悦砸鉴定泳道 员 和 圆 为 孕员园 诱饵载体的阳性
克隆袁泳道 缘 和 愿 为 孕员园 猎物载体的阳性克隆遥 挑选
序列正确的阳性克隆测序袁提取质粒袁并分别命名为酵
母重组诱饵质粒 责耘郧鄄孕员园 和重组猎物质粒 责允郧鄄孕员园遥
圆郾 圆摇 与 孕员园 互作的拟南芥 糟阅晕粤文库质粒筛选
将上述构建正确的酵母诱饵重组质粒 责耘郧鄄孕员园
和拟南芥质粒 糟阅晕粤 文库利用 孕耘郧鄄蕴蚤粤悦 法共转化酵
母菌株 耘郧再源愿袁涂板三缺培养基渊 原 怎则葬 辕 原 澡蚤泽 辕 原 贼则责冤遥
三缺培养基上长出的阳性克隆使用转印膜转移至含
载鄄早葬造的三缺显色培养基上遥 获得的阳性克隆进行质
粒提取测序后在拟南芥基因库中进行序列比对袁我们
获得其中一个阳性克隆为全长的真核翻译起始因子
藻陨云缘粤 原圆渊粤贼藻陨云缘粤 原圆冤遥
圆郾 猿摇 拟南芥翻译起始因子 藻陨云缘粤 的克隆与酵母载体
构建
分别利用所设计的两对引物渊耘郧 原 缘粤圆 原 云 和 耘郧
原 缘粤圆 原 砸袁允郧 原 缘粤圆 原 云 和 允郧 原 缘粤圆 原 砸冤以拟南芥
糟阅晕粤为模板进行 孕悦砸扩增遥 琼脂糖凝胶电泳结果显
示袁可以特异性地扩增到约 缘园园遭责 左右的 阅晕粤 片段
渊图 圆 原 粤冤遥 结果与预期的 粤贼藻陨云缘粤 原圆 基因产物的大
小一致遥 扩增产物在重组酶的作用下分别与 耘糟燥砸陨 和
注院粤袁泳道 员袁分子 酝葬则噪藻则曰泳道 圆 和 猿 分别为连接到诱饵载
体和猎物载体上的 孕员园 孕悦砸 产物曰泳道 源 和 缘 分别为经过
双酶切后诱饵载体和猎物载体的片段曰月袁泳道 员 原 源 为重组
诱饵载体 责耘郧鄄孕员园 菌落 孕悦砸筛选曰泳道 缘 原 愿 为重组猎物载
摇 摇 摇 摇 体 责允郧鄄孕员园 菌落 孕悦砸筛选遥
晕燥贼藻院粤袁 造葬灶藻 员袁 酝葬则噪藻则曰 造葬灶藻 圆 葬灶凿 造葬灶藻 猿 蚤灶凿蚤糟葬贼藻凿 贼澡藻 孕员园
孕悦砸 责则燥凿怎糟贼泽 枣燥则 糟造燥灶蚤灶早 蚤灶贼燥 遭葬蚤贼 葬灶凿 责则藻赠 增藻糟贼燥则袁 则藻泽责藻糟贼蚤增藻鄄
造赠曰 造葬灶藻 源 葬灶凿 造葬灶藻 缘 蚤灶凿蚤糟葬贼藻凿 贼澡藻 凿蚤早藻泽贼蚤燥灶泽 燥枣 遭葬蚤贼 葬灶凿 责则藻赠
增藻糟贼燥则 遭赠 耘糟燥砸陨 葬灶凿 载澡燥陨 袁 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠曰 月袁 造葬灶藻 员 原 源 蚤灶凿蚤糟葬鄄
贼藻凿 贼澡藻 孕悦砸 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 责耘郧鄄孕员园曰 造葬灶藻 缘 原 愿 蚤灶凿蚤糟葬贼藻凿 贼澡藻
摇 摇 摇 摇 孕悦砸 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 责允郧鄄孕员园援
图 员摇 砸月杂阅灾外壳蛋白诱饵载体和猎物载体的构建
云蚤早援 员摇 悦燥灶泽贼则怎糟贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 遭葬蚤贼 葬灶凿 责则藻赠 增藻糟贼燥则
燥枣 砸月杂阅灾 糟燥葬贼 责则燥贼藻蚤灶 孕员园
载澡燥陨双酶切的诱饵和猎物载体进行连接重组袁转化涂
板后袁孕悦砸验证的阳性克隆进行测序渊图 圆 原 月冤遥 在
图 圆月中所示袁孕悦砸 鉴定泳道 员尧圆尧猿 为 孕员园 诱饵载体
的阳性克隆袁泳道 源尧缘尧远 为 孕员园 猎物载体的阳性克隆遥
提取相应的质粒分别命名为 责耘郧鄄粤贼藻陨云缘粤 原 圆 和 责允郧鄄
粤贼藻陨云缘粤 原 圆遥
圆郾 源摇 孕员园 与拟南芥起始因子 藻陨云缘粤酵母互作验证
为了验证钓取的猎物蛋白 粤贼藻陨云缘粤与 孕员园 是否真
实互作袁我们分别将构建完成的诱饵质粒渊责耘郧鄄孕员园 和
责耘郧鄄粤贼藻陨云缘粤 原 圆 冤 和猎物质粒 渊 责允郧鄄孕员园 和 责允郧鄄
粤贼藻陨云缘粤 原圆冤共同转化酵母菌株袁转化得到的酵母能够
在三缺平板生长并且能够变蓝渊图 猿冤遥 这表明 孕员园 与
粤贼藻陨云缘粤 原 圆 在酵母中是互作的遥 责耘郧鄄粤运砸圆粤 和 责允郧鄄
粤孕载猿 共转酵母作为阳性对照咱员缘暂 遥
圆郾 缘摇 孕员园 和 粤贼藻陨云缘粤在烟草表皮细胞中的亚定位
蛋白亚细胞定位的研究是了解蛋白功能和蛋白互
作的重要方法之一遥 为了确定 孕员园 与 粤贼藻陨云缘粤 原 圆 两
者是否在植物细胞内一起行使功能袁我们开展了 孕员园
和 粤贼藻陨云缘粤 原圆 在烟草表皮细胞中进行亚细胞定位研
究遥 通过构建正确的植物双元载体 责悦灾鄄藻郧云孕尧责悦灾鄄
孕员园院藻郧云孕 和 责悦灾鄄粤贼藻陨云缘粤圆院皂悦澡藻则则赠 转化农杆菌袁注
射烟草表皮细胞后袁利用激光共聚焦显微镜进行观察
远愿苑
摇 缘 期 与 砸月杂阅灾外壳蛋白 孕员园 互作植物因子的筛选与验证
注院粤袁泳道 员袁分子 酝葬则噪藻则曰泳道 圆 和 猿 分别为连接到诱饵载体和
猎物载体上的 粤贼藻陨云缘粤 原 圆 孕悦砸 产物曰月袁泳道 员 原 猿 为重组诱饵
载体 责耘郧鄄粤贼藻陨云缘粤 原 圆 菌落 孕悦砸 筛选曰泳道 源 原 远 为重组猎物载
摇 摇 摇 摇 体 责允郧鄄粤贼藻陨云缘粤 原 圆 菌落 孕悦砸筛选遥
晕燥贼藻院粤袁 造葬灶藻 员袁 酝葬则噪藻则曰 造葬灶藻 圆 葬灶凿 造葬灶藻 猿 蚤灶凿蚤糟葬贼藻凿 贼澡藻 粤贼藻陨云缘粤 原
圆 孕悦砸 责则燥凿怎糟贼泽 枣燥则 糟造燥灶蚤灶早 蚤灶贼燥 遭葬蚤贼 葬灶凿 责则藻赠 增藻糟贼燥则袁 则藻泽责藻糟贼蚤增藻造赠援
月袁 造葬灶藻 员 原 猿 蚤灶凿蚤糟葬贼藻凿 贼澡藻 孕悦砸 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 责耘郧鄄粤贼藻陨云缘粤 原 圆曰
摇 造葬灶藻 源 原 远 蚤灶凿蚤糟葬贼藻凿 贼澡藻 孕悦砸 蚤凿藻灶贼蚤枣蚤糟葬贼蚤燥灶 燥枣 责允郧鄄粤贼藻陨云缘粤 原 圆援
图 圆摇 拟南芥翻译起始因子 粤贼藻陨云缘粤 原圆
诱饵载体和猎物载体的构建
云蚤早援 圆摇 悦燥灶泽贼则怎糟贼蚤燥灶 燥枣 贼澡藻 遭葬蚤贼 葬灶凿
责则藻赠 增藻糟贼燥则 燥枣 粤贼藻陨云缘粤 原圆
注院 员袁阳性对照 责耘郧鄄粤运砸圆粤 和 责允郧鄄粤孕载猿 共转酵母后生长状况曰
圆袁阴性对照 责耘郧鄄孕员园 和空载体 责允郧源 原 缘 共转酵母后生长状况曰猿袁
责耘郧鄄孕员园 和 责允郧鄄粤贼藻陨云缘粤 原 圆 共转酵母后生长状况曰源袁责允郧鄄孕员园 和
摇 摇 摇 摇 责耘郧鄄粤贼藻陨云缘粤 原 圆 共转酵母后生长状况遥
晕燥贼藻院员袁 贼澡藻 早则燥憎贼澡 燥枣 赠藻葬泽贼 贼则葬灶泽枣燥则皂藻凿 遭赠 责耘郧鄄粤运砸圆粤 葬灶凿 责允郧鄄
粤孕载猿曰 圆袁 贼澡藻 早则燥憎贼澡 燥枣 赠藻葬泽贼 贼则葬灶泽枣燥则皂藻凿 遭赠 责耘郧鄄孕员园 葬灶凿 责允郧源 原 缘曰
猿袁 贼澡藻 早则燥憎贼澡 燥枣 赠藻葬泽贼 贼则葬灶泽枣燥则皂藻凿 遭赠 责耘郧鄄孕员园 葬灶凿 责允郧鄄粤贼藻陨云缘粤 原 圆曰
源袁 贼澡藻 早则燥憎贼澡 燥枣 赠藻葬泽贼 贼则葬灶泽枣燥则皂藻凿 遭赠 责允郧鄄孕员园 葬灶凿 责耘郧鄄粤贼藻陨云缘粤 原 圆援
图 猿摇 孕员园 和 粤贼藻陨云缘粤 原圆 在酵母中互作验证
云蚤早援 猿摇 栽澡藻 凿藻贼藻糟贼蚤燥灶 燥枣 孕员园 葬灶凿 粤贼藻陨云缘粤 原圆 蚤灶 赠藻葬泽贼 糟藻造造泽
目的蛋白融合荧光后在植物细胞中的亚定位渊图 源冤遥
在烟草表皮细胞中只表达 藻郧云孕袁荧光主要分布在细胞
核和细胞质中遥 孕员园 与 藻郧云孕融合后袁荧光主要分布细
胞内形成网格状的囊泡状结构袁这与我们已发表的研
究结果相一致咱员远暂 袁孕员园 主要分布在内质网上形成囊泡
状结构遥 拟南芥翻译起始因子 藻陨云缘粤 原 圆 融合 皂糟澡藻则则赠
后也出现网格状的囊泡状结构渊图 源 原 粤冤袁并且 孕员园
形成的绿色荧光与 粤贼藻陨云缘粤 原 圆 形成的红色荧光能够
重合成黄色的荧光渊图 源 原 月冤袁这表明 孕员园 与 粤贼藻陨云缘粤
原 圆 是共定位的遥
注院 粤袁藻郧云孕尧孕员园院藻郧云孕 和 藻陨云缘粤圆院皂悦澡藻则则赠 在烟草表皮细胞中
的亚细胞定位观察曰月袁孕员园院藻郧云孕和 藻陨云缘粤圆院皂悦澡藻则则赠 在烟草表
摇 摇 摇 摇 皮细胞中的亚细胞共定位观察
晕燥贼藻院 粤袁 贼澡藻 泽怎遭糟藻造造怎造葬则 造燥糟葬造蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 藻郧云孕袁 孕员园院 藻郧云孕 葬灶凿
藻陨云缘粤圆院皂悦澡藻则则赠 蚤灶 晕援 遭藻灶贼澡葬皂蚤葬灶葬 藻责蚤凿藻则皂葬造 糟藻造造泽援 月袁 贼澡藻 糟燥鄄造燥鄄
糟葬造蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 孕员园院藻郧云孕 葬灶凿 藻陨云缘粤圆院皂悦澡藻则则赠 蚤灶 晕援 遭藻灶贼澡葬皂蚤葬灶葬
摇 摇 摇 摇 藻责蚤凿藻则皂葬造 糟藻造造泽援
图 源摇 孕员园和 粤贼藻陨云缘粤 原圆在烟草细胞中亚细胞定位观察
云蚤早援 源摇 栽澡藻 造燥糟葬造蚤扎葬贼蚤燥灶 燥枣 孕员园 葬灶凿 粤贼藻陨云缘粤 原圆
蚤灶 晕援 遭藻灶贼澡葬皂蚤葬灶葬 藻责蚤凿藻则皂葬造 糟藻造造泽
猿摇 讨论
近年来由水稻黑条矮缩病毒引起的水稻黑条矮缩
病毒病和玉米粗缩病袁给我国粮食作物生产带来了严
重危害遥 水稻生产上使用的各种药剂和防治措施都不
能有效地对该病毒病进行控制袁并且该病害仍呈蔓延
发生趋势咱员苑暂 遥 然而目前国内外尚没有发现抗黑条矮
缩病毒的种质资源袁因此袁深入研究水稻黑条矮缩病病
毒袁探索其传播尧致病机制以及病毒与植物寄主的相互
作用等问题具有重要科学意义袁同时也能为水稻抗病
毒育种提供理论依据和新策略咱员愿暂 遥
本研究利用酵母双杂交系统以 砸月杂阅灾 外壳蛋白
孕员园 为诱饵对拟南芥质粒 糟阅晕粤 文库进行了互作蛋白
的筛选遥 筛选得到多种蛋白袁其中包括真核翻译起始
因子 粤贼藻陨云缘粤 原圆遥 真核翻译起始因子 缘粤 是迄今为止
苑愿苑
核摇 农摇 学摇 报 圆愿 卷
惟一发现的含稀有氨基酸羟腐胺赖氨酸渊匀赠责怎泽蚤灶藻冤的
蛋白质咱员怨暂 遥 研究发现 藻陨云缘粤 并非传统意义上的真核
翻译起始因子袁并且 藻陨云缘粤 并非所有蛋白合成过程所
必需的因子袁可能只在某些特殊代谢途径中合成蛋白
时所需咱圆园暂 遥 在哺乳动物及酵母中的研究表明袁藻陨云 原
缘粤与细胞增殖及衰老关系密切袁藻陨云缘粤 在细胞内起到
一个生死开关的作用袁通过其不同异构体的过量表达
使细胞走向增殖或者凋亡咱圆员暂 遥 在植物中真核翻译起
始因子 缘粤可能参与植物自然条件下的衰老袁及在生
物和非生物胁迫条件下诱导的细胞程序性死亡咱圆圆 原 圆源暂 遥
拟南芥在 粤贼藻陨云缘粤 原圆 插入 栽鄄阅晕粤 突变后变得植株矮
化器官缩小袁并且能够降低伏马毒素 月员渊云月员冤诱导的
细胞死亡袁而过表达 粤贼藻陨云缘粤圆 的转基因拟南芥袁也出
现了多种异常的表型袁如植株过早死亡等咱圆缘暂 遥 另外过
表达 粤贼藻陨云缘粤圆 拟南芥植株会加重病菌引起的细胞死
亡现象咱圆远暂 遥 在本研究中袁我们通过克隆 粤贼藻陨云缘粤 原 圆
分别构建到诱饵载体和猎物载体袁在酵母中确定外壳
蛋白 孕员园 与 粤贼藻陨云缘粤圆 互作遥 利用农杆菌转染烟草表
皮细胞瞬时表达体系发现 藻陨云缘粤圆 融合 皂悦澡藻则则赠 后袁荧
光主要存在于内质网上遥 通过荧光共定位实验分析袁
孕员园 与 粤贼藻陨云缘粤圆 能够共定位遥 蕴蚤 等咱圆苑暂利用蛋白质组
学方法对正常的和 砸月杂阅灾 侵染的玉米叶片分析发
现袁在病毒侵染后翻译起始因子 藻陨云缘粤 的蛋白质表达
水平提高了 源 耀 员缘 倍袁这表明 砸月杂阅灾 侵染后导致翻
译起始因子 藻陨云缘粤 的过量表达遥 因此我们可以推测袁
在 砸月杂阅灾侵染水稻过程中外壳蛋白 孕员园 可能通过调
控翻译起始因子 藻陨云缘粤来实现其在病毒侵染循环中的
作用袁而翻译起始因子 藻陨云缘粤在 砸月杂阅灾侵染过程中扮
演的角色和作用袁需要后续的实验进行阐明遥
源摇 结论
本文利用酵母双杂交技术以 砸月杂阅灾 外壳蛋白
孕员园 为诱饵钓取拟南芥 糟阅晕粤 文库袁得到与 孕员园 互作
的真核翻译起始因子 粤贼藻陨云缘粤 原 圆遥 通过克隆全长的
粤贼藻陨云缘粤 原 圆 后在酵母中进一步验证两者的互作关系遥
在烟草表皮细胞中表达 孕员园 和 粤贼藻陨云缘粤 原 圆 融合荧光
蛋白后袁荧光主要形成囊泡状的结构袁并且 孕员园 与
粤贼藻陨云缘粤 原圆 能够共定位遥
参考文献院
咱 员 暂 摇 陈声祥袁 张巧艳援 我国水稻黑条矮缩病和玉米粗缩病研究进展
咱允暂 援 植物保护学报袁 圆园园缘袁 猿圆渊员冤院怨苑 原 员园猿
咱 圆 暂摇 张恒木袁 雷娟利袁 陈剑平袁 吕永平袁 陈声祥袁 薛庆中援 浙江和河
北发生的一种水稻袁 小麦袁 玉米矮缩病是水稻黑条矮缩病毒引
起的咱允暂 援 中国病毒学袁 圆园园员袁 员远渊猿冤院圆源远 原 圆缘员
咱 猿 暂摇 王华弟袁 祝增荣袁 陈剑平袁 汪恩国袁 李宝福援 水稻黑条矮缩病发
生流行规律袁 监测预警与防控关键技术咱 允暂 援 浙江农业学报袁
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咱员员暂摇 朱磊袁 杨景华袁 张明方援 芥菜 砸怎遭蚤泽糟燥小亚基的基因克隆及其在
芜菁花叶病毒侵染后的表达分析咱允暂 援 核农学报袁 圆园员员袁 圆缘渊缘冤院
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咱员圆暂摇 谢鹏袁 胡丽袁 蔡永萍袁 林毅袁 高俊山援 栽酝灾 抗性基因 晕 介导的
烟草过敏性反应研究咱 允暂 援 核农学报袁 圆园员猿袁 圆苑 渊员圆冤院员愿园怨 原
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水稻黑条矮缩病在浙中的回升流行原因分析 咱允暂 援 浙江农业科
学袁 圆园园园袁 远渊猿冤院圆愿苑 原 圆愿怨
咱员愿暂摇 朱玉君袁 樊叶杨袁黄得润袁 庄杰云援 分子标记辅助选择在水稻育
种中的应用咱允暂 援 核农学报袁 圆园员圆袁 圆远渊缘冤院苑缘远 原 苑远员
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