全 文 ：　 核 农 学 报　 ２０１５，２９（１）：０１６１ ～ ０１６８
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
收稿日期：２０１４⁃０２⁃２１　 接受日期：２０１４⁃０８⁃０９
基金项目：国家自然科学基金项目（３０７７１５２２）
作者简介：邵丽达，女，主要从事草坪草体细胞无性系变异研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：３７２７９２４４３＠ ｑｑ． ｃｏｍ
通讯作者：柴明良，男，教授，主要从事园林植物生物技术与遗传育种研究。 Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｍｌｃｈａｉ＠ ｚｊｕ． ｅｄｕ． ｃｎ
文章编号：１０００⁃８５５１（２０１５）０１⁃０１６１⁃０８
沟叶结缕草愈伤组织生长及再生对铜胁迫的响应
邵丽达　 吴艳歌　 毕　 波　 柴明良
（浙江大学 农业与生物技术学院园艺系，浙江 杭州　 ３１００５８）
摘　 要：为探索不同胁迫对沟叶结缕草（Ｚｏｙｓｉａ ｍａｔｒｅｌｌａ ［Ｌ． ］ Ｍｅｒｒ． ）愈伤组织生长及再生的影响，以继代
了 ９ 年的胚性愈伤组织为材料，以 ＭＳ（ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ａｎｄ ｓｋｏｏｇ）为基本培养基添加不同浓度的铜（Ｃｕ２ ＋ ），
研究其对继代培养中愈伤组织的直径、鲜重增长率和再生培养中的植株再生率，以及愈伤组织及再生植
株根和叶的过氧化氢酶（ＣＡＴ）、过氧化物酶（ＰＯＤ）、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）和抗坏血酸过氧化物酶
（ＡＰＸ）活性、铜含量、叶绿素含量、丙二醛（ＭＤＡ）含量的影响。 结果表明，在铜浓度为 １０􀆰 ０ μＭ时，愈伤
组织直径、鲜重增长率、植株再生率及叶绿素含量均达最大值；愈伤组织可生长和再生的铜的临界浓度
分别在 ３００􀆰 ０ ～ ５００􀆰 ０ μＭ、５０􀆰 ０ ～ １００􀆰 ０ μＭ间。 经长期处理（１２ 周）的愈伤组织和 ２４ 周再生的植株叶
片和根系中，４ 种抗氧化活性酶活性和 ＭＤＡ含量在 １０􀆰 ０ μＭ下均为最低；经短期处理（１０ ｄ）的愈伤组
织，ＳＯＤ、ＰＯＤ、ＡＰＸ的活性及 ＭＤＡ含量持续上升，而 ＣＡＴ 先上升后下降。 愈伤组织、再生植株叶片和
根系中铜含量随培养基中铜浓度的升高而增加。 本试验为进一步筛选耐铜突变体提供了试验依据。
关键词：沟叶结缕草；愈伤组织；铜胁迫；生理特性
ＤＯＩ：１０􀆰 １１８６９ ／ ｊ． ｉｓｓｎ． １００⁃８５５１􀆰 ２０１５􀆰 ０１． ０１６１
　 　 铜是植物生长所需的微量元素，但过量的铜会对
植株产生毒害作用，导致生长缓慢，根的生长和伸长受
到抑制，叶面积减小，叶片失绿，水分代谢、光合作用、
呼吸作用等各种生理代谢发生紊乱［１］。 有研究表明，
当铜浓度达 ４０􀆰 ０ ｍｇ·Ｌ － １时，高羊茅植株基本停止生
长，植株及叶片出现萎蔫，叶片也相应变薄［２］。 多年
生黑麦草在低浓度铜等重金属胁迫下发芽率均有提
高，但随着重金属浓度的增加发芽率普遍下降［３］。
沟叶结缕草（Ｚｏｙｓｉａ ｍａｔｒｅｌｌａ ［Ｌ． ］ Ｍｅｒｒ． ），又名马
尼拉，是禾本科结缕草属一种优良的暖季型草坪草，广
泛生长于我国南方地区。 沟叶结缕草通过匍匐茎无性
繁殖，很难用杂交育种对其进行改良，因此体细胞无性
系变异等生物技术在其性状改良上有重要意义。 浙江
大学园林组织培养室自 ２００４ 年用沟叶结缕草匍匐茎
诱导出高效再生的愈伤组织以来，一直致力于愈伤组
织继代、再生过程中体细胞无性系变异的研究［４ － ６］；现
已形成了完整的培养体系［７ － ９］；在辐射诱变［１０ － １２］、耐
盐［４，１２］、耐除草剂［１３］等体细胞无性系变异的研究中均
取得阶段性成果。 目前铜对植物胁迫的相关研究大多
集中在田间生长的植物上［１４ － １７］，采用愈伤组织进行离
体的研究鲜有报道。 本试验以 ＭＳ 为基本培养基添加
不同浓度的铜，测定其对沟叶结缕草愈伤组织生长及
再生的影响，找出适合生长的铜浓度、以及抑制生长及
致死的浓度范围，探索沟叶结缕草愈伤组织在继代及
再生过程中对铜胁迫的生理响应，为筛选耐铜沟叶结
缕草体细胞变异提供一定依据。
１ 材料与方法
１􀆰 １　 材料
本实验室诱导并继代 ９ 年的沟叶结缕草胚性愈伤
组织，由匍匐茎茎节诱导形成的。
１􀆰 ２　 方法
１􀆰 ２􀆰 １　 愈伤组织在阶梯铜浓度下继代生长 　 以
ＣｕＳＯ４·５Ｈ２Ｏ 为铜离子源，添加到 ＭＳ ＋ ２􀆰 ０ ｍｇ·Ｌ － １
２，４⁃Ｄ ＋ ４０􀆰 ０ ｇ·Ｌ － １蔗糖 ＋ １􀆰 ２ ｇ·Ｌ － １脯氨酸 ＋ ３􀆰 ０
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核　 农　 学　 报 ２９ 卷
ｇ·Ｌ － １ Ｐｈｙｔａｇｅｌ的继代培养基中，配制成铜离子浓度分
别为 ０􀆰 １、１􀆰 ０、１０􀆰 ０、５０􀆰 ０、１００􀆰 ０、２００􀆰 ０、３００􀆰 ０、５００􀆰 ０
μＭ（ＭＳ基本培养基的铜浓度）的培养基。 取直径约
３ ｍｍ、生长状态一致的胚性愈伤组织继代培养。 每个
培养皿（直径 ９ ｃｍ）接种 ３０ 块愈伤组织。 每个浓度重
复 ５ 次。 愈伤组织于 ２５ ± ２℃下暗培养。 继代培养
试验分为短期处理（１０ ｄ）和长期处理（１２ 周），每 ４ 周
将愈伤组织转入相同的新鲜继代培养基中。 短期处理
１０ ｄ后，测定愈伤组织的过氧化氢酶（ＣＡＴ）、过氧化
物酶（ＰＯＤ）、超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）和抗坏血酸过氧
化物酶（ＡＰＸ）活性、丙二醛（ＭＤＡ）及铜含量等生理指
标。 长期处理中，每 ４ 周测量愈伤组织的直径和鲜重
增长率，１２ 周后测定愈伤组织的生理指标。
１􀆰 ２􀆰 ２　 愈伤组织在阶梯铜浓度下再生　 在再生培养
基 １ ／ ２ ＭＳ ＋ ０􀆰 ０５ ｍｇ·Ｌ － １ ＢＡ ＋ ３０􀆰 ０ ｇ·Ｌ － １蔗糖 ＋
０􀆰 ０５ ｍｇ·Ｌ － １ ＺＲ ＋ ３􀆰 ０ ｇ·Ｌ － １ Ｐｈｙｔａｇｅｌ 中添加前述相
同浓度的铜离子。 每个 １００ ｍＬ三角瓶接种 １６ 块愈伤
组织。 每个浓度重复 ５ 次。 愈伤组织置于 ２５ ± ２℃
下光培养，光强约 １２􀆰 ５ μｍｏｌ·ｍ － ２·ｓ － １，光照时间为
１６ ｈ·ｄ － １。每 ８ 周将愈伤组织转移到相同的新鲜再生
培养基中，愈伤组织共再生 ２４ 周。 ２４ 周后，再生植株
的根和叶用于生理指标的测定。
１􀆰 ２􀆰 ３　 愈伤组织鲜重增长率、植株再生率测定　 在继
代培养中，接入愈伤组织时称量装有培养基的培养皿
重量 ｍ，接入愈伤组织后称量培养皿和愈伤组织的总
重 Ｍ。 Ｍ与 ｍ的差值即为每皿培养基接种愈伤组织
的重量。 计算每种浓度下愈伤组织的鲜重增长率，愈
伤组织的鲜重增长率 ＝ ［（１２ 周后愈伤组织总重量 －
原始愈伤组织重量） ／原始愈伤组织重量］。
在再生试验中，统计每瓶培养基中再生的愈伤组
织数量，计算愈伤组织的再生率 ＝ （再生的愈伤组织
数量 ／原始愈伤组织数量）。 根据愈伤组织的再生情
况，将再生较多的愈伤组织分化的小苗单独分出。
１􀆰 ２􀆰 ４　 生理检测中样品处理方法　 取长期和短期处
理下各浓度的愈伤组织、再生植株的根和叶各 ０􀆰 ２ ｇ，
每个样品各 ３ 份（每份均为同一培养皿或同一植株分
离所得）。 加 ３􀆰 ０ ｍＬ ５０ ｍＭ 的磷酸缓冲液 （ ｐＨ 值
７􀆰 ８，含 ０􀆰 ３ ｍＭ ＥＤＴＡ），于冰浴中研磨提取。 匀浆液
于１２ ０００ ｒ·ｍｉｎ － １，４℃离心 ３０ ｍｉｎ，取上清液用于过氧
化氢酶（ＣＡＴ）、过氧化物酶（ＰＯＤ）、超氧化物歧化酶
（ＳＯＤ）和抗坏血酸过氧化物酶（ＡＰＸ）活性、铜含量、
叶绿素含量、丙二醛（ＭＤＡ）含量的测定［１３］。 每个处
理重复 ３ 次。
１􀆰 ２􀆰 ５　 铜离子检测　 铜含量的测法用浸提法［１８］。
准确称量 ０􀆰 １００ ｇ 各个浓度的愈伤组织、叶片和
根置于 １ ００ ｍＬ 塑料管中，加入 １０􀆰 ０ ｍＬ ２ ｍｏｌ·Ｌ － １
ＨＣｌ ＋ Ｖｃ溶液，然后放在恒温振荡器中，８０℃恒温震
荡 ２ ｈ 后，用 ＰＥ⁃４０００ 型原子吸收分光光度计测量铜
含量［１９］。
２􀆰 ０ ｍｏｌ·Ｌ － １ ＨＣｌ ＋ Ｖｃ 溶液的配制：在 １０００ ｍＬ
烧杯中，用 ８３３􀆰 ０ ｍＬ 水溶解 ０􀆰 ４ ｇ 抗坏血酸，再向烧
杯中加入 １６７􀆰 ０ ｍＬ浓 ＨＣｌ，混匀。
１􀆰 ３　 数据差异显著性分析
试验数据采用 ＳＰＳＳ １６􀆰 ０ 分析数据差异显著性。
２ 结果与分析
２􀆰 １　 铜处理下沟叶结缕草愈伤组织继代生长及再生
状况
随着继代培养基中铜浓度的递增，愈伤组织在鲜
重增长率、存活率及表观的变化见图 １、图 ２。 在 ０􀆰 １、
１􀆰 ０、１０􀆰 ０、５０􀆰 ０ 和 １００􀆰 ０ μＭ 浓度下，愈伤组织均存
活，且生长较好；２００􀆰 ０ μＭ 和 ３００􀆰 ０ μＭ 下，愈伤组织
虽均存活，但有部分褐化；而在 ５００􀆰 ０ μＭ 下，愈伤组
织全褐化，仅微小的局部呈黄绿色，说明 ５００􀆰 ０ μＭ 下
愈伤组织可以局部存活，但失去增殖力。 初始阶段，随
着铜浓度的增加，愈伤组织生长呈增长趋势，在
１０􀆰 ０ μＭ时愈伤组织直径和鲜重增长率达最大；随着
铜浓度的再增大，愈伤组织的生长又呈现下降趋势。
注：不同字母表示差异显著（Ｐ ＜ ０􀆰 ０５）。 下同。
Ｎｏｔｅ： Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｌｅｔｔｅｒｓ ｍｅａｎ ｓｉｇｉｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ
ａｔ ０􀆰 ０５ ｌｅｖｅｌ． Ｔｈｅ ｓａｍｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ．
图 １　 继代培养基中不同铜浓度对沟叶结缕草愈伤
组织大小的影响
Ｆｉｇ． １　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ
ｏｎ ｔｈｅ ｃａｌｌｕｓ ｓｉｚｅｓ ｉｎ Ｚｏｙｓｉａ ｍａｔｒｅｌｌａ ａｆｔｅｒ
ｃａｌｌｕｓ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ
再生培养中，在 ０􀆰 １、１􀆰 ０、１０􀆰 ０ 和 ５０􀆰 ０ μＭ铜浓度
２６１
　 １ 期 沟叶结缕草愈伤组织生长及再生对铜胁迫的响应
下，愈伤组织能正常再生，愈伤组织及再生植株生长良
好；１００􀆰 ０、２００􀆰 ０ μＭ浓度下，愈伤组织基本褐化，不能
再生；而在 ３００􀆰 ０、５００􀆰 ０ μＭ 下全部停止生长并逐渐
死亡。 表明再生植株铜的临界浓度在 ５０􀆰 ０ ～ １００􀆰 ０
μＭ间，该结果与继代培养的变化趋势相同，愈伤组织
再生率先上升后下降，在 １０􀆰 ０ μＭ 时达到最大值（图
３）。
图 ２　 继代培养基中不同铜浓度对沟叶结缕草愈伤
组织鲜重增长率的影响
Ｆｉｇ． ２　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ ｏｎ ｔｈｅ
ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ ｉｎ Ｚｏｙｓｉａ ｍａｔｒｅｌｌａ
ａｆｔｅｒ ｃａｌｌｕｓ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ
图 ３　 再生培养基中不同铜浓度对沟叶结缕草愈伤
组织再生的影响
Ｆｉｇ． ３　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ
ｏｎ ｐｌａｎｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｚｏｙｓｉａ ｍａｔｒｅｌｌａ
２􀆰 ２　 愈伤组织及根、叶中铜的积累
试验表明，随着培养基中铜浓度的增高，沟叶结缕
草愈伤组织、再生植株根和叶中铜的含量都显著高于
对照（表 １、表 ２）。 在铜离子浓度为 ５００􀆰 ０ μＭ 时，愈
伤组织铜含量为对照的 １６􀆰 ５ 倍。 而长期处理与短期
处理相比，长期处理愈伤组织中的铜含量高于短期处
理愈伤组织中的铜含量 （表 １）。 在铜离子浓度为
５０􀆰 ０ μＭ时，再生植株叶的铜含量为对照的 ２ 倍，而根
的铜含量达到了对照的 ６ 倍。 根的铜含量远高于叶的
铜含量（表 ２）。
表 １　 不同铜浓度培养基继代培养下沟叶结缕草
愈伤组织中铜含量的变化
Ｔａｂｌｅ １　 Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｌｌｕｓ ｏｆ
Ｚｏｙｓｉａ ｍａｔｒｅｌｌａ ｕｎｄｅｒ ｃｏｐｐｅｒ ｓｔｒｅｓｓ
ａｆｔｅｒ ｃａｌｌｕｓ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ
铜浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｃｕ２ ＋ ／
μＭ
长期处理铜含量
Ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｃｕ２ ＋
ｉｎ ｌｏｎｇ⁃ｔｅｒｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ／
（μｇ·ｇ － １）
短期处理铜含量
Ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｃｕ２ ＋ ｉｎ
ｓｈｏｒｔ⁃ｔｅｒｍ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ／
（μｇ·ｇ － １）
０􀆰 １ ０􀆰 １２ ± ０􀆰 ０４ｇ ０􀆰 １１ ± ０􀆰 ０１ｈ
１􀆰 ０ ０􀆰 ２７ ± ０􀆰 ０１ｆ ０􀆰 ２３ ± ０􀆰 ０１ｇ
１０􀆰 ０ ０􀆰 ４３ ± ０􀆰 ０２ｅ ０􀆰 ３４ ± ０􀆰 ０１ｆ
５０􀆰 ０ ０􀆰 ５８ ± ０􀆰 ０１ｄ ０􀆰 ４３ ± ０􀆰 １０ｅ
１００􀆰 ０ ０􀆰 ８９ ± ０􀆰 ０４ｄ ０􀆰 ８９ ± ０􀆰 ０３ｄ
２００􀆰 ０ １􀆰 ０６ ± ０􀆰 １０ｃ １􀆰 １４ ± ０􀆰 ０５ｃ
３００􀆰 ０ １􀆰 ５９ ± ０􀆰 ０７ｂ １􀆰 ６６ ± ０􀆰 ０２ｂ
５００􀆰 ０ １􀆰 ９３ ± ０􀆰 ０３ａ １􀆰 ８３ ± ０􀆰 ０５ａ
表 ２　 不同铜浓度再生培养基培养下沟叶结缕草
再生植株根叶中铜含量的变化
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅａｆ ａｎｄ ｒｏｏｔ
ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ ｏｆ Ｚｏｙｓｉａ ｍａｔｒｅｌｌａ
ｕｎｄｅｒ ｃｏｐｐｅｒ ｓｔｒｅｓｓ
铜浓度
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｃｕ２ ＋ ／ μＭ
叶铜含量
Ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｃｕ２ ＋
ｉｎ ｌｅａｖｅｓ ／ （μｇ·ｇ － １）
根铜含量
Ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ Ｃｕ２ ＋
ｉｎ ｒｏｏｔｓ ／ （μｇ·ｇ － １）
０􀆰 １ ０􀆰 ０５１ ± ０􀆰 ００２ｃ ０􀆰 ０７１ ± ０􀆰 ００９ｄ
１􀆰 ０ ０􀆰 ０６１ ± ０􀆰 ００２ｂ ０􀆰 １３３ ± ０􀆰 ００６ｃ
１０􀆰 ０ ０􀆰 ０７８ ± ０􀆰 ００６ｂ ０􀆰 ２５０ ± ０􀆰 ０１０ｂ
５０􀆰 ０ ０􀆰 １０３ ± ０􀆰 ００５ａ ０􀆰 ４０７ ± ０􀆰 ０７０ａ
２􀆰 ３　 铜处理下愈伤组织、再生植株根及叶的酶活性变化
与对照 （０􀆰 １ μＭ）相比，在低浓度铜 （１􀆰 ０、１０􀆰 ０
μＭ）长期处理的愈伤组织体内的 ＣＡＴ、ＳＯＤ、ＰＯＤ 和
ＡＰＸ ４ 种酶活性均呈下降趋势，在 １０􀆰 ０ μＭ 时达到最
低值。 但随着铜浓度的继续增高，４ 种酶的活性又增
强，而在高浓度铜时，呈现下降趋势（图 ４）。
短期处理的愈伤组织中，ＰＯＤ、ＡＰＸ、ＳＯＤ 的活性
随着铜溶液的加入，一直处于上升趋势。 而 ＣＡＴ的活
性，随着铜浓度的增加，先呈现上升趋势，在 １０􀆰 ０ μＭ
后又出现下降趋势（图 ４）。
３６１
核　 农　 学　 报 ２９ 卷
图 ４　 不同浓度铜的继代培养基对沟叶结缕草愈伤组织 ＣＡＴ （Ａ），ＳＯＤ （Ｂ），ＰＯＤ（Ｃ）和 ＡＰＸ（ｄ）活性的影响
Ｆｉｇ． ４　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＣＡＴ （Ａ），ＳＯＤ （Ｂ），
ＰＯＤ（Ｃ） ａｎｄ ＡＰＸ（Ｄ） ｉｎ ｔｈｅ ｃａｌｌｕｓ ｏｆ Ｚｏｙｓｉａ ｍａｔｒｅｌｌａ ａｆｔｅｒ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅ
图 ５　 不同浓度铜的再生培养基对沟叶结缕草再生植株根和叶的 ＣＡＴ （Ａ），
ＳＯＤ （Ｂ），ＰＯＤ（Ｃ）和 ＡＰＸ（Ｄ）活性的影响
Ｆｉｇ． ５　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ ｏｎ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ＣＡＴ （Ａ）， ＳＯＤ （Ｂ）， ＰＯＤ（Ｃ） ａｎｄ
ＡＰＸ（Ｄ） ｉｎ ｒｏｏｔ ａｎｄ ｌｅａｆ ｏｆ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ ｏｆ Ｚｏｙｓｉａ ｍａｔｒｅｌｌａ
４６１
　 １ 期 沟叶结缕草愈伤组织生长及再生对铜胁迫的响应
在铜浓度较低时，再生植株叶片中 ４ 种活性酶变
化趋势基本一致。 与对照相比，４ 种酶的活性均显著
下降，在 １０􀆰 ０ μＭ 时达到最低值。 ＣＡＴ、ＰＯＤ 和 ＡＰＸ
的下降趋势比较显著，而 ＳＯＤ的下降幅度不显著。 随
着铜浓度的继续增大，４ 种酶的活性又增强。 叶片中 ４
种酶的变化趋势与长期处理中愈伤组织体内的变化趋
势一样（图 ５）。
在再生植株根中，ＰＯＤ和 ＳＯＤ的变化趋势与叶片
的大致相同。 随着铜浓度的增加，根中 ＰＯＤ 和 ＳＯＤ
的活性均呈现下降趋势，在 １０􀆰 ０ μＭ 时，与长期处理
中愈伤组织的酶活变化一样，出现一个比对照低的最
低值。 根中的 ＣＡＴ 活性随着铜浓度的增加而降低。
而 ＡＰＸ随铜浓度增大，呈先升高再降低的趋势，在 １􀆰 ０
μＭ时达到最高值（图 ５）。
２􀆰 ４　 铜处理下愈伤组织及根、叶中ＭＤＡ含量的变化
在低浓度铜（０􀆰 １、１􀆰 ０ μＭ）时，长期处理后愈伤组
织的 ＭＤＡ含量明显增高，但在 １０􀆰 ０ μＭ时下降，达到
最低值。 随着铜浓度的再增加，ＭＤＡ 的含量又出现了
升高的趋势，到 ３００􀆰 ０ μＭ 达最大，在 ５００􀆰 ０ μＭ 时下
降。 而短期处理中 ＭＤＡ 含量随着铜浓度升高持续增
加，仅在 ５００􀆰 ０ μＭ时出现下降趋势（图 ６）。
再生培养基中加入铜溶液后，叶中的 ＭＤＡ 含量
在 １０􀆰 ０ μＭ有稍微下降的趋势，但各浓度间没有显著
性差异。 而根中的 ＭＤＡ 随着铜浓度的升高而持续增
加，并且 １􀆰 ０ μＭ与对照无显著性差异，１０􀆰 ０、５０􀆰 ０ μＭ
与对照间有显著性差异（图 ７）。
图 ６　 不同浓度铜的继代培养基对沟叶结缕草
愈伤组织ＭＤＡ含量的影响
Ｆｉｇ． ６　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ
ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ＭＤＡ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｌｌｕｓ ｏｆ Ｚｏｙｓｉａ ｍａｔｒｅｌｌａ
２􀆰 ５　 铜对再生植株叶片中叶绿素含量的影响
随着铜浓度的增大，再生植株叶片中叶绿素 ａ 和
叶绿素 ｂ含量均呈现先上升后下降的趋势，说明低浓
度铜对叶绿素的合成有一定的促进作用。 在 １０􀆰 ０ μＭ
图 ７　 不同浓度铜的再生培养基对沟叶结缕草
再生植株根和叶的ＭＤＡ含量的影响
Ｆｉｇ． ７　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ
ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ＭＤＡ ｉｎ ｒｏｏｔ ａｎｄ ｌｅａｆ ｏｆ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ
ｏｆ Ｚｏｙｓｉａ ｍａｔｒｅｌｌａ ｄｕｒｉｎｇ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
时，叶绿素含量达到最大值，但差异并不显著。 而在
５０􀆰 ０ μＭ时，可能较高浓度铜的毒害作用，叶绿素 ａ 和
叶绿素 ｂ均呈下降趋势（图 ８）。
图 ８　 不同浓度铜的再生培养基对沟叶结缕草
再生植株叶片叶绿素含量的影响
Ｆｉｇ． ８　 Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ
ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｉｎ ｔｈｅ ｌｅａｆ ｏｆ
ｐｌａｎｔｌｅｔｓ ｏｆ Ｚｏｙｓｉａ ｍａｔｒｅｌｌａ
３　 讨论
本试验对继代培养中愈伤组织的生长及再生状况
的研究发现，在铜浓度为 １􀆰 ０、１０􀆰 ０ μＭ 时，愈伤组织
直径、鲜重增长率及再生率均高于对照，在 １０􀆰 ０ μＭ
达到最大值（图 １ ～图 ３）。 说明铜作为植物生长的必
５６１
核　 农　 学　 报 ２９ 卷
需微量元素，在高于 ＭＳ 基本培养基中铜含量的一定
浓度范围内对生长和发育有促进作用，即 ＭＳ 培养基
中的铜浓度并不是沟叶结缕草继代及再生的最适浓
度。 Ｄａｈｌｅｅｎ［２０］在大麦愈伤组织再生研究中也发现，
ＭＳ培养基中的铜浓度也并非大麦培养的最适浓度，与
本研究结果一致。 因此将 ＭＳ 培养基中铜浓度提高到
１０􀆰 ０ μＭ，有利于沟叶结缕草愈伤组织的继代及再生。
此外在再生植株叶绿素含量的变化研究中也得出相同
的结论。 同时，本试验表明，沟叶结缕草愈伤组织生长
的耐铜极限约为 ３００􀆰 ０ ～ ５００􀆰 ０ μＭ；而愈伤组织再生
植株的耐铜极限约为 ５０􀆰 ０ ～ １００􀆰 ０ μＭ。 愈伤组织再
生对外界胁迫的敏感性通常是明显高于愈伤组织生长
阶段，这在结缕草、沟叶结缕草耐盐和耐除草剂等筛选
中也得出过相同的规律［４，１２ － １３］。
大量研究表明过量铜离子能破坏植物细胞的氧化
还原反应，影响着抗氧化酶代谢、脂质、蛋白质及叶绿
素的代谢［２１ － ２５］，抗逆性强的植物可诱导产生更多的抗
氧化酶及其他非酶类抗氧化剂，以抵御活性氧氧化损
伤与致死效应［２６］。 草坪草跟其它植物一样，在逆境下
会利用抗氧化物酶及代谢反应来抵抗逆境胁迫［２５］。
本试验在短时间铜胁迫下，愈伤组织中 ＳＯＤ、ＰＯＤ 和
ＡＰＸ ３ 种酶的活性随着铜浓度的升高会持续增加，
ＣＡＴ活性表现出先增加后降低的趋势。 结果表明在
较高浓度铜胁迫下，ＳＯＤ、ＰＯＤ 和 ＡＰＸ 的活性能维持
或提高，ＣＡＴ的活性仅在较低铜浓度（≤１０􀆰 ０ μＭ）下
维持。 在长期铜胁迫下，所有愈伤组织中的抗氧化物
酶（ＣＡＴ、ＳＯＤ、ＰＯＤ和 ＡＰＸ）在铜浓度为 １０􀆰 ０ μＭ 时，
均低于对照组的值，而当铜浓度超过 １０􀆰 ０ μＭ 时，几
种抗氧化物酶均出现先升高后下降的趋势。
当植物受到逆境胁迫时，体内活性氧积累会导致
细胞膜系统产生变性，积累许多过氧化产物如 ＭＤＡ。
因此在重金属胁迫下 ＭＤＡ 含量常常作为评价脂质氧
化反应的一个指标。 在铜胁迫下，沟叶结缕草出现脂
质氧化反应，所以短期处理及再生植株的根中 ＭＤＡ
含量会随着铜含量的升高而升高，但长期处理中 ＭＤＡ
含量 １０􀆰 ０ μＭ 低于对照及其它处理组。 再生植物叶
中 ＭＤＡ含量在各浓度间并没有显著性差异。 根叶中
ＭＤＡ的不同变化是由于铜的大量积累对沟叶结缕草
生物膜造成伤害，导致了细胞结构及功能受到损伤，甚
至细胞凋亡［２７］。 以上结果说明根中 ＭＤＡ的含量远远
小于叶中 ＭＤＡ的含量。
长期和短期处理中 ４ 种酶活性的变化说明 ４ 种酶
都参与抗氧化反应。 而 ２ 种处理中抗氧化物酶对铜胁
迫的不同反应，表明铜对愈伤组织的胁迫危害与处理
时间的长短有关。 短期处理中抗氧化物酶的活性持续
增强表明，短期处理中愈伤组织处于适应性生长阶段，
愈伤组织对短期的铜胁迫有一定的抗性。 与短期处理
不同，沟叶结缕草愈伤组织经过长期的铜胁迫，形成了
生理适应。 抗氧化酶活性、ＭＤＡ 含量经渗透调节等作
用维持在一个比较稳定的水平，以提高自身的适应和
抵抗能力。 在 １０􀆰 ０ μＭ 时愈伤组织生长及再生状况
最好，表明 １０􀆰 ０ μＭ 是其最适生长的浓度。 此时，活
性氧的产生与清除可能处于动态平衡状态，自由基水
平低，因此在 １０􀆰 ０ μＭ 时，４ 种酶活及 ＭＤＡ 含量都出
现了最低值。
４　 结论
本文研究了沟叶结缕草愈伤组织生长及再生对铜
胁迫的响应，试验表明沟叶结缕草愈伤组织过氧化物
酶活性的提高和维持与其耐铜胁迫有着密切的联系。
沟叶结缕草愈伤组织对短期及长期铜胁迫有着不同的
生理适应反应。 长期处理试验，较低铜浓度和较高铜
浓度都会激活愈伤组织的抗氧化反应。 不同铜浓度下
沟叶结缕草愈伤组织生长及再生状况，表明 ＭＳ 培养
基中的铜浓度并不是沟叶结缕草继代及再生的最适浓
度，愈伤组织沟叶结缕草的最适生长及再生铜浓度在
１０􀆰 ０ μＭ左右，愈伤组织生长及再生的耐铜极限分别
在 ３００􀆰 ０ ～ ５００􀆰 ０ μＭ、５０􀆰 ０ ～ １００􀆰 ０ μＭ。 本研究得出
的沟叶结缕草愈伤组织适合生长的铜浓度、以及抑制
生长及致死的浓度范围，为筛选耐铜沟叶结缕草体细
胞变异提供了参考。
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Ｔｈｅ Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｏｆ Ｃａｌｌｕｓ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ｐｌａｎｔ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ
ｏｆ Ｚｏｙｓｉａ ｍａｔｒｅｌｌａ ｔｏ Ｃｏｐｐｅｒ Ｓｔｒｅｓｓ
ＳＨＡＯ Ｌｉｄａ　 ＷＵ Ｙａｎｇｅ　 ＢＩ Ｂｏ　 ＣＨＡＩ Ｍｉｎｇｌｉａｎｇ
（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ， Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ｚｈｅｊｉａｎｇ　 ３１００５８）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｃａｌｌｕｓ ｏｆ Ｚｏｙｓｉａ ｍａｔｒｅｌｌａ ｓｕｂｃｕｌｔｕｒｅｄ ｆｏｒ ９ ｙｅａｒｓ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｉｔｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｔｏ ｃｏｐｐｅｒ ｓｔｒｅｓｓ
ｄｕｒｉｎｇ ｃａｌｌｕｓ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ． Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ ｏｎ ｃａｌｌｕｓ ｄｉａｍｅｔｅｒ， ｇｒｏｗｔｈ
ｒａｔｅ ｏｆ ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ ａｎｄ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｒａｔｅ， ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｎｚｙｍｅｓ （ＣＡＴ， ＰＯＤ， ＳＯＤ ａｎｄ ＡＰＸ）， ｔｈｅ
ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ， ＭＤＡ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｌｌｕｓ， ｔｈｅ ｌｅａｆ ａｎｄ ｒｏｏｔ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ｃｏｕｒｓｅｓ ｏｆ ｃａｌｌｕｓ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｐｌａｎｔ
ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｅｖａｌｕａｔｅｄ． Ｉｔ ｗａｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃａｌｌｕｓ ｄｉａｍｅｔｅｒ， ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ ｏｆ ｆｒｅｓｈ ｗｅｉｇｈｔ， ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｒａｔｅ ａｎｄ
ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｌｅａｆ ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｌｌ ｒｅａｃｈｅｄ ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ ｗｈｅｎ ｃｏｐｐｅｒ ａｔ １０􀆰 ０ μＭ， ａｎｄ ｔｈｅ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ
ｆｏｒ ｃａｌｌｕｓ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｐｌａｎｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｂｅｔｗｅｅｎ ３００􀆰 ０ ｔｏ ５００􀆰 ０ μＭ ａｎｄ ５０􀆰 ０ ｔｏ １００􀆰 ０ μＭ， ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ． Ａｆｔｅｒ
ｌｏｎｇ⁃ｔｅｒｍ ｃａｌｌｕｓ ｇｒｏｗｔｈ ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ （１２ ｗｅｅｋｓ） ｏｒ ｐｌａｎｔ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ （２４ ｗｅｅｋｓ）， ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ４ ｋｉｎｄｓ ｏｆ
ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ｅｎｚｙｍｅｓ， ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ＭＤＡ ａｔ １０􀆰 ０ μＭ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈｅ ｌｏｗｅｓｔ ｌｅｖｅｌｓ； ｗｈｉｌｅ ａｆｔｅｒ ｓｈｏｒｔ⁃ｔｅｒｍ （１０
ｄａｙｓ） ｃａｌｌｕｓ ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｌｔｕｒｅ， ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｅｘｃｅｐｔ ＣＡＴ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｒｉｓｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｃｏｐｐｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ． Ｔｈｅ
ｃｏｎｔｅｎｔｓ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｃａｌｌｕｓ， ｌｅａｆ ａｎｄ ｒｏｏｔ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ ｐｌａｎｔｌｅｔｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｒｉｓｉｎｇ ｏｆ ｃｏｐｐｅｒ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ ｍｅｄｉａ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｚｏｙｓｉａ ｍａｔｒｅｌｌａ， ｃａｌｌｕｓ， ｃｏｐｐｅｒ ｓｔｒｅｓｓ， ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ
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