全 文 ：核 农 学 报 2010，24(6):1262 ～ 1268
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
文章编号:1000-8551(2010)06-1262-07
土壤中土霉素残留的高效液相色谱检测方法
范菲菲1，2 李兆君2 龙 健1 齐瑞环2 梁永超2
(1. 贵州师范大学地理与环境科学学院，贵州 贵阳 550001;
2. 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所 /农业部作物营养与施肥重点实验室，北京 100081)
摘 要:为有效测定土壤中土霉素残留量，建立了固相萃取 －高效液相色谱法提取以及测定潮土、红壤、
紫色土中土霉素残留量的方法。土壤中土霉素残留经提取缓冲溶液进行有效提取，经过 DVB 固相萃取
小柱纯化、无水甲醇洗脱和氮气流浓缩后，经 HPLC 测定。对提取缓冲液、流动相以及流动相 pH 值、有
机相与无机相的比例以及流速等测定条件进行优化研究。结果表明:提取液为 Na2EDTA-Mcllvaine，流
动相为乙腈 ∶ 0. 01mol /L 磷酸二氢钠(pH 值 2. 5，V∶ V = 10 ∶ 90)，温度 25℃，流速 1. 2ml /min，检测波长
350nm 对 3 种不同性质的土壤中土霉素残留量的测定最为合适。应用本方法进行土壤中土霉素残留量
的测定，土霉素含量与峰面积具有良好的线性关系，相关系数(n = 9)分别为红壤 0. 997，紫色土 0. 995，
潮土 0. 987;检出限分别为红壤 0. 11mg /kg，紫色土 0. 17mg /kg，潮土 0. 09mg /kg;回收率(n = 18)分别为
红壤 80. 7% ～ 128. 8%，紫色土 70. 5% ～ 100. 0%，潮土 61. 5% ～ 103. 9%;相对标准偏差(RSD，n = 18)
分别为红壤 7. 1% ～ 28. 2%，紫色土 11. 9% ～ 38. 1%，潮土 4. 1% ～ 17. 0%。本方法简便、准确，适合于
测定不同土壤中土霉素残留量，结果可靠。
关键词:土霉素含量;高效液相色谱法;土壤
收稿日期:2010-03-10 接受日期:2010-04-06
基金项目:国家自然科学基金(40701163)，国际科学基金(IFS，No. C /4076)，北京市自然科学基金(6092019)
作者简介:范菲菲(1986-)，女，黑龙江嫩江人，硕士研究生，主要从事生态毒理方面的研究。Tel:010-82106727;E-mail:01fanfeifei@ 163. com
通讯作者:李兆君(1974-)，男，山西应县人，博士，副研究员，主要从事农田物质循环与环境方面的研究。Tel:010-82108657;E-mail:zjli@ caas. ac. cn
DETERMINATION OF OXYTETRACYCLINE IN SOILS WITH HIGH
PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPGY
FAN Fei-fei1，2 LI Zhao-jun1 LONG Jian2 QI Rui-huan1，2 LIANG Yong-chao1
(1. College of Geographical and Environmental Sciences，Guizhou Normal University，Guiyang，Guizhou 550001;
2. Institute of Agricultural Resources and Regional Planning，Chinese Academy of Agricultural Sciences / Ministry of Agriculture Key Laboratory
of Crop Nutrition and Fertilization，Beijing 100081)
Abstract:In order to accurately determine the content of oxytetracycline (OTC) resiudes in soils，the combination
method of soild phase extraction and high performance liquid chromatography (HPLC)was developed in the present
paper. The fluvo-aquic soil，red soil，and purplish soil were used as materials. OTC was extracted from soil samples by
extraction buffer，purified by solid phase extraction column followed by elution with anhydrous methanol，and then
concentrated by nitrogen flow. OTC in the solution was determined by HPLC. In this study，separation parameters were
optimized including the extraction buffer solution，the buffer pH value，the rate of organic phase over inorganic phase，
and flow rate. The results were present as follows. The optimal extraction buffer solution was Na2EDTA-Mcllvaine，and
the optimal mobile phase was acetonitrile -NaH2PO4with pH 2. 5，V∶ V = 10∶ 90. The column temperature was 25℃，and
the flow rate was 1. 2ml /min. The determine wavelength was 350nm. The significant linearity correlation was observed
between OTC concentration in soils and peak area. The correlation coefficient values (n = 9)were 0. 997 for red soil，
0. 995 for purplish soil，and 0. 987 for fluvo-aquic soils，respectively. The values of detection limit of the developed
2621
6 期 土壤中土霉素残留的高效液相色谱检测方法
method were 0. 11mg /kg for red soil，0. 17mg /kg for purplish soil，and 0. 09mg /kg for fluvo-aquic soil respectively.
Recoveries of oxytetracycline in three soils were 80. 7% ～ 128. 8% for red soil，70. 5% ～ 100. 0% for purplish soil，and
61. 5% ～ 103. 9% for fluvo-aquic soil，respectively. The values of relative standard deviations (RSD)were 7. 1% ～
28. 2% for red soil，11. 9% ～ 38. 1% for purplish soil，and 4. 1% ～ 17. 0% for fluvo-aquic soil，respectively. The
developed method was simple and accurate，which was suitable for OTC determinine in soils.
Key words:oxytetracycline content;high performance liquid chromatography method;soil
近年来，随着集约化畜牧业以及配合饲料工业的
发展，四环素类、大环内酯类、青霉素类、氨基糖类和磺
胺 /甲氧苄氨嘧啶类抗生素作为饲料添加剂被越来越
广泛地应用于畜禽养殖业和水产养殖业中［1，2］。据统
计，欧共体养殖业每年的抗生素消耗量达 5000 多
吨［3］;美国动物养殖业每年的抗生素用量约为11，000
多吨，约占抗生素总用量的 70% ［4］;我国抗生素总用
量约为美国的 600 倍。在所使用的抗生素中，土霉素
(Oxytetracycline，OTC)和四环素(Tetracycline)等四环
素类抗生素是应用最广泛、使用量最大的一类抗生
素［5］。我国畜禽粪便土霉素平均含量为 9. 09mg /
kg［6］。另据报道，我国农村每年畜禽粪便产生量达 40
亿吨［7］，80%以上的畜禽粪便没有经过综合处理，直
接被施于农田，经动物粪便排出的各种抗生素及其代
谢产物极易进入农田土壤环境中，导致各种抗生素尤
其是土霉素等在土壤环境中的累积［8］，降低土壤生物
活性，减弱土壤的生物功能［9 ～ 11］。因此，目前急需建
立一种适合于检测土壤中土霉素等四环素类抗生素残
留的方法，以探明我国农田土壤中四环素类抗生素的
残留及转化情况，实现我国农产品安全和农业可持续
发展。然而，目前关于土霉素等抗生素残留的测定方
法大多是基于畜禽蛋肉、乳制品、动物组织、水产品、饲
料和蜂胶等介质中四环素类抗生素中的提取及测定建
立起来的，如王立君等［12］建立了猪肉中四环素类药物
残留的测定方法;许传梅等［13］建立了肉类及水产品中
四环素类抗生素残留量的测定方法;宋慧敏等［14］建立
了饲料中土霉素的测定方法;修丽华等［15］建立了畜、
禽肉中土霉素残留量的测定方法;乔坤云［16］建立了鸡
肝中土霉素、金霉素、四环素的测定方法;徐春明等［17］
建立了简单流动相测定土霉素含量的方法;余永新
等［18］建立了鸡肉中 5 种四环素类药物残留量的测定
方法;刘虹等［19］建立了城市污水中氯霉素和四环素类
抗生素的测定方法;胡献刚等［20］建立了畜牧粪便中
13 种抗生素药物残留的测定方法，鲜见关于土壤中四
环素类抗生素残留的提取及测定方法的报道。我国土
壤种类繁多，其性质和畜禽蛋肉等农产品具有较大的差
异，因此，难以将上述介质中霉素等的测定方法直接应
用于土壤中。鉴于此，本试验在借鉴上述方法的基础
上，选取性质差异较大、代表性较强的潮土、红壤和紫色
土 3 种土壤为供试土壤，优化和建立了土壤中土霉素残
留的提取及测定方法，以期为探明土霉素在农田土壤中
的残留及其转化提供方法依据。
1 材料与方法
1. 1 供试土壤
供试土壤为潮土、红壤和紫色土 3 种土壤。其中
潮土和红壤分别采自中国农业科学院农业资源与农业
区划研究所北京昌平试验站和湖南祁阳红壤试验站，
紫色土采自西南大学农田试验基地。3 种土壤均为未
受土霉素等抗生素污染的农田耕层(0 ～ 20cm)土壤，
土壤采集后，风干，过 2mm 筛备用。其基本理化性状
见表 1。
表 1 供试土壤基本理化性质
Table 1 Physical and chemical properties of used soils
土壤类型
soil type
有机质
OM (%)
pH
(土 ∶水 = 1∶ 2. 5
soil∶ water = 1∶ 2. 5)
阳离子交换量
CEC (cmol / kg)
土壤粒径组成
soil partical size composition (mm)
2 ～ 0. 02 0. 02 ～ 0. 002 < 0. 002
潮土 fluvo-aquic soil 0. 55 7. 89 6. 10 60. 18 21. 09 18. 70
红壤 red soil 2. 00 5. 02 13. 30 31. 2 42. 3 23. 9
紫色土 purplish soil 1. 19 7. 41 24. 03 30. 17 53. 94 19. 38
3621
核 农 学 报 24 卷
1. 2 主要仪器与试剂
安捷伦 1100 型高效液相色谱仪;Speedisk Column
H2O-Philic DVB 萃取小柱:3ml，100mg 填料;Aglient
ZORBAX SB-C18(3. 5μm，4. 6mm × 150mm)色谱柱;土
霉素(Oxytetracycline Hydrochloride，OTC)，分子式:C22
H24N2O9，分子量:496. 90，纯度≥98%，购于德国默克
公司;甲醇、乙腈均为色谱纯 (美国 Fisher 公司);其他
试剂均为分析纯;试验用水为 Millipore 超纯水。
1. 3 土霉素标准溶液及提取缓冲溶液的配制
1. 3. 1 土霉素标准品溶液 精确称取土霉素标准品
0. 0600g 于 100ml 容量瓶中，加入少量 1mol /L 盐酸溶
解，然后用超纯水定容至 100ml，制成 600mg /L 标准品
贮备液，4℃保存备用。
1. 3. 2 Na2EDTA-Mcllvaine 提取缓冲溶液的配制 分
别称取柠檬酸(C6H8O7·H2O)12. 9000g、磷酸氢二钠
(Na2HPO4·12H2O)71. 6280g，EDTA-2Na 37. 2000g 于
100ml 烧杯中，加少量超纯水溶解后，转移至 1000ml 容
量瓶中，加适量超纯水，用 0. 1mol /L HCl 调节 pH 至
4. 000 ± 0. 005，最 后 用 超 纯 水 定 容，即 为 EDTA-
McIIlvaine 提取缓冲液，放于 4℃冰箱中保存备用［21 ～ 24］。
1. 4 样品前处理方法
1. 4. 1 土壤样品中土霉素的提取 精确称取 2. 000g
不同土霉素含量的土壤样品于 50ml 离心管(T1)中，
加入一定量的提取液，提取液设 5% 高氯酸(提取液
A)和 0. 01mol /L Na2EDTA － Mcllvaine(pH 为 4. 0，提
取液 B)2 种，旋涡混合 30s，超声一定时间，3000r /
min 离心 5min，倾出上清液于另一干净的 50ml 离心
管(T2)中。向离心管 T1 中再加入一定量的提取液，
重复以上提取步骤 2 次，合并上清液于离心管 T2 中，
12000r /min 离心 10min，离心所得上清液即为土霉素
待测液。其中提取液加入量设 3 个，分别为 10ml(4 +
4 + 2，即第 1 次提取加入提取液 4ml，第 2 次提取加入
4ml，第 3 次提取加入 2ml)、15ml(5 + 5 + 5，即第 1 次
提取加入提取液 5ml，第 2 次提取加入 5ml，第 3 次提
取加入 5ml)和 20ml(10 + 5 + 5，即第 1 次提取加入提
取液 10ml，第 2 次提取加入 5ml，第 3 次提取加入
5ml)提取液对土壤中土霉素进行了提取。超声时间
分别设 3、8、13 和 18 min。
1. 4. 2 待测液纯化和洗脱 用 Speedisk Column H2O-
Philic DVB 萃取小柱对上述所得到的待测液进行纯化
和洗脱。首先用 6ml 无水甲醇和 8ml 提取液对固相萃
取小柱进行活化，然后加入待测液，待待测液全部通过
小柱后，用 12ml 超纯水冲洗固相萃取小柱，之后再用
10ml 无水甲醇进行洗脱。
1. 4. 3 土霉素样品浓缩 将上述收集到的洗脱液，用
氮气流在 50℃ 条件下吹干，之后精确加入 1ml 流动
相，超声 10min，用 0. 45μm 尼龙微孔滤膜进行过滤，
滤液用于高效液相色谱(HPLC)分析。
1. 5 高效液相色谱法测定滤液中土霉素含量
以甲醇 ∶乙腈 ∶ 0. 01mol /L 草酸和乙腈 ∶ 0. 01mol /L
NaH2PO4 为流动相对待测液中的土霉素进行分离，以
确定合适的流动相，再对流动相的相关条件进行优化
选择。其中乙腈 0. 1mol /L 磷酸二氢钠溶液流动相的
pH 设 2. 0、2. 5 和 3. 0，二者的比例设为 15 ∶ 85 和 10 ∶
90;流速设 0. 8、1. 0 和 1. 2ml /min。柱温:25℃，紫外
检测器，检测波长 350nm，HP1100 型自动进样器进样，
进样量为 20μl。
1. 6 土霉素液标准曲线制备与回收率
1. 6. 1 标准曲线制备 采用梯度稀释法，将土霉素标
准品储备液准确配制成浓度分别为 0. 4、4、20、40、80、
160 和 400mg /L 的土霉素标准工作液，准确吸取上述
标准工作液各 0. 5ml，加入 2. 000g 风干的空白供试土
壤中，使土壤中土霉素含量分别为 0. 10、1. 0、5. 0、
10. 0、20. 0、40. 0 和 100. 0mg /kg，每个浓度重复 6 次，
充分混匀，用超纯水调节土壤含水量为土壤最大田间
持水量的 80%，于 25℃ 生化培养箱中暗培养平衡
12h，按样品前处理项下的方法进行试验。然后进行标
准曲线制备。
1. 6. 2 回收率试验 采用梯度稀释法，将土霉素标准
品储备液配制成浓度分别为 20、200 和 400mg /L 的土
霉素工作液，准确吸取上述工作液各 0. 5ml，均匀加入
2. 000g 风干的空白供试土壤中，使土壤中土霉素含量
分别为 50、100 和 150mg /kg，每个浓度重复 6 次，充分
混匀。用超纯水调节土壤含水量为最大田间持水量的
80%，于 25℃生化培养箱中暗培养平衡 12h，按样品前
处理项下的方法进行试验。测定后计算各试验土壤中
土霉素的相对回收率。
1. 7 数据处理
所有试验数据均采用专业版的统计分析软件
DPSv3. 11 处理，处理之间差异显著性采用 LSD 法进行
分析比较(P < 0. 05)。
2 结果与分析
2. 1 提取液的选择
采用目前其他介质土霉素测试方法中较为常用的
提取液如对土壤中土霉素进行了提取，结果如图 1 所
示。提取液 A 和提取液 B 均能够在一定程度上将土
4621
6 期 土壤中土霉素残留的高效液相色谱检测方法
壤中土霉素有效提取出来，且提取液 B 的提取效率明
显高于提取液 A。相同条件下，土壤中土霉素经提取
液 B 提取后，经 HPLC 测定的峰面积为 285. 56，而经
提取液 A 提取后，峰面积仅为 55. 67，两者相差约 5
倍。此外，由于霉素在强酸性条件下(pH < 2. 0)，易
于降解为脱水产物，加热时又可转变为差向异构体，
而 5%高氯酸溶液 pH 小于 2. 0，因此，选取 5%高氯酸
溶液作为土壤中土霉素的提取也是不合适的。因此，
选用 含 有 EDTA 的 弱 酸 性 的 0. 1mol /L EDTA -
Mcllvaine 缓冲溶液作为提取土壤中土霉素残留的提
取液较为合适。
图 1 提取液组成对土壤中土霉素分离效果的影响
Fig. 1 Effects of extract solution composition on
isolation of oxytetracycline(OCT)in soils
A 表示提取液为 5%高氯酸，B 表示提取液为 0. 1mol / L
Na2 EDTA-Mcllvaine 缓冲溶液，箭头所指的峰为土霉素峰，下同。
A，and B indicate the extract solutions are 5% HClO4，and 0. 1mol / L
Na2 EDTA-Mcllvaine buffer，respectively. Peak marked by
arrowhead indicates oxytetracycline peak，the same as following figures.
2. 2 提取液加入量的选择
确定提取液后，我们进行了提取液加入量对土壤
中土霉素提取效果影响的研究。分别在 2g 土壤中加
入 10、15 和 20ml 提取液对土壤中土霉素进行了提取。
提取液加入量不同得到的峰面积也不同(见表 2)。其
中加入量为 15ml 时，所得峰面积最大。如当土壤中土
霉素的添加浓度为 20mg /kg，提取液加入量为 10ml
时，所得峰面积明显小于提取液加入量为 15ml 和
20ml 的处理，且提取液加入量为 20ml 的峰面积略小
于提取液加入量为 15ml 的，但两者所得的峰面积相差
不明显。当土壤中土霉素的添加浓度为 40mg /kg 时，
提取液加入量为 15ml 时，峰面积为 284. 13，明显高于
加入量为 10ml 和 20ml 时的峰面积。因此，选择在 2g
土壤中加入 15ml 提取液是较为合适的。
2. 3 超声时间的选择
确定提取液及其加入量后，将每次土霉素提取过
程中的超声时间分别设为 3、8、13 和 18min(表 3)。由
表 3 可知，超声时间对土霉素峰面积有较大的影响，随
着超声时间的延长，土霉素样品的峰面积先逐渐增加
而后降低，不管土壤中土霉素添加浓度为 20mg /kg 还
是 40mg /kg，均以超声时间为 8min 时，土霉素的峰面
积最大。因此，每次提取时选择超声时间为 8min 较为
合适。
表 2 提取液加入量对土霉素出峰面积的影响
Table 2 Effects of extract solution amount on
oxytetracycline peak area
提取液加入量
extract solution
amount (ml)
土霉素添加浓度
concentration of OTC (mg /kg)
20 40
10 76. 12 ± 3. 62 c 282. 67 ± 19. 00 a
15 109. 12 ± 6. 07 a 284. 13 ± 9. 58 a
20 103. 67 ± 1. 02 b 252. 52 ± 16. 48 b
表 3 超声时间对土霉素出峰面积的影响
Table 3 Effects of ultrasonic time on
oxytetracycline peak area
超声时间
ultrasonic time (min)
土霉素添加浓度 concentration of OTC(mg /kg)
20 40
3 90. 03 ± 10. 34 b 177. 2 ± 13. 27 b
8 116. 13 ± 8. 20 a 197. 12 ± 3. 76 a
13 81. 38 ± 14. 18 b 141. 65 ± 13. 52 c
18 80. 30 ± 3. 78 b 139. 28 ± 11. 32 c
2. 4 色谱分离条件的优化
2. 4. 1 流动相的选择 分别以甲醇 ∶ 乙腈 ∶ 0. 01mol /L
草酸和乙腈 ∶ 0. 01 mol /L NaH2PO4 为流动相对待测液
中的土霉素进行分离，结果如图 2 所示。由图 2 可知，
相同条件下，流动相为用甲醇 － 乙腈 － 0. 01mol /L 草
酸混合液时(图 2 － A)，出现连峰现象，不能实现土霉
素样品很好的分离。而当流动相为乙腈 － 0. 01mol /L
NaH2PO4 混合液时(图 2 － B)，土霉素样品分离效果
较好，没有连峰现象，可以较好地将土霉素样品与杂质
分开。
2. 4. 2 流动相 pH 的选择 在确定合适的流动相后，
5621
核 农 学 报 24 卷
图 2 流动相组成对土霉素分离效果的影响
Fig. 2 Effects of mobile phase composition
on isolation of oxytetracyline by HPLC
A 表示流动相为甲醇 －乙腈 － 0. 01mol / L 草酸混合液;
B 表示流动相为乙腈 － 0. 01mol / L NaH2 PO4 混合液
A indicates the composition of mobile phase was methanol-acetonitrile-
0. 01mol / L oxalic acid mixture;B indicated the composition of mobile
phase was acetonitrile － 0. 01mol / L NaH2 PO4
研 究 发 现 流 动 相 乙 腈 ∶ 0. 01mol /L NaH2PO4 中
0. 01mol /L NaH2PO4 溶液的 pH 值对土霉素的分离效
果具有较大的影响(图 3)。当 0. 01mol /L NaH2PO4 溶
液的 pH 值为 2. 0 和 3. 0 时，土霉素样品均出现连峰现
象(图 3 － A、C)，不能实现土霉素与杂质的完全分离。
而当 0. 01mol /L NaH2PO4 溶液的 pH 值为 2. 5 时(图
3 － B)，能够实现土霉素样品峰与杂质的很好分离，能
够满足测定的分离要求。
2. 4. 3 流动相中乙腈和 0. 01 mol /L NaH2PO4 溶液比
例的选择 由图 4 可知，当流动相中乙腈和 0. 01mol /
L NaH2PO4 溶液的体积比分别为 10 ∶ 90 和 15 ∶ 85 时，
土霉素与杂质的分离效果是不同的。当乙腈和
0. 01mol / L NaH2PO4 溶液的比例为 15∶ 85(图 4 － A)和
10∶ 90(图 4 － B)时，均能够在一定程度上实现土霉素
样品的分离，且 15∶ 85 条件下的土霉素样品峰明显高
于 10∶ 90，但是当比例为 15 ∶ 85 时，不能够实现土霉素
样品与杂质的很好分离。故而选择 10∶ 90 作为流动相
中乙腈和 0. 01mol /L NaH2PO4 溶液的比例来分离土霉
素样品是较为合适的。
2. 4. 4 流速的选择 由图 5 可知，流速分别为 0. 8，
图 3 流动相 pH 对土霉素分离效果的影响
Fig. 3 The effect of pH in mobile phase on
isolation of oxytetracycline by HPLC
A，B，C 分别表示 pH 为 2. 0，2. 5 和 3. 0
A，B，C indicate pH 2. 0，2. 5，and 3. 0，respectively
1. 0 和 1. 2ml /min 对土霉素样品出峰时间有一定影
响，但是对土霉素样品峰形没有明显的影响。当流速
为 1. 2ml /min 时，土霉素的出峰时间约为 12. 8min，而
当流速为 0. 8 和 1. 0ml /min 时，土霉素的出峰时间则
分别约为 19. 9 和 15. 2min，明显长于流速 1. 2ml /min
时的出峰时间。由此可见，选择为 1. 2ml /min 作为
HPLC 检测土霉素样品的流速能够明显缩短土霉素样
品的出峰时间，提高仪器的分析效率。
2. 5 线性回归方程、相关系数和检出限
取 0. 5ml 不同浓度的土霉素标准工作液分别加入
到 2g 土壤中，配制成浓度范围为 0. 1 ～ 100mg /kg 的含
有土霉素的土壤样品，按照上述研究得出的土壤中土
霉素残留提取、样品前处理方法和测定条件进行测定，
并进行回归等分析，结果见表 4。由表 4 可知，在此浓
度范围内，3 种土壤中土霉素含量与峰面积均呈良好
的线性关系，不同土壤 R 值分别为红壤 0. 997、紫色土
0. 995 和潮土 0. 987。分别配制土壤中土霉素含量为
5mg /kg 的 3 种土壤样品，每一种土壤做 12 次重复，以
3 倍信噪比(S /N = 3)，求得不同土壤的检出限［25］见表
6621
6 期 土壤中土霉素残留的高效液相色谱检测方法
图 4 流动相中乙腈和 0. 01mol / L NaH2 PO4 溶液
比例对土霉素分离效果的影响
Fig. 4 Effects of proportion of acetonitrile and
0. 01mol /L NaH2PO4 in mobile phase on
isolation of oxytetracycline
A 为乙腈 ∶ 0. 01mol / L NaH2 PO4 = 15∶ 85;
B 为乙腈 ∶ 0. 01mol / L NaH2 PO4 = 10∶ 90
A，and B indicate the proportion of acetonitrile ∶ 0. 01mol / L
NaH2 PO4 in mobile phase were 15∶ 85 and 10∶ 90，respectively
4。本方法测定土壤中土霉素含量的检出限为 0. 09 ～
0. 17mg /kg，其中对潮土中土霉素含量的测定限最低。
表 4 线性回归方程、相关系数和检出限
Table 4 Regression equation，correlation
coemcient and detection limit
土壤类型
soil type
回归方程
regression
equation
相关系数
correlation
coefficient
检出限
detection limit
(mg /kg)
红壤 red soil Y = 11. 75X － 100 0. 997 0. 11
紫色土 purple soil Y = 8. 988X － 145. 5 0. 995 0. 17
潮土 moisture soil Y = 10. 08X － 11. 11 0. 987 0. 09
注:X:土壤中土霉素样品浓度，mg /kg;Y:样品峰面积。
Note:X:concentration of OTC in soils;Y:peak area of the sample。
2. 6 土霉素相对回收率及标准偏差
按照上述优化后的样品前处理和测定的步骤对配
制土霉素浓度分别为 5、50、100mg /kg 的 3 种土壤，进行
处理和测定，计算土霉素的相对回收率和相对标准偏差
(结果见表 5)［26］。从表 5 可知，土壤中土霉素样品的相
对回收率介于 61. 5% ～ 128. 8%，其中潮土中土霉素的
相对回收率为61. 5% ～ 103. 9%，红壤中为 80. 7% ～
128. 8%，紫色土中为 70. 5% ～ 100. 0%。测定的相对标
准偏差介于 4. 1% ～ 38. 1%，其中潮土中为 4. 1% ～
17. 0%，红壤中为7. 1% ～ 28. 2%，紫色土中为 11. 9% ～
38. 1%。由此可见，应用本方法进行土壤中土霉素含量
的测定能够得到较好的准确度和精密度。
图 5 流速对土霉素分离效果的影响
Fig. 5 Effects of flow rate on isolation of oxytetracycline
A，B 和 C 分别表示流速为 0. 8、1. 0 和 1. 2ml /min
A，B and C indicate flow rates were 0. 8，1. 0 and 1. 2ml /min，respectively
表 5 3 种土壤中土霉素的相对回收率与相对标准偏差
Table 5 Recoveries and relative standard deviations (RSD)
土霉素浓度
concentration of OTC (mg /kg)
相对回收率 relative recovery (%) 相对标准偏差 RSD(%)
潮土
fluvo-aquic soil
红壤
red soil
紫色土
purplish soil
潮土
fluvo-aquic soil
红壤
red soil
紫色土
purplish soil
5 61. 5 80. 7 70. 5 6. 5 7. 1 11. 9
50 103. 9 128. 8 74. 8 17. 0 28. 2 38. 1
100 90. 0 95. 0 100. 0 4. 1 11. 3 14. 6
7621
Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2010，24(6):1262 － 1268
3 结论
通过对提取剂、色谱条件等影响土霉素检测结果
的因素进行比较分析，建立和优化了土壤中土霉素的
提取与测定方法。利用固相萃取结合高效液相色谱测
定土壤中土霉素的含量，具体为:采用 Na2EDTA －
Mcllvaine 作为提取液，在 2g 土壤中加入提取液 15ml，
超声提取 3 次，每次加入提取液 5ml，超声时间为
8min，提取液采用 DVB 固相萃取小柱纯化、无水甲醇
洗脱和氮气流浓缩。待测液中的土霉素采用 HPLC 进
行测定，测定条件为:流动相为乙腈 － 0. 01mol /L 磷酸
二氢钠(pH 值为 2. 5，V∶ V = 10 ∶ 90)，柱温为 25℃，流
速为 1. 2ml /min，检测波长 350nm。应用本方法进行
土壤中土霉素残留的测定时，土霉素含量与峰面积具
有良好的线性关系，相关系数(n = 9)分别为红壤
0. 997，紫色土 0. 995，潮土 0. 987;检出限分别为红壤
0. 11mg /kg，紫色土 0. 17mg /kg，潮土 0. 09mg /kg。相
对回收率(n = 18)分别为红壤 80. 7% ～ 128. 8%，紫色
土 70. 5% － 100. 0%，潮土 61. 5% ～ 103. 9%;相对标
准偏差(RSD，n = 18)分别为红壤 7. 1% ～ 28. 2%，紫
色土 11. 9% ～ 38. 1%，潮土 4. 1% ～ 17. 0%。该方法
操作简便，准确度高，回收率、灵敏度、检出限以及相对
标准偏差等均能满足残留分析的要求。
参考文献:
［1 ］ 余伯良 .减少使用抗生素饲料添加剂的途径［J］. 黑龙江畜牧兽
医，1998，4:21 － 22
［2 ］ Kumar K， Gupta S C， Baidoo S K， Chander Y， Rosen C J.
Antibiotic uptake by plants from soil fertilized with animal manure
［J］. Journal of Environmental Quality，2005，34(6):2082 － 2085
［3 ］ Paul A B，Paul K，Boxall A B A. The dissipation and transport of
veterinary antibiotics in a sandy loam soil［J］. Chemosphere，2007，
67:292 － 299
［4 ］ Haller M Y，Müller S R，McArdell C S，Alder A C，Suter M J F.
Quantification of veterinary antibiotics (sulfonamides and
trimethoprim) in animal manure byliquid chromatographymass
spectrometry［J］. Journal of Chromatography A，2002，952:111 －
120
［5 ］ Halling-srensen B，Nors N S，Lanzky P F，Ingerslev F，Lützhoft H
C H，Jogensen S E. Tetracycline Resistance Genes in the Bacteria
from Aquaculture Farms［J］. Chemosphere，1998，36:357 － 393
［6 ］ 张树清，张夫道，刘秀梅，王玉军，邹绍文，何绪生 . 规模化养殖
畜禽粪主要有害成分测定分析研究［J］. 植物营养与肥料学报，
2005，11(6):822 － 829
［7 ］ 凌 俊，江 河，胡 王 . 畜禽粪便资源化与渔牧结合研究进展
［J］.饲料研究，2009，7:10 － 13
［8 ］ Paul A B，Paul K，Roman A，Boxall A B A. Effects of agricultural
conditions on the leaching behaviour of veterinary antibiotics in soils
［J］. Chemosphere，2009，75:13 － 19
［9 ］ 姚志鹏，李兆君，梁永超，张永清，姚建华，解晓瑜 .土壤酶活性对
土壤中土霉素的动态响应［J］. 植物营养与肥料学报，2009，15
(3):696 － 700
［10］ 姚建华，牛德奎，李兆君，梁永超，张树清 . 抗生素土霉素对小麦
根际土壤酶活性和微生物生物量的影响［J］. 中国农业科学，
2010，43(4):721 － 728
［11］ 李兆君，姚志鹏，张杰，梁永超 . 兽用抗生素在土壤环境中的行
为及其生态毒理效应研究进展［J］. 生态毒理学报，2008，3(1):
15 － 20.
［12］ 王立君，赵 健，杨 挺 . 固相萃取 － 高效液相色谱法测定猪肉
中四环素类药物的残留［J］.现代农业科技，2006(11):120 － 121
［13］ 许传梅，星玉秀，董 琦，皮 立，肖 远，胡凤祖 .肉类及水产品
中四环素类抗生素残留量的高效液相色谱测定方法［J］.分析实
验室，2007，12(26):258 － 260
［14］ 宋慧敏，耿士伟，冯三令，储瑞武，冯群科，贾书静 .高效液相色谱
法测定饲料中土霉素［J］. 中国农业科学与技术，2008，10
(S2):43 － 47
［15］ 修丽华，姜世娟，迟 惠，宋永健，郭伟伟，王 娟 .高效液相色谱
法测定畜、禽肉中土霉素的残留量［J］. 现代食品科技，2007，11
(23):88 － 90
［16］ 乔坤云 . HPLC 分析测定鸡肝中土霉素、金霉素、四环素方法
［J］.中国卫生检验杂志，2003，10(13):610 － 611
［17］ 徐春明，郑广军 .简单流动相测定土霉素的含量［J］. 工程科学，
2008，1(10):25 － 30
［18］ 余永新，王 静，曹维强 . RP － HPLC 法快速检测鸡肉中 5 种四
环素类药物残留量［J］.毒理学杂志，2007，12(21):495 － 497
［19］ 刘 虹，张国平，刘丛强 .贵阳城市污水及南明河中氯霉素和四环
素类抗生素的特征［J］.分析化学，2007，35(3):3l5 － 319
［20］ 胡献刚，罗 义，周启星，徐 琳 .固相萃取—高效液相色谱法测
定畜牧粪便中 13 种抗生素药物残留［J］. 分析化学，2008，36
(9):1162 － 1166
［21］ 姚玉玲，但德忠 .高效液相色谱同时测定饲料中三种抗生素［J］.
化学研究与应用，2009，21(1):25 － 30
［22］ 俞道进，曾振灵，陈杖榴 . 高效液相色谱法测定底泥中土霉素含
量［J］.福建畜牧兽医，2005，5(27):1 － 2
［23］ 岳振峰，郑卫平，谢丽琪，吉彩霓，陈佩金 . 高效液相色谱法测定
动物组织中四环素类抗生素残留量的研究［J］. 分析实验室，
2006，10(25):24 － 28
［24］ 张慧敏，章明奎，顾国平 . 浙北地区畜禽粪便和农田土壤中四环
素类抗生素残留［J］.生态与农村环境学报，2008，24 (3):69 －
73
［25］ 田强兵 . 分析化学中检出限和测定下限的探讨［J］. 化学分析计
量，2007，16(3):72 － 73
［26］ 张鹏翔 . 色谱分析中的检出限和测定下限及其确定方法［J］. 内
蒙古科技与经济，2009，3(184):62 － 63
(责任编辑 邱爱枝)
8621