全 文 ：啤酒糖酵母菌 62磷酸海藻糖合成酶
编码基因 tps1 的 cDNA 克隆
董志扬 段瑜侃 杨寿钧 金 城 张树政
(中国科学院微生物所糖工程实验室 北京 100080)
林 敏
(中国农业科学院原子能利用研究所 北京 100094)
方宣钧
(中国农业科学院生物技术研究中心 北京 100081)
本工作从抗逆性极强的啤酒糖酵母菌株 AS211416 中分离纯化总 RNA 和 mR2
NA ,以 AMV 逆转录酶合成了单链 cDNA。采用保守引物扩增并克隆了该酵母菌的
6 - 磷酸海藻糖合成酶编码基因 tps1 ,建立了该基因 DNA 片段的物理图谱 ,发现其酶
切位点与已见报道的 6 - 磷酸海藻糖合成酶编码基因相同。
关键词 :啤酒糖酵母 ,海藻糖 ,6 - 磷酸海藻糖合成酶编码基因 ,cDNA 克隆
此文于 1999 年 8 月 12 日收到。
海藻糖是一种非还原性二糖 ,它是由两个葡萄糖通过β21 ,12糖苷键连接而成。海藻糖主
要存在一些能生活于各种恶劣环境条件下的一些低等生物体内 ,如酵母 ,甲壳类昆虫 ,蕨类及
一些低等沙漠植物等。这些生物之所以能抵抗干旱 ,高温 ,冷冻及化学污染等逆境 ,主要是其
体内的海藻糖能有效的保护这些生物的细胞在各种逆境下的生物活性[1 ,2 ] 。而高等动植物却
不具备有这麽强的抗逆特性 ,重要原因之一 ,就是其体内没有海藻糖的存在和保护[3 ] 。海藻
糖对高等动植物细胞同样具有较好的抗逆保护作用[4 ,5 ] ,根据这一特性 ,我们提出通过克隆出
海藻糖合成酶的相关基因 ,将其转入高等植物 ,使高等植物也具有在逆境条件下合成海藻糖的
能力 ,从而提高高等植物的抗逆性。海藻糖的生物合成是由海藻糖合成酶以 UDP - 葡萄糖和
6 - 磷酸葡萄糖为底物催化而成[6 ] ,酵母海藻糖合成酶是一种由 6 - 磷酸海藻糖合成酶和 6 -
磷酸海藻糖磷酸酶构成的复合酶[7 ] 。但至到 90 年代国外有几个实验室才从酵母中克隆出这
两个 基因并得到其全序列[8 ,9 ] 。在这里我们报道从面包酵母筛选出的海藻糖高产酵母菌株
中 ,利用 PCR 扩增出 tps1 基因并通过连接 PUC19 质粒在 DH5 a菌株中得到克隆。
1 材料与方法
111 试验材料
本试验所采用的啤酒糖酵母菌 ( S accharom yces cerevisiae) 从耐热的面包干酵母中筛选出
海藻糖高产菌株 AS211416。受体菌 DH5 a和 pUC19 质粒由本实验室保存。mRNA 纯化试剂
盒 ,cDNA 试剂盒 , Taq 酶及限制性内切酶均购自 Promega 公司。1kb DNA Ladder 购自
213 核 农 学 报 1999 ,13 (5) :312～315Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
GIBCORBL 公司。
112 总 RNA的提取
参照 E1Schmit 的方法[10 ] ,将活化的酵母接种于 200mL 酵母培养基中 ,在 30 ℃培养 12h ,
其 OD600nm为 2～5 之间为宜 ,培养结束时 ,在 40 ℃水浴中热冲击 15min ,迅速离心收集菌体 ,加
入 10mL 提取缓冲液 (50mmol/ L NaAc ,10mmol/ L ED TA p H513) 及 1mL 10 % SDS ,摇匀后 ,
加入等体积饱和酚 ,在 65 ℃保温 4min ,然后迅速置于 - 20 ℃冷冻 30～60min ,3000rpm 离心
10min ,取上清液分别用等体积的饱和酚 ,酚/ 仿各抽提 1 次 ,用乙醇沉淀离心 ,沉淀用 70 %乙
醇洗涤后抽干 ,溶于 015mL 重蒸水中。
113 mRNA的提取
参照 Promega 公司试剂盒的程序 ,用上述总 RNA 115mg 于 500μL RNAase2Free 水中 ,在
65 ℃水浴中加热 10min ,加热 3μL 的 Oligo2dT 探针和 13μ 120 ×SSC 缓冲液 ,混匀后在室温下
冷却 ,然后加入经处理的 SA - PMPs 亲和载体 ,经 10min 的吸附 ,用磁体收集 SA2PMPs 载体 ,
去上清液 ,用 011 ×SSC 缓冲液清洗 4 次。最后用 RNAase2Free 水洗脱得到 mRNA。
114 单链 cD NA的合成
参照 Promega 公司试剂盒的程序 ,用 2μg mRNA ,在 25μL 的反应体系中 ,加入 5μL Oligo
(dT)引物和 15μ/μg RNA 的 AMV 逆转录酶 ,在 42 ℃反应 60min。
115 PCR体外扩增
用于 PCR 反应的 5’端和 3’端引物是根据已发表的 tps1 基因序列设计的 ,由微生物所技
术室的 Beckman DNA 合成仪分别合成的 tps1 基因引物 ,其序列如下所示 :
5’端引物 5’GTA TGACTACGGA TAACGCT3’
3’端引物 5’GTTCA TCA GTTTTTGGTGGCA G3’
以单链 cDNA 为模板 ,在 100μL 反应体系加入 10 ×反应缓冲液 10μL ,5’端和 3’端引物各
为 100pmol , Taq 酶 015 单位 ,93 ℃热变性 3min 后 ,进行 PCR 扩增。PCR 循环参数为 :93 ℃变
性 45s ,60 ℃退火 45s ,72 ℃延伸 180s ,35 个循环后继续在 72 ℃保温 10min。
116 扩增片断的克隆及酶切鉴定
将质粒 pUC19 用 Hinc Ⅱ切开 ,与经过 Klenow 补平的 tps1 片断进行平端连接 ,转化大肠
杆菌 DH5a〗感受态细胞。在氨苄 Xgal 选择性培养基上涂板培养 ,挑选出白色菌落 ,提取质粒
进行酶切鉴定。
2 结果与讨论
211 酵母总 RNA和 mRNA的提取及 cD NA的合成
将提取的酵母总 RNA 进行凝胶电泳。18S 和 28S rRNA 在真核生物中占总 RNA 的 90 %
以上 ,因此呈现特征条带 ,而 mRNA 大小是不均一的 ,呈现弥散分布 ,图中 18S 和 28S 特征谱
带清晰 ,说明 RNA 是完整的。将完整的总 RNA 经 Oligo (dT) - SA - PMPs 分离 mRNA 后 ,
mRNA 是一条弥散条带 ,已去掉大部分 18S 和 28SrRNA。以 mRNA 为模板 ,Oligo (dT) 为引
物 ,用 AMV 反转录酶合成 cDNA ,合成后的 cDNA 经电泳分析 ;合成的 cDNA 大小在 100～
8000bp 之间 ,酵母 tps1 基因的大小为 115kb 左右 ,因此合成的 cDNA 中有希望获得含有完整
tps1 基因的 cDNA。
313 4 期 啤酒糖酵母菌 62磷酸海藻糖合成酶编码基因 tps1 的 cDNA 克隆
212 tps1 基因的 PCR扩增
以上述合成的 cDNA 为模板 ,用根据 tps1 基因序列设计合成的 5’2端和 3’2端引物进行
PCR 扩增。经过 35 个循环后 ,得到 115kb 左右的 DNA 片断 ,其大小与已发表的酵母 tps1 基
因相同。
图 1 重组质粒的酶切鉴定
Fig. 1 Restrictive digestion analysis of recombinant plasmid
A :1kb DNA Ladder , B :p TPSI3 , C :Nco I , D :Stu I E : EcoR I , F :BamH I/ Pst I ,
G:BamH I/ StuI , H : Hind Ⅲ/ StuI
213 扩增产物的克隆和重组子的酶切鉴定
将扩增到的 115kb DNA 片断用 Klenow 补平 ,载体 pUC19 由限制性内切酶 Hinc Ⅱ进行酶
解 ,经电泳检查确定质粒已被完全切开。用 T4DNA 连接酶将扩增片断与载体连接 ,连接产物
转化感受态细胞 DH5 a ,在氨苄 Xgal 选择性培养基上得到白色阳性克隆 ,初步筛选得到 4 个
插入片断在 115kb 左右的克隆。对其中的一个克隆 p TSI3 进行进一步的酶切鉴定 (图 1) ,并
绘制物理图谱 (图 2) ,发现我们的克隆片断的酶切图谱与国外的报道完全吻合[8 ,9 ] ,从而初步
证实我们克隆得到了酵母海藻糖合成酶 tps1 基因。
图 2 重组质粒 p TPSI 3 的物理图谱
Fig. 2 Physical mapping of recombinant plasmid
B :BamH I , E : EcoR I , H : Hind Ⅲ, N :Nco I , P : Pst I , S :Stu I
413 核 农 学 报 13 卷
McDougall[11 ]等人发现酵母 tps1 基因能恢复 E. coli 的 ostA 基因突变株的海藻糖积累和
耐渗透压能力 ,这表明酶母 tps1 基因及产物能直接提高细胞的抗逆性。利用海藻糖提高植物
抗逆性能的研究目前在国际上尚无人报道 ,这在高等植物抗逆研究领域也是一种全新的设想。
由于这种设想在分子机理上非常明确 ,因此可望能在目前困难重重的植物抗逆研究方面有所
突破。目前我们正在构建该基因的亚克隆 ,分析其核苷酸全序列 ,并将该基因与 6 - 磷酸海藻
糖酯酶基因通过农杆菌一起转化模式植物烟草 ,使其在高等植物中表达 ,从而进一步探索海藻
合成酶的表达及活性水平与提高高等植物抗逆性的可能性。
参 考 文 献
1 董志扬 ,方宣钧 ,林敏 ,张树政. 海藻糖的生物合成及其抗逆机理. 核农学研究进展 ,115～119 ,1996
2 VanLaere A. Trehalose , reserveand/ or stress metabolite ? FEMS Microbiol Rev 1989 ,63 :201～210
3 Crowe J H. Hoekstra F A , Crowe L M. An hydrobiosis Annu. Rev. Physiol. 1992 ,54 :579～599
4 Borelli M I , Semino M C , Hernandez R E. Cryopreservation of is lets of langerhans : the use of trehalose as acryoprotective a2
gent . Med. Sci. Res. 1987 ,15 :299～300
5 Bhandai I S , Hauptmann R M , Widholm J M. Trehalose as cryoprotectant for the freeze preservation of carrot and tobacco
cells. Plant Physiol 1985 ,78 :430～432
6 Cabib E , & Leloir L F. The biosynthesis of trehalose phosphate. J Biol Chem. 1958 ,231 :259～275
7 Londesborough J , Vuorio O E. Trehalose262phosphate synthase/ phosphatase comlex from baker’s yeast :purification of aprote2
olytically activated form. J Gen Microbiol. 1991 ,137 :323～330
8 Bell W , Klaassen P , Ohnacker M ,etc. Characterization of the 562kDa subunit of yeast trehalose262phosphate synthase and
cloning of its gene reveal its identity with the produc to fCIF1 , a regulator of carbon catabolite inactivation. Eur j Biochem.
1992 ,209 :951～959
9 Vuorio O E , Kalkkinen N , Londesborough. Cloning of two related genes encoding the 562kDa and 1232kDa subunits of tre2
halose synthase from the yeast S accharomyces cerevisiae. Eur J Biochem. 1993 ,216 :849～861
10 Schmitt M D , Brown T A. Trumpower B L . A rapid and simple method for preparation of RNA from S accharomyces cerevisi2
ae. Nucleic Acids Research 1990 ,18 :3091～3092
11 McDougall J Kaasen , I ,Strom A R. A yeast gene for trehalose262phosphate synthase and its complementation of an E. coli otsA
mutant . FEMS Lett . 1993 ,10 :25～30
MOL ECULAR CLONING OF tps1 GENE ENCODING TREHALOSE262PHOSPHATE
SYNTHASE FROM Saccha romyces cerevisiae
Dong Zhiyang Duan Yukan Yang Shoujun J in Cheng Zhang Shuzheng
( Instit ute of Microbiology , Chinese Acedemy of Science , Beiji ng 100080)
Lin Min
( Instit ute of A pplication of A tomic Energy , CA A S , Beiji ng 100094)
Fang Xuanjun
( Biotechnology Research Center , CA A S , Beiji ng 100081)
ABSTRACT
Total RNA and mRNA were isolated and purif ied from yeast. The f irst strand of cD NA us2
ing ol igo( dT) as primer was synthesized and a 115 kb D NA fragment was obtained with PCR
technique. The restriction map of the D NA fragment was analysed. The results showed that the
entire cD NA encoding trehalose262phosphate synthase had been cloned.
Key words : S accharom yces cerevisiae , t rehalose , gene encoding trehalose262phosphate syn2
thase , cDNA cloning
513Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
1999 ,13 (5) :312～315