全 文 ：文章编号 :100028551 (2009) 022257205
水稻愈伤组织中内源植物激素水平与遗传转化的关系
吴　顺1 ,2 　萧浪涛2 　刘　清2 　沈革志3 　王若仲2
(11 中南林业科技大学生命科学与技术学院 ,湖南 长沙　410004 ;21 湖南农业大学植物激素与生长发育重点实验室 ,湖南 长沙　410128 ;
31 上海市农业科学院作物所 上海　201106)
摘 　要 :以湘早籼 33 和 01 早 5202 为材料 ,探讨了其愈伤组织在组织培养过程中内源激素的变化及其与
农杆菌遗传转化之间的关系。结果表明 ,不同继代培养时期的愈伤组织 ,农杆菌遗传转化频率不同。相
关性分析表明 ,内源 IAA 和 Z含量与愈伤组织转化频率呈正相关 ,而内源赤霉素 ( GA3 ) 和脱落酸 (ABA)
含量与愈伤组织转化频率相关关系不明显。
关键词 :水稻 ; 愈伤组织 ; 内源植物激素 ; 遗传转化
RELATIONSHIP BETWEEN ENDOGENOUS HORMONES IN RICE CALLI AND GENETIC TRANSFORMATION
WU Shun1 ,2 　XIAO Lang2tao2 　LIU Qing2 　SHEN Ge2zhi3 　WANG Ruo2zhong2
(11 College of Life Science and Technology , Central South University of Forestry and Technology , Changsha , Hunan 　410004 ;
21 Hunan Provincial Key Laboratory of Phytohormones , Hunan Agricultural University , Changsha , Hunan 　410128 ;
31 Crop Institute , Shanghai Academy of Agricultural Sciences , Shanghai 　201106)
Abstract :The relationship between endogenous hormones and genetic transformation by Agrobcterium tumef aciens was studied
during calli culture by Xiangzao xian indica 33 and 01 Zao 52021 The results showed that the transformation frequency by A .
tumef aciens in different calli culture stage for Indica rice was different . Correlative analysis showed that there was positive
relationship between transformation efficiency and endogenous IAA and Z content , and insignificant relationship between
transformation efficiency and endogenous GA3 and ABA content .
Key words :rice ; calli ; endogenous hormones ; genetic transformation
收稿日期 :2008208201 　接受日期 :2008209226
基金项目 :国家自然科学基金项目 (30600049) ,长沙市科技局攻关项目 ( K041113222)
作者简介 :吴顺 (19762) , 男 , 湖南宁乡人 , 讲师 , 理学博士 ,研究方向为植物生理生化与分子生物学。Tel :073125623496 (O) ; E2mail :wushuncn @
yahoo. com. cn
　　转基因技术的应用为作物育种开辟了一条崭新的
途径 ,大大加快了育种进程 ,拓宽了育种范围。水稻是
世界上最重要的粮食作物之一 ,利用基因工程获得优
良的水稻材料已成为研究的热点。自 1994 年 Hiei
等[1 ] 利用根癌农杆菌成功地转化粳型水稻以来 ,根癌
农杆菌介导法已被广泛应用于许多单子叶植物 (如水
稻)的遗传转化。然而 ,成功的植物遗传转化取决于适
合农杆菌转化的受体细胞的获得 ,而植物组织培养作
为根癌农杆菌遗传转化的基本技术 ,其成功与否将直
接影响整个遗传转化过程。
众所周知 ,外源生长物质的添加是植物组织培养
中一种常规的实验手段 ,不同植物、不同品种的组织培
养 ,其添加外源生长物质的水平及配比不同。但由于
研究初期条件的限制 ,人们对植物组织培养过程中外
源生长物质的添加只是凭经验进行 ,往往需要花费大
量的人力、物力和财力 ,而且有时还得不到理想的培养
效果。随着内源激素检测手段的不断改进 ,国内外学
者对植物组织培养过程中内源激素的变化及其与外源
生长物质之间的关系进行了大量研究 ,从而大大提高
了植物组织培养的效率。本文以水稻成熟胚为材料探
讨了其愈伤组织在组织培养过程中几种内源激素的变
化及其与农杆菌遗传转化之间的关系 ,以期从改变内
752　核 农 学 报　2009 ,23 (2) :257～261Journal of Nuclear Agricultural Sciences
源激素水平入手 ,提高水稻愈伤组织的遗传转化频率 ,
进一步为细胞工程育种提供保证 ,这也是植物转基因
成功的主要环节。
1 　材料与方法
111 　材料
试验用籼稻品种 ( Oryza sativa L. subsp . Indica) 01
早 5202 (Z5202) 和湘早籼 33 (X33) 由湖南农业大学水
稻科学研究所提供。pCAMBIA1300 质粒由 Jefferson 教
授 (Australia)提供 ,并通过冻融法将质粒导入根癌农杆
菌 EHA105。
112 　方法
11211 　成熟胚愈伤组织的培养　取籽粒饱满、无病虫
害的成熟种子去壳 ,用 70 %酒精浸泡 1min ,011 %升汞
浸泡 10 - 12min 后 ,用无菌水冲洗 ,再用有效氯含量 ≥
5 %的次氯酸钠溶液浸泡约 30min ,无菌水冲洗 3 次 ,吸
干水分后 ,接种于分别添加 2mgΠL 2 ,42D 和 012mgΠL 62
BA 的N6 培养基中 ,在 26 ℃±1 ℃暗培养条件下诱导愈
伤组织。培养 6d 后 ,将愈伤组织剥离 ,切除幼芽后 ,转
入上述培养基进行继代培养 ,15d 后再继代 1 次。
11212 　根癌农杆菌的遗传转化 　取农杆菌单菌落接
种于含卡那霉素 ( Km) 50mgΠL 的 YEB 液体培养基中 ,
在 28 ℃、150rΠmin 震荡培养过夜。将菌液按 1∶50 分别
转入AB 培养基 (含 Km 50mgΠL) ,28 ℃、150rΠmin 震荡培
养过夜。在 OD600 = 018 时以 4000g 离心 10min ,收集菌
体 ,并悬浮于 1Π2 AAM 培养基 (每 25ml 菌液用 15ml
1Π2AAM培养基) 。
分别取不同继代培养 12、18、24、30 和 36d 的愈伤
组织 (由于继代 6d 后愈伤组织过小 ,故未采用) ,用相
同浓度 EHA105ΠpCAMBIA1300 的农杆菌菌液进行浸泡
侵染 ,不时摇晃 ,20min 后取出愈伤组织并用无菌滤纸
吸干菌液 ,置超净工作台上干燥 2h 至材料表面水分充
分干燥 ,转入垫有一层无菌滤纸的共培养基 ( CC +
2mgΠL 2 ,4 - D + 100μmolΠL 乙酰丁香酮) 上 ,26 ℃暗培
养 2 - 3d 后转入抗性筛选培养基 (CC + 2mgΠL 2 ,4 - D
+ 25mgΠL 潮霉素 + 500mgΠL 羧苄青霉素) 培养 ,15d 后
将生长的抗性愈伤组织再转入新鲜抗性筛选培养基 ,
进行第 2 次抗性筛选 ,15d 后统计抗性愈伤组织存活
率。取生长良好的抗性愈伤组织转入分化培养基 (MS
+ 015mgΠL NAA + 015mgΠL KT + 300mgΠL 羧苄青霉
素) ,分化成苗 ,分别统计抗性愈伤组织分化率。愈伤
组织存活率 ( %) = 抗性筛选后存活的愈伤组织数Π(侵
染愈伤组织总数2污染愈伤组织数) ×100 % ;抗性愈伤
组织分化率 ( %) = 出现绿点的愈伤组织数Π(侵染愈伤
组织总数2污染愈伤组织数) ×100 %。
11213 　4 种内源植物激素的检测　将 11211 中水稻愈
伤组织从剥离后开始 ,每隔 6d 采集其培养物 ,液氮冻
干后 ,置于 - 80 ℃冰箱中备用。参照王若仲等[2 ] 植物
激素检测方法 ,加以改进。经过色谱条件摸索 ,将赤霉
素 GA3 和吲哚乙酸 IAA 分为一组进行检测 ,波长为
208nm ;而玉米素 (Z)和脱落酸 (ABA)分为另一组 ,检测
波长为 270nm。4 种植物激素分别在其检测波长和
1mΠmin 恒流条件下进行梯度洗脱。柱温为 35 ℃,外标
峰面积法定量。
2 　结果与分析
211 　水稻愈伤组织的遗传转化
结果表明 (见表 1) ,采用继代培养 18 和 24d 的愈
伤组织进行转化 ,其愈伤组织存活率和分化率都较高 ,
且两个品种的结果基本一致 ( R = 019673 , P = 01003) 。
随着培养时间的延长 ,愈伤组织褐化 ,非胚性愈伤组织
增多 ,分化能力降低。
212 　IAA与愈伤组织转化率的关系
由图 1 可知在整个组织培养过程中 ,水稻愈伤组
织中的 IAA 含量都维持在较高水平。随着培养时间的
延长 ,湘早籼 33 和 01 早 5202 愈伤组织中从 6 - 18d
IAA 含量逐渐上升 ,达到峰值后 ,即呈下降趋势。随着
继代培养时间的延长 ,两个品种的愈伤组织都表现出
先升后降 ,再上升的趋势 (分别为 R = 011813 , P =
010012 和 R = 013423 , P = 010025) 。
图 1 　水稻愈伤组织培养过程中内源 IAA 含量的变化
Fig. 1 　Changes of endogenous IAA content during
culture of calli in rice
IAA 含量与抗性愈伤组织存活率相关性分析表
明 ,湘早籼 33 和 01 早 5202 愈伤组织内源 IAA 含量对
852 核　农　学　报 23 卷
抗性愈伤组织存活率有正效应 (分别为 R = 017022 , P
= 010202 和 R = 015185 , P = 01002) ,而对抗性愈伤组 织分化率也表现出明显正相关 (分别为 R = 017795 , P= 010081 和 R = 016659 , P = 01001) 。
表 1 　不同培养时间的水稻抗性愈伤组织存活率
Table 1 　Rate of genetic transformation in indica rice calli of different subculture time
品种
varietie
项目
item
培养时间
subculture time
继代后 12d
12d after subculture
继代后 18d
18d after subculture
继代后 24d
24d after subculture
继代后 30d
30d after subculture
继代后 36d
36d after subculture
愈伤数
calli number
319 299 310 353 297
存活愈伤数
number of living calli 34 83 64 54 28
X33
存活率
rate of living( %) 1115 3014 2414 1914 1214
分化愈伤数
number of differentiation calli
26 67 58 40 19
分化率
rate of differentiation ( %) 818 2415 2211 1414 814
愈伤数
calli number
291 314 269 309 293
存活愈伤数
number of living calli
54 110 70 60 34
Z5202
存活率
rate of living( %) 2011 3811 3116 2719 1711
分化愈伤数
number of differentiation calli 36 91 59 43 28
分化率
rate of differentiation ( %) 1314 3115 2617 2010 1411
　　注 :X33 :湘早籼 33 ;Z5202 : 01 早 5202。下图表同。
Note : X33 :Xiangzaoxian 33 ;Z5202 : 01 Zao 52021 The same as following Figures and Tables.
213 　Z与愈伤组织转化率的关系
由图 2 可以看出 ,水稻愈伤组织在组织培养过程
中 Z含量发生了明显的变化。当愈伤组织剥离转移到
继代培养基后 , Z 含量不断上升 ,在 18d 时达到最大
值 ,湘早籼 33 和 01 早 5202 分别达到 170168 ngΠg·FW
和 169132ngΠg·FW。随后 Z 含量又呈明显下降趋势 ,
X33 的 Z 含量在 30d 再次上升 ,到后期随着愈伤组织
的褐化加重 ,其含量又急剧下降 (分别为 R = 010981 ,
P = 011457 和 R = 010435 , P = 011341) 。
Z 含量与抗性愈伤组织存活率相关性分析表明 ,
湘早籼 33 和 01 早 5202 愈伤组织内源 Z 含量对抗性
愈伤组织存活率有正效应 (分别为 R = 014390 , P =
012230 和 R = 016512 , P = 010980) ,而对抗性愈伤组织
分化率也表现出正相关 (分别为 R = 013450 , P =
012978 和 R = 015102 , P = 011752) 。
214 　GA3 与愈伤组织转化率的关系
籼稻愈伤组织继代培养过程中 GA3 含量的变化
图 2 　水稻愈伤组织培养过程中内源 Z含量的变化
Fig. 2 　Changes of endogenous Z content
during culture of calli in rice
如图 3。湘早籼 33 和 01 早 5202 愈伤组织培养 6 -
18d ,GA3 含量呈现下降的趋势 ,随着继代培养时间的
延长 ,GA3 含量在 18 - 30d 逐渐上升 ,达到峰值后 ,即
呈下降趋势。随着继代培养时间的延长 ,两个品种的
愈伤组织都表现出先降后升 ,再下降的趋势 (分别为 R
952　2 期 水稻愈伤组织中内源植物激素水平与遗传转化的关系
= 016344 , P = 010002 和 R = 011373 , P = 010232) 。
GA3 含量与抗性愈伤组织存活率相关性分析表
明 ,湘早籼 33 和 01 早 5202 愈伤组织内源 GA3 含量与
抗性愈伤组织存活率 (分别为 R = 010253 , P = 010155
和 R = 010994 , P = 014261)和抗性愈伤组织分化率 (分
别为 R = 010187 , P = 010423 和 R = 010218 , P =
012565)之间的相关性较小。
图 3 　水稻愈伤组织培养过程中内源 GA3 含量的变化
Fig. 3 　Changes of endogenous GA3 content during
culture of calli in rice
215 　ABA与愈伤组织转化率的关系
在水稻等禾谷类作物组织培养中 ,ABA 对保持继
代培养中愈伤组织胚性的作用早已得到肯定。在组织
培养 6 - 24d ,湘早籼 33 和 01 早 5202 愈伤组织中 ABA
含量随着培养时间的延长逐渐上升 ,在 24d 达到峰值 ,
这有利于愈伤组织胚性的维持 ,随后 ABA 含量迅速下
降 ,愈伤组织开始非胚性化 ,分化能力下降 (分别为 R
= 015071 , P = 011107 和 R = 014647 , P = 011007) 。而
后期 ABA 含量迅速上升 ,可能是由于愈伤组织褐化衰
老所致。
ABA 含量与抗性愈伤组织存活率相关性分析表
明 ,湘早籼 33 和 01 早 5202 愈伤组织内源 ABA 含量对
抗性愈伤组织存活率有正效应 (分别为 R = 010001 , P
= 010552 和 R = 012899 , P = 010280) ,而对抗性愈伤组
织分化率也表现出正相关 (分别为 R = 010026 , P =
010424 和 R = 011198 , P = 010350) ,但其相关性均较
小。
3 　讨论
植物激素对植物的生长发育具有重要的调节作
用 ,植物组织培养过程中植物生长物质能调节愈伤组
图 4 　水稻愈伤组织组织培养过程中内源 ABA 含量的变化
Fig. 4 　Changes of endogenous ABA content
during culture of calli in rice
织的诱导及胚性结构的形成[3 ] 。早在 l957 年 ,Skoog 和
Miller 就在植物组织培养中发现了生长素和细胞分裂
素调控形态发生和植株发育现象 ,并提出了“激素平
衡”假说[4 ] 。植物内源激素通过调控细胞或组织的基
因活动 ,从而影响一系列代谢过程 ,最终影响植物细胞
胚性潜力的诱导、维持和表达。
转基因植物的成功与否 ,在很大程度上取决于合
适转化受体的选择。Smith 等认为 ,用农杆菌转化单子
叶植物 ,应选择处于适宜生理状态的那些组织 ,其特点
是 :能够产生 Vir 基因活化分子 ;内源激素浓度适宜 ;
农杆菌比较容易附着于细胞壁上 ;细胞分裂旺盛 ,DNA
大量合成 ,有利于 T2DNA 的摄入和整合[5 ] 。研究表
明[6 ] ,某些对农杆菌转化敏感性差的植物转化频率很
低 ,甚至不能转化 ,但它能够通过植物激素处理得到加
强 ,农杆菌介导的遗传转化似乎是取决于植物的激素
敏感性。植物细胞的感受态是指植物细胞转化时易于
接受外来遗传物质的一种状态。毫无疑问 ,植物细胞
的感受态与转化频率直接相关。张根义等[7 ] 的研究表
明 ,在植物转化时 ,适当浓度的 NAA 和 62BA 处理将使
植物细胞的感受态增强 ,提高植物的遗传转化率 ;
Sophie Chateau 等[8 ] 用 2 ,42D 和 KT 处理某些对农杆菌
不敏感的拟南芥突变体 ,发现经处理后其农杆菌转化
效率大大提高。他们认为两种处理激活了许多组织细
胞的分裂和脱分化 ,细胞内也相应发生许多生理生化
变化。本研究也证明了这一点 ,愈伤组织从种胚剥离
继代培养 12d 后 ,其生长速度较快 ,内源 IAA 和 Z含量
明显上升 ,其转化频率也增加。这表明水稻愈伤组织
中较高浓度的 IAA 和 Z有利于根癌农杆菌的转化。内
源 GA3 和 ABA 含量的高低与水稻愈伤组织遗传率相
关性不大。而 Christine 等[9 ]在研究烟草花枝器官时发
现 ,施用外源的生长调节物质不仅可以提高内源激素
062 核　农　学　报 23 卷
水平 ,而且诱发内源激素达到峰值。且在外植体分化
与脱分化过程中 ,内源激素的变化和使用外源生长物
质诱导的结果基本一致。这些研究结果的获得 ,将为
今后外源生长物质的应用提供有力的参考依据。
参考文献 :
[ 1 ] 　Hiei Y, Ohta S , Komari T , et al . Efficient transformation of rice
( Oryza sativa L. ) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of
the boundaries of the T2DNA[J ] . The Plant J , 1994 , 6 :271～282
[ 2 ] 　王若仲 , 萧浪涛 , 蔺万煌 , 曹　庸 , 卜晓英. 亚种间杂交稻内源
激素的高效液相色谱测定法[J ] . 色谱 ,2002 , 20 (2) :148～150
[ 3 ] 　付凤玲 , 冯质雷 , 渠柏艳 , 李晚忱. 玉米未成熟胚胚性愈伤组织
诱导率与内源激素含量的关系 [J ] . 核农学报 , 2006 , 20 (1) :10
～14
[ 4 ] 　谷瑞升 , 蒋湘宁 , 郭仲琛. 植物离体培养中器官发生调控机制的
研究进展[J ] . 植物学通报 , 1999 , 16 (3) :238～244
[ 5 ] 　叶兴国 , 王连铮. 大豆花药愈伤组织的分化及其内源激素分析
[J ] . 作物学报 , 1997 , 23 (5) :555～561
[ 6 ] 　Lincoln C , Turner J , Estelle M. Hormone2resistant mutants of
Arabidopsis Have and attenuated response to Agrobacterium strains[J ] .
Plant Physiology , 1992 , 98 :979～983
[ 7 ] 　张根义 , 徐　武 , 李　鸣 , 张　敬 , 李安生. 植物细胞感受态研
究初探[J ] . 农业生物技术学报 , 1997 , 5 (1) :100～102
[ 8 ] 　Sophie Chateau , Rajbir S Sangwan , Brigitte S Sangwan2Norreel .
Competence of Arabidopsis thaliana genotypes and mutants for
Agrobcterium tumefaciens2mediated gene transfer : role of phytohormones
[J ] . J Exp Botany , 2000 , 51 (353) :1961～1968
[ 9 ] 　Christine H , Vendrig J C , Onckelen H V. The accumulation and
metabolism on plant growth regulators during organogenesis in cultures of
thin cell layers of Nicotiana tabaccum[J ] . Physiol Plant , 1991 , 83 :578
～584
(上接第 192 页)
[ 5 ] 　Jones H D , Doherty A , Wu H X. Review of methodologies and a
protocol for the Agrobacterium2mediated transformation of wheat [ J ] .
BioMed Central , 2005 ,1 :1～9
[ 6 ] 　Rueb S , Hensgens LAM. Improved histochemical staining for β2D2
glucuronidase activity in monocotyledonous plants [ J ] . Rice Genet
Newsl ,1989 ,6 :168～169
[ 7 ] 　Hooykaas P J , Schilperoort R A. Agrobacterium and plant genetic
engineering[J ] . Planta Mol Biol ,1992 ,19 :15～18
[ 8 ] 　Zuran J R , Zambryski P. Transfer of T2DNA from Agrobacterium to the
plant cell [J ] . Plant Physiol , 1995 ,107 :1041～1047
[ 9 ] 　Cheng M , Fry J E , Pang S Z , Zhou H , Hironaka C , Duncan D R ,
Conner T W , WAN Y. Genetic transformation of wheat mediated by
Agrobacterium tumefaciens[J ] . Plant Physiol , 1997 ,115 :971～980
[10 ] 　王关林 , 方宏筠. 植物基因工程 [ M] . 北京 :科学出版社. 2002 :
346～355
[11 ] 　Pablo J ,Ortiz A ,Reggiardo M I ,Ravizzini R A ,Altabe S G, Gerardo D
L ,Cervigni , Spitteler M A ,Morata M M , Elias F E ,Vallejosall R H.
Hygromycin resistance as an efficient selectable marker for wheat stable
transformation[J ] . Plant Cell Rep ,1996 ,15 (12) :877～881
[12 ] 　王彩霞 ,吴殿星 ,沈圣泉 ,舒庆尧. 转基因及常规水稻幼苗对潮霉
素敏感性的研究[J ] . 核农学报 ,2005 , 19 (3 ) :168～171
[13 ] 　奚亚军 ,范学科 ,侯文胜 ,张启发 ,路 　明. 小麦遗传转化中潮霉
素适宜筛选浓度的研究 [J ] . 西北农林科技大学学报 ,2003 ,31
(1) : 39～42
[ 14 ] 　叶兴国 , 徐惠君 , 杜丽璞 , 辛志勇 , Lee S Y, Hong J H. 小麦遗传
转化中适宜选择剂浓度和标记基因的确定[J ] . 农业生物技术学
报 ,2000 ,8 (2) :71～73
[15 ] 　叶松青 ,储成才 ,曹守云 ,唐祚舜 ,王 　力 ,赵世民 ,田文忠. 提高
水稻转化效率几个主要因素的研究[J ] . 遗传学报 ,2001 ,28 (10) :
933～938
[16 ] 　叶兴国 , 徐惠君 ,杜丽璞 ,辛志勇. 小麦遗传转化几个因素的研
究[J ] . 中国农业科学 ,2001 ,34 (2) :128～132
[17 ] 　王永勤 , 肖兴国 , 张爱民. 农杆菌介导的小麦遗传转化几个影响
因素的研究[J ] . 遗传学报 ,2002 ,29 (3) :260～265
[18 ] 　王翠亭 ,卫志明. 根癌农杆菌介导小麦幼胚遗传转化的影响因素
[J ] . 植物生理与分子生物学报 ,2003 ,29 (6) :521～529
[19 ] 　黄健秋 , 卫志明 , 安海龙 , 徐淑平 , 章 　冰. 根癌土壤杆菌介导
的水稻高效转化和转基因植株的高频再生 [J ] . 植物学报 ,
2000 ,42 (11) :1172～1178
[20 ] 　Ishida Y, Saito H , Ohta S , Hei Y, Komari T , Kumashiro T. High
efficiency transformation of maize ( Zea mays L. ) mediated by
Agrobacterium tumefaciens[J ] . Nature Biotenology ,1996 ,14 :745～750
[21 ] 　吕晓依 ,王竹林 , 奚亚军 ,任　鹏 , 刘曙东. 小麦遗传转化受体系
统的建立[J ] . 西北植物学报 ,2007 ,27 (5) :912～918
162Journal of Nuclear Agricultural Sciences
2009 ,23 (2) :257～261