全 文 ：固氮粪产碱菌 ( A lcaligenes f aecalis)
胞外多糖的理化特性分析
方宣钧
(中国农业科学院生物技术研究中心　北京　100081)
林　敏　尤崇杓
中国农业科学院原子能利用研究所　北京　100094)
本文 1994 年 12 月 21 日收到。
　　EPS 结构分析表明 ,EPS 突变株及工程菌株的糖骨架结构与野生型菌株相比有
差异 ,尤其是 ntrC2nifA 基因结合子 A1532 的糖骨架结构明显不同于其它菌株 ,各个
菌株之间 ,其侧链基团均稍有改变。ETIR 证实 ,各个菌株 EPS 中蛋白构象存在差
异 ,EPS 中均有丰富的β折叠构象。EPS 丰富型突变株中无规卷曲构象所占比例较
大 ,而野生型菌株中 EPS 则没有无规卷曲构象。
关键词 :粪产碱菌 　胞外多糖 　糖骨架结构 　蛋白构象
前 　　　言
联合固氮菌与宿主植物结合过程中 EPS 的作用 ,目前尚远未阐明。有报道 ,巴西固氮螺
菌中以β21 ,3 或β21 ,4 糖苷键相连接的 EPSI 参与了与小麦根的相互作用 ,缺失这种 EPS ,菌就
不能在小麦根上定殖〔10 ,13〕。而粪产碱菌无论是胞外多糖缺陷型还是丰富型均不利于菌体与
根表的识别及结合〔8〕。前文已对粪产碱菌 EPS 的组分作了探讨〔7〕,本工作将就粪产碱菌及其
突变株和转化子 EPS 的一些波谱特性进行分析 ,以研究它们的 EPS 在结构上的差异 ,进而阐
述其与水稻根结合的特异性关系。
材 料 与 方 法
菌株与培养　实验所用粪产碱菌及其突变菌株均如前文〔7〕,菌体在 LB 固体培养基上
30 ℃培养。
EPS 的分离 　同前文〔7〕。
EPS 的1 H2NMR谱测定 　5mg EPS 样品溶于 500μl D2O (99. 8 %) ,冷冻干燥 ,重水交换后
的样品再溶于 500μl D2O (99. 8 %) ,Bruke AM500 超导核磁共振仪 70 ℃记录1 H2NMR 谱 ,化学
位移以丙酮为外标。
付立叶红外光谱( Fourier transform infrared) 测定 　EPS 样品在真空条件下 , KBr 压片。
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Acta A gricult urae N ucleatae Sinica
用 Nicolet Magna2IR750 型红外分光光度计测定 ,用计算机进行二阶导数处理。
紫外2可见光谱测定 　EPS 样品溶解于 p H712 50mmol/ L 的 Tris2HCl 缓冲液中 ,用岛津
UV2160A 分光光度计测定 ,并进行二阶导数处理。
结 果 与 讨 论
(一) EPS 的1 H2NMR谱
粪产碱菌野生型菌株 (A1501) 、胞外多糖突变株 (A1531、A1532) 及转化工程菌株 (A1513、
A1523) EPS 的1 H2NMR 谱如图 1 所示。
图 1 　EPS的1 H2NMR 谱
Fig. 1 　1 H2NMR spectra of EPS
Recorded at 70 ℃with the peak at 4. 85ppm corresponding to HDO
a. A1501 , b. A1531 , c. A1532 , d. A1513 , e. A1523.
图 1 表明化学位移 1. 42～1. 55ppm 表现出了较强的脱氧糖甲基基团共振 , 1. 70～
1199ppm 和 2. 20ppm 分别是丙酮酸盐取代基及乙酸盐取代基的甲基共振谱 ,3. 90～4180ppm
为糖环质子谱 ,4. 90～5. 50ppm 为异构质子谱〔5〕。
从图 1 可见 ,尽管 EPS 的1 H2NMR 谱整体的外形相似 ,但仍然能从碳水化合物骨架结构
和侧链取代基团上辨别其差异。野生型 A1501 EPS 与突变株 (A1531 ,A1532) EPS 及工程菌
株 A1513 EPS 的糖骨架结构基本上相同 ,而工程菌株 A1523 EPS 的糖骨架结构明显不同于其
它菌株。各个菌株之间 ,其侧链结构在取代基团上都存在微小差异 ,说明了各个基团的核与核
之间相互作用情况稍有变化〔11〕。结果表明 ,胞外多糖突变株仅在 EPS 合成数量上存在差异 ,
而其结构与野生型 A1501 相比基本相同。工程菌株 A1513 EPS 与 A1523 EPS 之间的糖骨架
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结构存在明显差异 ,但两者的侧链结构差异微小。说明多拷贝的 ntrC2nifA 基因和 nifA 基因
不仅对粪产碱菌的氮调节直接起重要作用〔14〕,而且对 EPS 的结构也产生间接的影响。另一
种可能 ,我们在构建 A1513 和 A1523 时 ,应用的是 i n vivo 遗传工程方法〔12〕,是通过 Tn5 将外
源 nifA 或 ntrC2nifA 插入染色体的某个部位上〔6 ,15〕。因此 ,对 EPS 没有影响 ,只是染色体上
Tn5 插入位点与 EPS 合成及代谢有关 ,这还有待进一步研究。
(二) EPS 的红外光谱
EPS KBr 压片的红外吸收光谱 (图略) ,在 4000cm - 1～400cm - 1范围内 ,不同菌株之间的
红外吸收频率存在差异。特别是指纹区 (1300cm - 1以下) ,各个菌株间差异更为显著 ,说明官
能基团有差异。
红外吸收光谱极为复杂 ,不能用单一数字模型来确切表示 ,但它的二阶导数所形成的图
谱 ,完全可以代表原吸收光谱上吸收峰及峰高 ,经过二阶导数处理 ,改进了分辨率 ,半高度处的
宽度减少到近似为原来吸收曲线半宽度的 1/ 3 ,使得原来不明显的吸收峰显现出来〔9〕。导数
光谱分析使 3000～2800cm - 1 、酰胺 Ⅰ带及酰胺 Ⅱ带区域内显示出更多的峰 ,把光谱带分解成
为多个组分。3000～2800cm - 1主要表现为 C2H 伸缩振动。饱和碳的 C2H 伸展振动 ,一般可
见 4 个吸收峰 ,其中两个属 CH3 ,～2960 ,～2870cm - 1 ,两个属 CH2 ,～2925 ,～2850cm - 1 。葡
萄糖的 CH 带出现在 2960、2910、2890、2875cm - 1[1 ] 。粪产碱菌及其变种在 3000～2800cm - 1
区域的红外吸收频率差异不明显。
表 1 　酰胺 Ⅰ、酰胺 Ⅱ带主要红外吸收频率
Table 1 　The absorbance frequency of the amide Ⅰand Ⅱbands
菌株
Strains
酰胺Ⅰ带
Amide Ⅰband
酰胺Ⅱ带
Amide Ⅱband
α2螺旋
α2helix β2折叠β2sheet 无规卷曲Random coil α2螺旋α2helix β2折叠β2sheet 无规卷曲Random coil
A1501 1653. 02 1548. 81 1516. 45
1630. 53
1626. 69
A1531 1653. 20 1636. 02 1645. 89 1549. 36 1517. 00
1630. 53
1620. 14
A1532 1655. 20 1638. 21 1647. 53 1543. 88 1517. 00 1535. 65
1630. 53
1626. 69
A1513 1653. 20 1638. 21 1647. 00 1548. 81 1516. 45
1629. 98
1626. 69
A1523 1653. 20 1637. 66 1647. 53 1549. 36 1516. 45
1629. 98
1626. 69
在蛋白质和多肽的研究中 ,酰胺 Ⅰ、酰胺 Ⅱ是 2 个重要的吸收峰。酰胺带与蛋白质二级结
构紧密有关 ,尤其对于氢键形成的结构的变化特别敏感 ,氢键的组成结构变化引起了蛋白质构
象的变化〔2 ,3〕。因此 ,研究酰胺带的细微结构 ,有助于了解蛋白的构象变化。1660～1630cm - 1
381　3 期 固氮粪产碱菌胞外多糖的理化特性分析
和 1550～1520cm - 1分别为酰胺 Ⅰ带和酰胺 Ⅱ带。酰胺 Ⅰ带是羰基 (C = O) 的伸缩振动区 ,而
酰胺 Ⅱ带为 C2N 伸缩振动和 N2H 变形振动的组合〔4〕。从粪产碱菌及其变种的酰胺 Ⅰ、酰胺 Ⅱ
的二阶导数的光谱可见 ,1660～1650cm - 1处和 1550～1540cm - 1处的吸收峰分别代表酰胺 Ⅰ
带和酰胺 Ⅱ带的α2螺旋构象。1630cm - 1和 1525～1520cm - 1处的吸收峰分别代表酰胺 Ⅰ带和
酰胺 Ⅱ带的β2折叠特征吸收峰。从表 1 可以看出 ,粪产碱菌及其变种的 EPS 中存在α2螺旋及
β2折叠构象 ,而且β2折叠构象占相当大的比例。无规卷曲一般在 1645cm - 1及 1535cm - 1附近
形成吸收峰 ,粪产碱菌 EPS 丰富型菌株无规卷曲构象所占比例较大 ,而野生型菌株没有无规
卷曲构象的吸收峰。
(三) EPS 的紫外光谱
EPS 的紫外可见 (200～1000nm)光谱测定表明 ,不同菌株在可见光谱范围的吸收没有差
异 ,而在紫外区存在微小差异。对紫外区进行二阶导数处理 ,使得各菌株之间存在的异同清晰
可见 (图 2、3) 。各个菌株在 210～250nm 有强吸收带 ,表示有 K吸收带 ,可能含有两个双键的
共振体系 ,在 260～300nm 处有弱吸收带 (R 吸收带) ,主要是羰基。对各菌株 EPS 的 HMW 组
分进行紫外光谱分析 (图 3) ,其结果发现 ,高分子量 EPS 组分 ,260～300nm 吸收增强。
图 3 　高分子量 EPS的紫外
二阶导数光谱
Fig. 3 　Second derivative UV
spectra of HMW EPS
图 2 　EPS的紫外二阶导数光谱
Fig. 2 　Second derivative UV
spectra of EPS
参 考 文 献
1 　洪山海. 光谱解析法在有机化学中的应用. 北京 :科学出版社 ,1980
2 　李长治. 分子谱新技术. 北京 :科学出版社. 1986 ,82～126
3 　沈淑娟 ,方绮云. 波谱分析的基本原理及应用. 北京 :高教出版社 ,1988
4 　姚新生. 陈英杰. 有机化合物波谱分析. 北京 :卫生出版社 ,1988
5 　宫泽辰雄 ,荒田洋治 ,彭朴 ,宋维民 ,张友吉译. 核磁共振实验新技术及其应用. 北京 :化学工业出版社 ,1990
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481 核　农　学　报 10 卷
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CHARACTERIZATION OF EXOPOLYSACCHARIDES FROM
Alcaligenes f aecalis AND ITS MUTANTS
Fang Xuanjun 　Lin Min 　You Chongbiao
( Instit ute f or A pplication of A tomic Energy , Chinese Academy of A gricult ural Sciences , Beiji ng 　100094)
ABSTRACT
　　The structure of sugar backbone of EPS isolated from all tested strains except A1523 , were
not different from each other based on 1 H2NMR,but strains variation in side chains was found.
FTIR examination conf irmed these results and revealed variations in the polypeptide conforma2
tion among different strains. The absorbance frequency of the amide Ⅰand Ⅱbands of EPS for
all tested strains were recorded by FTIR. These data indicate that the secondary structure of
EPS are different.
Key words : A lcaligenes f aecalis , exopolysaccharides ( EPS) , sugar backbone , polypeptide
conformation
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1996 ,10 (3) :181～185