全 文 ：文章编号 :100028551 (2003) 032175204
水稻胚乳突变体的诱发及其微卫星
分子标记鉴定
吴殿星　段智英　舒庆尧　沈圣泉　韩娟英　夏英武
(浙江大学原子核农业科学研究所 ,浙江 杭州　310029)
摘　要 :用 350Gy 60 Coγ射线辐照高表观直链淀粉含量 (apparent amylose content ,AAC)
早籼稻新品种金早 97247 ,筛选鉴定出 4 个暗胚乳突变体和 2 个云雾状胚乳突变体。
AAC测定表明 ,暗胚乳和云雾状胚乳突变的 AAC 明显比原亲本低。以 Wxup2Π485 为
引物 ,发现两类胚乳突变的 Wx 基因微卫星分子标记相同 ,与原亲本显著不同 ,前者
为 (CT) 18Π(CT) 18 ,后者为 (CT) 11Π(CT) 11。
关键词 :γ射线辐照 ;水稻 ;胚乳突变 ; Wx 基因微卫星标记
收稿日期 :2001212228
基金项目 :国际原子能机构技术合作项目 CPRΠ05Π013 和浙江省重大项目“9410”资助
作者简介 :吴殿星 (1971～) ,男 ,博士 ,副教授 ,主要从事诱变和分子遗传研究。
在水稻中 ,采用各类理化诱变剂已相继鉴定出多种胚乳突变体 ,糯性突变是其中最常见的
胚乳突变 ,仅γ射线处理品种桂朝 2 号就育成辐糯 101、双辐 1 号等 4 个糯稻品种[2 ,17 ] 。暗胚乳
为另外常见的一种胚乳突变 ,至今已发现了 8 个可导致暗胚乳突变的位点[19 ,20 ] 。另外 ,也有在
诱变处理后分离出皱缩突变、糖质突变、酚质突变和 AC增加子突变的研究报道[13 ] 。这些突变
体为了解淀粉尤其是枝链淀粉精细结构提供了理想的研究素材。
按王宗阳等发表的 Wx 基因核苷酸序列 ,Bligh 等[14 ] 在位于前导内含子剪切点上游 55bp
处发现一段 (CT) n 微卫星序列 ,遂设计一套引物 484Π485 进行 PCR 扩增 ,在水稻中发现 4 种
(CT) n 多态性。Ayres 等[12 ]以近 80 年来美国选育的 92 个品种为材料 ,发现了 8 种多态性 ,其
中的 7 种多态性可解释 89 个非糯品种的 AAC 变异 ,并在糯稻品种 CI5309 中发现特殊的标记
类型 (CT) 16。舒庆尧等[9 ,10 ]以 Wxup2Π485 为引物 ,检测到 9 种不同多态性 ,并且发现水稻亚种
间多态性的差异 ,如籼稻以 (CT) 18Π(CT) 18 型、(CT) 11Π(CT) 11 型及杂合型 (CT) 11Π(CT) 18 为
主 ,粳稻以 (CT) 18Π(CT) 18、(CT) 17Π(CT) 17 和 (CT) 16Π(CT) 16 为主 ,爪哇稻则主要为 (CT) 20Π
(CT) 20 型。包劲松[4 ]和吴殿星[5 ] 先后对 Wx 基因微卫星标记在籼Π籼、籼Π爪背景下的遗传作
了研究。在此基础上 ,吴殿星[7 ]进一步将 Wx 基因微卫星标记与胚乳外观标记和 RVA 谱理化
指标相结合 ,建立水稻淀粉品质改良的综合辅助选择技术。本研究利用60 Coγ射线诱发创造
了胚乳突变体 ,并以 Wx 微卫星标记进行了分子鉴定。
1 　材料和方法
以高产早籼稻新品种金早 97247 为起始材料 ,用 350Gy、剂量率 10GyΠmin 的60 Coγ射线辐照
571　核 农 学 报　2003 ,17 (3) :175～178Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
处理含水量约为 1315 %的干种子。将收获的 M1 主穗逐株脱粒后 ,按吴殿星等[5 ] 建立的直观
识别体系处理 ,尔后经 Satake 糙米机脱壳后直接肉眼观察糙米的胚乳外观。对个别透明度差
的样品 ,进一步以 Satake 精米机加工成精米观察。
测定标样由农业部稻米及制品监督检测中心提供 ,4 个标样的 AAC分别为 112 %、1217 %、
1718 %和 2417 %。种子经 Satake 糙米机脱壳 ,Satake 精米机加工成精米 ,用旋风式磨粉机 (Udy ,
Fort Collins ,Co. ,USA)磨成粉末 ,过 100 目筛。样品连同标样置恒湿柜 2d ,尔后按农业部标准
(NY14721988)测定。测出的光密度值在 Microsoft Excel fx 中进行测定 AAC。胚乳突变的半籽
粒 AAC测定参照申岳正等[3 ]方法 ,以原亲本为参照进行 AAC的校正。
以原亲本及诱变处理后代透明状籽粒为对照 ,对 M3 世代 6 份胚乳突变体进行了 Wx 基因
微卫星标记分子鉴定。试验时 ,将材料 30 ℃浸种 48h 后转移至光温培养箱催芽 ,待幼苗生长至
第 3 叶完全伸展时开始取样。水稻 DNA 的提取参照郑康乐等的方法[8 ] 。
微卫星标记分子检测以 Wxup2Π485 为引物 ,PCR 反应条件参照 Bligh 等[14 ]的方法。PCR 反
应液 20μl ,包括 20ng DNA、012mM dNTP、215mM MgCl2 、50mM KCl、10mM Tris2HCl (pH 910) 、011 %
Triton X2100、012μM 引物 Wxup2 (5′2CTTTGTCTATCTCAAGACAC23′) 、012μM 引物 485 (5′2TTG2
CAGATTCTTCCTGATA23′)和 0125 单位 Taq 聚合酶。反应在 PE29600 热循环仪上进行。PCR 反
应先 95 ℃变性 4min ,接着 94 ℃245s、55 ℃230s 和 72 ℃260s ,35 个循环 ,最后在 72 ℃下延伸 5min。
PCR 扩谱产物在测序电泳仪 (BioRad ,Sequence Electrophoresis) 上用 5 %聚丙烯酰胺凝胶分
离。点样时 ,样品量为 5μl ,电泳缓冲液为 1 ×TBE ,电泳工作电流 50mA ,电压 1500V ,时间约 2
～3h。DNA 染色采用银染法。电泳结束后 ,凝胶连同胶板一起 ,经过固定2染色2显影2固定等
步骤染色。染色完毕后以 Waterman 纸揭胶 ,真空干后扫描分析。
2 　结果分析
211 　诱变材料的种植和筛选
经 350Gy 60 Coγ射线诱变处理后 ,将种子直播于秧田 ,30d 秧龄后按单株移栽大田 ,成熟期
逐株从 M1 植株上收取 1 主穗。按穗单独脱粒 ,进行胚乳直观识别处理。以原亲本为对照 ,逐
穗观察 M2 籽粒的胚乳外观 ,筛选鉴定胚乳变异体。M2 世代跟踪考察胚乳性状的遗传稳定性
和表达特征。M3 世代提取幼苗 DNA ,PCR 扩增鉴定 Wx 突变性质。
212 　M2 籽粒的胚乳突变及其 AAC变异
对 M2 籽粒按穗观察表明 ,仅在 3 个单穗内发现有极少量胚乳性状的显著变异。在 2 个单
穗内各有 2 粒暗胚乳 ,分别将其标记为 op1 (opaque) 、op2、op3、op4。在另一个单穗内观察到 2
粒外观模糊不透明的云雾状胚乳突变 ,标记为 m1 (mist) 、m2。除此之外 ,在其它单穗内未观察
到胚乳性状的明显变异 ,与原亲本金早 97247 一样 ,这些籽粒的胚乳尽管心、腹白较大 ,但外观
呈透明状。
对筛选鉴定出的胚乳突变 ,切除一半胚乳进行 AAC 测定表明 ,胚乳变异体的 AAC 明显降
低 (图 1) 。与原亲本 AAC 为 2411 %相比 ,呈现暗胚乳突变的 AAC 极低 ,AAC 分别为 213 %、
414 %、517 %和 713 % ,而云雾状胚乳突变的 AAC相对略高 ,AAC分别为 1219 %和 1312 %。
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213 　两类胚乳突变的表达特征
跟踪观察表明 ,入选的暗胚乳和云雾状突变均能在 M3 籽粒中得以表达 ,显现上代相一致
的胚乳突变性状。AAC分析也说明 ,穗行的籽粒 AAC相类似 ,较低但相互之间的差异不显著。
上述结果表明 ,胚乳突变性状能稳定遗传。但深入细致观察发现 ,两类胚乳突变的表达特征存
在显著的差异。在刚收获时 ,两类胚乳突变与原亲本金早 97247 一样 ,呈现透明状的胚乳外
观。经一般简单干燥后 ,两者开始显现不同的特性。暗胚乳突变表达出突变性状 ,而云雾状突
变仍未表达 ,仍旧呈透明状。只有经充分干燥后、较长的时间贮藏后或识别法处理后才能完全
显现云雾性状。
214 　胚乳突变的 Wx 基因微卫星分子鉴定
以原亲本和上述单株内透明状籽粒为对照 ,进行胚乳突变的 Wx 微卫星标记分子鉴定表
明 ,暗胚乳突变和云雾状突变的微卫星分子标记相同 ,但与对照明显不同 (图 2) 。按舒庆尧
等[10 ]和吴殿星[7 ] 的研究结果 ,两类胚乳突变的 Wx 微卫星分子标记为 (CT) 18Π(CT) 18 ,而原亲
本和透明状籽粒相同 ,为 (CT) 11Π(CT) 11。
图 1 　暗胚乳和云雾状胚乳突变体的
表观直链淀粉含量
Fig. 1 　Apparent amylose contents of the
mutants with dull and misty endosperm
图 2 　暗胚乳和云雾状胚乳突变体、原亲本
和透明籽粒的 Wx 微卫星标记
Fig. 2 　The Wx microsatellite markers of the
dull and misty endosperm mutants ,the original
parent ,and the transparent endosperm
3 　讨论
经自然或人工诱发突变 ,已先后筛选了糯性 (waxy) 、暗色 (dull) 、粉质 (floury) 、皱缩 (shrunk)
等 9 类胚乳突变体 ,其中的 5 类突变与直链淀粉含量关联。本研究诱发产生的两类胚乳与上
述胚乳突变相似 ,也与直链淀粉含量紧密联系。但是 ,胚乳外观呈模糊不透明的云雾状突变 ,
尽管与上述的胚乳突变尤其是暗胚乳突变具有相类似的特征 ,但实际上存在显著的差异。首
先 ,性状的表达方式明显不同。暗胚乳突变一般干燥后即可表达 ,而云雾性状表达的“掩饰性”
很强 ,在刚收获时仍旧透明 ,仅在充分干燥后或经较长的时间贮藏后才得以显现 ;其次 ,临界的
AAC明显不同。du 等暗胚乳突变是 Satoh 和 Omura[19 ] 采用化学诱变剂处理 ,从低 AAC 材料中
诱发产生 AAC明显降低的突变体 ,AAC 介于 119～517 %之间 ,与本研究中获得的暗突变属于
同一类型 ,而云雾状突变的 AAC高于报道的该类胚乳突变。
采取 Wx 基因微卫星分子标记已先后在水稻中发现多态性[4 ,9 ,7 ,12 ,14 ] ,并用于水稻区分。本
研究中 ,利用 Wx 微卫星标记进行两类胚乳突变的真实性分子鉴定 ,发现胚乳突变的 Wx 基因
微卫星分子标记发生了变化 ,由 (CT) 11Π(CT) 11 突变为 (CT) 18Π(CT) 18。随着 Wx 微卫星标记
771　3 期 水稻胚乳突变体的诱发及其微卫星分子标记鉴定
多态性的不断发现 ,在诱变育种实践中 ,以 Wx 微卫星标记研究将会揭示更多的 Wx 突变信息 ,
也为深入研究 Wx 位点间相互突变性及其演化规律提供基础。
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INDUCTION OF ENDOSPERM MUTANTS AND CHARACTERIZATION OF THE
MICROSATELLITE MARKER IN RICE( Oryza sativa L. )
WU Dian2xing 　DUAN Zhi2ying 　SHU Qing2yao 　SHEN Sheng2quan 　HAN Juan2ying 　XIA Ying2wu
( Institute of Nuclear Agricultural Sciences , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang prov. 　310029)
Abstract :Four dull endosperm mutants and two misty endosperm mutant of rice ( Oryza sativa
L. ) were induced from a high apparent amylose early indica rice ———Jinzao 97247 with 350 Gyγ2
rays irradiation. AAC of the endosperm mutants was signif icantly lower than that of the original
parent. Using the Wxup2Π485 as primer , it was found that both types of endosperm mutants had
the same microsatellite markers of Wx gene in ( CT) 18Π( CT) 18 , which was different from that of
the original parent in ( CT) 11Π( CT) 11.
Key words :γ2irradiation ; rice ; endosperm mutation ; microsatellite marker of Wx gene
871 Acta Agriculturae Nucleatae Sinica
2003 ,17 (3) :175～178