全 文 ：植物科学学报　 ２０１５ꎬ ３３(４): ５２１~５２７
Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｊｏｕｒｎａｌ
　 　 ＤＯＩ:１０􀆰 １１９１３ / ＰＳＪ􀆰 ２０９５－０８３７􀆰 ２０１５􀆰 ４０５２１
极性生长的细胞中胞嘧啶甲基化的动态变化
及其对 ＧＡＢＡ信号的响应
崔国鹏ꎬ 王圣洁ꎬ 覃 瑞ꎬ 刘 虹ꎬ 龚汉雨ꎬ 李 刚ꎬ 余光辉∗
(武陵山区特色资源植物种质保护与利用湖北省重点实验室ꎬ 南方少数民族地区资源保护
综合利用联合工程中心ꎬ 中南民族大学生命科学学院ꎬ 武汉 ４３００７４)
摘　 要: ＤＮＡ胞嘧啶(Ｃ)的甲基化(５ｍＣ)在植物发育过程中具有重要的调节作用ꎬ 多种环境因子如逆境胁迫、
植物内 /外源性因子等均会触发 ＤＮＡ甲基化的变化ꎮ 为探讨 γ￣氨基丁酸(ＧＡＢＡ)对植物发育的可能调节机制ꎬ
本研究以极性生长的烟草花粉管和拟南芥根为材料ꎬ 分析 ５ｍＣ 的含量及其对 ＧＡＢＡ 信号的响应ꎮ 结果表明ꎬ
１􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＧＡＢＡ能显著促进烟草花粉管和拟南芥根的极性生长ꎻ 同时ꎬ ＧＡＢＡ处理使烟草花粉管和拟南芥根
的基因组中 ５ｍＣ含量显著降低、 ５￣羟基胞嘧啶(５ｈｍＣ)含量显著增加ꎮ ５ｈｍＣ是 ５ｍＣ去甲基化途径中的一个重
要中间产物ꎬ 本研究证实了 ＧＡＢＡ可以作为一种重要的外源信号调节 ＤＮＡ甲基化的动态变化ꎮ
关键词: γ￣氨基丁酸(ＧＡＢＡ)ꎻ ＤＮＡ甲基化ꎻ ５￣甲基胞嘧啶(５ｍＣ)ꎻ ５￣羟基胞嘧啶(５ｈｍＣ)
中图分类号: Ｑ９４５　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ２０９５￣０８３７(２０１５)０４￣０５２１￣０７
　 　 　 收稿日期: ２０１５￣０１￣１９ꎬ 退修日期: ２０１５￣０３￣１６ꎮ
　 基金项目: 国家自然科学基金面上项目(３１２７０３６１)ꎮ
　 作者简介: 崔国鹏(１９９１－)ꎬ 男ꎬ 硕士研究生ꎬ 研究方向为植物细胞生物学(Ｅ￣ｍａｉｌ: ｇｐｃｕｉ２０１２＠１６３􀆰ｃｏｍ)ꎮ
　 ∗通讯作者(Ａｕｔｈｏｒ ｆｏｒ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ􀆰 Ｅ￣ｍａｉｌ: ｙｕｓｈｅｅｎ＠１６３􀆰ｃｏｍ)ꎮ
Ｄｙｎａｍｉｃ Ｃｈａｎｇｅｓ ｏｆ Ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ｉｎ Ｐｏｌａｒｉｚｅｄ Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ
Ｔｈｅｉｒ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ＧＡＢＡ Ｓｉｇｎａｌｓ
ＣＵＩ Ｇｕｏ￣Ｐｅｎｇꎬ ＷＡＮＧ Ｓｈｅｎｇ￣Ｊｉｅꎬ ＱＩＮ Ｒｕｉꎬ ＬＩＵ Ｈｏｎｇꎬ ＧＯＮＧ Ｈａｎ￣Ｙｕꎬ
ＬＩ Ｇａｎｇꎬ ＹＵ Ｇｕａｎｇ￣Ｈｕｉ∗
(Ｈｕｂｅｉ Ｐｒｏｖｉｎｃｉａｌ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｐｌａｎｔｓ ｉｎ Ｗｕｌｉｎｇ Ａｒｅａ ｏｆ Ｃｈｉｎａꎬ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ ｉｎ Ｅｔｈｎｉｃ Ａｒｅａ ｏｆ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｃｈｉｎａꎬ
Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｓｏｕｔｈ￣Ｃｅｎｔｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｆｏｒ Ｎａｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓꎬ Ｗｕｈａｎ ４３００７４ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: ＤＮＡ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ (５ｍＣ) ｐｌａｙｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｒｏｌｅ ｉｎ ｐｌａｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ. Ａ
ｖａｒｉｅｔｙ ｏｆ ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ ｆａｃｔｏｒｓꎬ ｓｕｃｈ ａｓ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ａｎｄ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ ｓｔｒｅｓｓ ｆａｃｔｏｒｓꎬ
ｃａｎ ｔｒｉｇｇｅｒ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ. Ｔｏ ｅｘｐｌｏｒｅ ｔｈｅ ｐｏｓｓｉｂｌｅ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｂｙ γ￣
ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ (ＧＡＢＡ) ｉｎ ｐｌａｎｔ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔꎬ ｗｅ ａｎａｌｙｚｅｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ５ｍＣ ａｎｄ ｉｔｓ
ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ＧＡＢＡ ｓｉｇｎａｌｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｏｌａｒｉｚｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｏｌｌｅｎ ｔｕｂｅｓ ａｎｄ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｒｏｏｔｓ. Ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ＧＡＢＡ (１􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ) ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｐｒｏｍｏｔｅｄ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｔｏｂａｃｃｏ
ｐｏｌｌｅｎ ｔｕｂｅｓ ａｎｄ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｒｏｏｔｓꎬ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ５ｍＣ ｉｎ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ
ＤＮＡ ｏｆ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｏｌｌｅｎ ｔｕｂｅｓ ａｎｄ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｒｏｏｔｓꎬ ａｎｄ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ５￣ｈｙｄｒｏｘｙｌ
ｃｙｔｏｓｉｎｅ (５ｈｍＣ) . ５ｈｍＣ ｉｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｏｆ ５ｍＣ ａｃｔｉｖｅ ｄｅｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｖｉａ ｉｔｓ
ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｐａｔｈｗａｙ. Ｏｕｒ ｒｅｓｕｌｔｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ ｔｈａｔ ＧＡＢＡꎬ ａｓ ａｎ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｅｘｏｇｅｎｏｕｓ
ｓｉｇｎａｌꎬ ｃｏｕｌｄ ｒｅｇｕｌａｔｅ ｄｙｎａｍｉｃ ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: γ￣Ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ ( ＧＡＢＡ )ꎻ Ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ ＤＮＡꎻ ５￣Ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ( ５ｍＣ )ꎻ
５￣Ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｍｅｔｈｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ(５ｈｍＣ)
　 　 ＤＮＡ甲基化是一种重要的表观遗传修饰ꎬ 甲基
基团的添加通常发生在胞嘧啶的第 ５ 位碳原子
(５ｍＣ)上ꎮ 对动物细胞的研究表明ꎬ ５ｍＣ的去甲基
化是一个主动氧化的过程ꎮ ５ｍＣ在 α￣酮戊二酸依赖
的氧化酶如 ＴＥＴ(Ｔｅｎ￣Ｅｌｅｖｅｎ￣Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ)的迭代
催化作用下ꎬ 先后氧化为 ５￣羟基胞嘧啶(５ｈｍＣ)、
５￣甲酰基胞嘧啶(５ｆＣ)和 ５￣羧基胞嘧啶(５ｃａＣ)ꎻ 然
后 ５ｆＣ和 ５ｃａＣ在胸腺嘧啶 ＤＮＡ糖基化酶( ｔｈｙｍｉｎｅ
ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅｓꎬ ＴＤＧ)的作用下被切除ꎬ 再经过
碱基切除修复途径(ｂａｓｅ ｅｘｃｉｓｉｏｎ ｒｅｐａｉｒꎬ ＢＥＲ)实
现主动地去甲基化[１]ꎬ 即被还原为胞嘧啶(Ｃ)ꎮ
ＤＮＡ甲基化的动态变化在胚胎发生和细胞重
编程过程中起着重要作用[２ꎬ３]ꎮ 同样ꎬ ＤＮＡ胞嘧啶
的甲基化在植物发育过程中也起着重要的调节作
用[４－６]ꎬ 植物对逆境胁迫的响应和适应均会触发
ＤＮＡ甲基化的动态变化[７]ꎮ 此外ꎬ 多种环境因子
以及植物的内源性、 外源性因子都可能在植物发育
的不同阶段影响 ＤＮＡ 的甲基化ꎬ 从而影响特定基
因周围的染色质构象和相应的基因表达[８ꎬ９]ꎮ
γ￣氨基丁酸(ＧＡＢＡ)是一种非蛋白组分的氨基
酸ꎬ 在植物发育过程中起着重要的调节作用[１０－１４]ꎮ
笔者所在课题组前期研究表明ꎬ ＧＡＢＡ可以作为一
种外源信号促进花粉管的生长并且调节 Ｃａ２＋和 Ｋ＋
的流向[１５ꎬ１６]ꎬ 但 ＧＡＢＡ 是否可以作为一种外源信
号触发 ＤＮＡ 甲基化的动态变化尚未见报道ꎮ 为
此ꎬ 本研究以两种极性生长的体系———烟草的花粉
管和拟南芥根为材料ꎬ 探讨 ＧＡＢＡ 对极性生长的
细胞中 ＤＮＡ甲基化的影响ꎮ
１　 材料与方法
１􀆰 １　 材料
实验材料为烟草(Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ‘ＳＲ１’)
的新鲜花粉和拟南芥(Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ ｃｏｌｕｍ￣
ｂｉａ生态型)种子ꎮ
１􀆰 ２　 烟草花粉的萌发和培养
收集烟草盛花期的花粉进行离体萌发和培养
(２７℃黑暗培养)ꎮ 花粉萌发液含有 １􀆰 ６ ｍｍｏｌ / Ｌ
Ｈ３ＢＯ４、 １􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＣａＣｌ２、 １􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＭＥＳ
(２￣(Ｎ￣Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ) Ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ)、 ５％ 蔗
糖、 １􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＧＡＢＡꎬ ｐＨ ５􀆰 ８ꎮ 实验设对照组
(未添加 γ￣氨基丁酸)和实验组(添加 １􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ
ＧＡＢＡ)ꎮ 花粉培养 ６ ｈ 后ꎬ 用移液枪吸取萌发的
花粉管ꎬ 滴加在凹玻片载玻片上ꎬ 置于 Ｌｅｃｉａ
Ｄｍｉｒｅ ２ 倒置显微镜下进行观察、 拍照ꎬ 并用
Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ 软件进行测量分析ꎮ 以未添加 γ￣氨基
丁酸的花粉离体培养为对照ꎬ 实验设置 ３ 次重复ꎬ
每次随机统计 ４０根花粉管长度ꎬ 并用 ＳＰＳＳ １０􀆰 ０
软件进行数据分析ꎮ
１􀆰 ３　 拟南芥的种植及根长的测量
将拟南芥的种子用氯气灭菌法进行消毒处理
后ꎬ 在超净工作台上用灭菌的竹签将其点种在 ＭＳ
培养基(含有 ２％蔗糖、 ０􀆰 ８％琼脂、 １􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ
ＧＡＢＡꎬ ｐＨ ５􀆰 ８~６􀆰 ０)的方形平板上ꎬ 并用封口膜
密封ꎬ ４℃冷藏 ３ ｄꎻ 取出方形平板竖直放置于温
室中培养ꎬ 培养条件为 ２２℃、 １６ ｈ 光照 / ８ ｈ 黑暗
循环ꎮ 以未添加 γ￣氨基丁酸的 ＭＳ 培养基培养为
对照ꎬ 实验设置 ３次重复ꎮ 用米尺测量拟南芥的根
长ꎬ 用相机获取根的生长图像ꎮ
１􀆰 ４　 基因组 ＤＮＡ的提取与浓度检测
将萌发 ６ ｈ的烟草花粉管通过 １２ ０００ ｒ / ｍｉｎ离
心 １ ｍｉｎ进行收集后ꎬ 在液氮环境中用研钵将收集
的花粉管沉淀研磨成细粉用于基因组 ＤＮＡ 的提
取ꎻ 剪取拟南芥(生长 ７ ｄ)幼嫩的根并置于含有液
氮的研钵中ꎬ 研磨成细粉用于基因组 ＤＮＡ 的提
取ꎻ 然后在冷冻状态下分别将烟草花粉管和拟南芥
根的研磨粉末转移到 １􀆰 ５ ｍＬ 离心管中ꎮ 基因组
ＤＮＡ用新型快速植物基因组 ＤＮＡ 提取试剂盒(离
心柱型ꎬ ＢｉｏＴｅｋｅ公司)进行抽提ꎬ ＤＮＡ 的浓度用
ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００ (Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ)进行检测ꎮ
１􀆰 ５　 ＤＮＡ甲基化和羟甲基化的定量检测
ＤＮＡ甲基化(５ｍＣ)、 羟甲基化(５ｈｍＣ)定量检
测的基本原理为: 样品 ＤＮＡ被固定在一种有吸附能
力的孔上ꎬ 然后甲基化或羟甲基化片段被其特异性
抗体所捕获ꎬ 并和显色试剂反应生成有颜色的物质ꎻ
该物质的吸收波长为 ４５０ ｎｍꎬ 其吸收值可用 Ｔｅｃａｎ
Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００ Ｐｒｏ多功能酶标仪(Ｔｅｃａｎꎬ Ｓｗｉｓｓ)进
行比色测量ꎮ ＤＮＡ甲基化(５ｍＣ)、 羟甲基化(５ｈｍＣ)
的定量用特异性试剂盒(Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ 公司)进行检测ꎬ
操作过程严格按照说明书的步骤进行ꎻ ＤＮＡ甲基化
检测中样品 ＤＮＡ 的最优上样量为 １００ ｎｇꎬ 羟甲基
２２５ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷　
化检测中样品 ＤＮＡ的最优上样量为 ２００ ｎｇꎮ 样品
中 ＤＮＡ甲基化(５ｍＣ)、 ５￣羟基胞嘧啶(５ｈｍＣ)的
量根据标准品的吸收值绘制的标准曲线进行计算ꎬ
然后根据试剂盒中提供的公式计算 ５ｍＣ 和 ５ｈｍＣ
在样品 ＤＮＡ中的百分含量ꎮ 计算公式如下:
５ｍＣ(ｎｇ) ＝ Ｓａｍｐｌｅ ＯＤ
－ ＭＥ３ ＯＤ
Ｓｌｏｐｅ × ２∗
ꎻ
５ｍＣ(％) ＝ ５ｍＣ(ｎｇ)
Ｓ
× １００％ (１)
式(１)中: ２∗是一个代数ꎻ Ｓ 代表 ＤＮＡ 样本
的初始输入量(ｎｇ)ꎻ Ｓｌｏｐｅ 为斜率ꎻ ＯＤ 为平均
值ꎻ ＭＥ３为试剂盒中的一种阴性对照ꎮ
５ｈｍＣ(ｎｇ) ＝ Ｓａｍｐｌｅ ＯＤ
－ ＨＣ４ ＯＤ
Ｓｌｏｐｅ × ５∗
ꎻ
５ｈｍＣ(％) ＝ ５ｈｍＣ(ｎｇ)
Ｓ
× １００％ (２)
式(２)中: ５∗是一个代数ꎻ Ｓ 代表 ＤＮＡ 样本
的初始输入量( ｎｇ)ꎻ Ｓｌｏｐｅ 为斜率ꎻ ＯＤ 为平均
值ꎮ ＨＣ４为试剂盒中的一种阴性对照ꎮ
１􀆰 ６　 数据统计和分析
文中图表数据均用 ２ ~３ 次独立实验的平均
值 ±标准差(ＳＤ)来表示ꎻ 差异显著性用 ｔ 检验
(Ｓｔｕｄｅｎｔ’ｓ ｔｅｓｔ)进行分析(Ｐ < ０􀆰 ０５)ꎮ
２　 结果与分析
２􀆰 １　 １􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＧＡＢＡ 能促进烟草花粉管的快
速生长
花粉管的极性生长是植物受精过程中输送精细
胞完成双受精的前提条件ꎮ 由于花粉管在雌蕊柱头
上生长环境的复杂性ꎬ 常需要离体培养以简化研究
体系ꎬ 其中烟草花粉管离体培养是研究极性生长的
理想系统ꎮ 对烟草花粉的离体培养结果表明ꎬ 烟草
花粉管生长较为迅速ꎬ 离体培养 ６ ｈ时花粉管的平
均长度为 ４００ μｍ (图 １: Ａ、 Ｃ)ꎮ 为探讨 γ￣氨基
400 mμ 400 mμA B
0
100
200
300
400
500
600
700
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Ａ: 对照组ꎬ 未添加 ＧＡＢＡꎻ Ｂ: 处理组ꎬ 添加了 １􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＧＡＢＡꎮ
Ａ: Ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐꎬ ｗｉｔｈｏｕｔ ＧＡＢＡ ａｄｄｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍꎻ Ｂ: Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐꎬ ｗｉｔｈ
１􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＧＡＢＡ ａｄｄｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ.
图 １　 ＧＡＢＡ对烟草花粉管生长的影响
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ γ￣ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｔｏｂａｃｃｏ ｐｏｌｌｅｎ ｔｕｂｅｓ
３２５　 第 ４期　 　 　 　 　 　 　 崔国鹏等: 极性生长的细胞中胞嘧啶甲基化的动态变化及其对 ＧＡＢＡ信号的响应
丁酸(ＧＡＢＡ)对烟草花粉管生长的影响ꎬ 我们在其
离体培养体系中添加了不同浓度的 ＧＡＢＡꎬ 发现
１􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＧＡＢＡ 对花粉管生长的促进作用最为
明显ꎬ 且离体培养 ６ ｈ 时花粉管的平均长度达
７００ μｍ (图 １: Ｂ、 Ｃ)ꎮ 说明 ＧＡＢＡ作为外源性信
号能显著促进花粉管的快速生长(Ｐ < ０􀆰 ０５)ꎬ 并在
烟草花粉管的极性生长中具有重要的调节作用ꎮ
２􀆰 ２　 ＧＡＢＡ 能降低生长的烟草花粉管中 ＤＮＡ
５ｍＣ含量和增加 ５ｈｍＣ的比例
极性生长的花粉管中涉及到许多信号途径基因
的表达[１６]ꎬ ＤＮＡ甲基化是调节基因表达的一种重
要的表观遗传修饰ꎮ 为理解外源性信号 ＧＡＢＡ 是
否对 ＤＮＡ甲基化及其动态变化产生影响ꎬ 我们分
别分析了图 １ 中对照组(未添加 ＧＡＢＡ)和处理组
(添加 １􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＧＡＢＡ)的烟草花粉管中 ＤＮＡ
甲基化和羟甲基化的含量ꎮ 根据标准品的吸收值绘
制的 ＤＮＡ甲基化和羟甲基化含量计算的线性回归
方程分别为 ｙ ＝ ０􀆰１９７４ｘ ＋ ０􀆰５８８９(Ｒ２ ＝ ０􀆰９２８)和
ｙ ＝ ０􀆰１０８ｘ ＋ ０􀆰１８２(Ｒ２ ＝ ０􀆰９９９６)ꎬ 以此线性回归
方程可计算出: 生长 ６ ｈ 的对照组烟草花管中
ＤＮＡ ５￣甲 基 胞 嘧 啶 ( ５ｍＣ ) 含 量 达 ７􀆰 ５‰ꎬ
１􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＧＡＢＡ 处理组的烟草花粉管中 ＤＮＡ
５ｍＣ含量为 ５􀆰１‰(图 ２: Ａ)ꎬ 表明 ＧＡＢＡ 处理显
著降低了生长的烟草花粉管中 ＤＮＡ 甲基化水平
(Ｐ < ０􀆰 ０５)ꎮ ５￣羟基胞嘧啶(５ｈｍＣ)是 ５ｍＣ 主动
去甲基化途径中的第一个中间产物ꎮ 萌发 ６ ｈ的对
照组烟草花粉管中 ＤＮＡ ５ｈｍＣ 含量为 ０􀆰０９‰ꎬ 而
１􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＧＡＢＡ 处理使其 ５ｈｍＣ 含量 (达
０􀆰 ４０‰)显著增加了 ４􀆰 ４５倍(Ｐ < ０􀆰０５)(图 ２: Ａ)ꎮ
为直观显示 ＤＮＡ 甲基化的动态变化ꎬ 我们比
较了 ５ｈｍＣ在 ５ｍＣ中的百分含量ꎮ 结果表明ꎬ 对
照组中 ＤＮＡ ５ｈｍＣ 的百分含量为 １􀆰１６％ꎬ 而
ＧＡＢＡ 处理组中 ５ｈｍＣ 的百分含量高达 ７􀆰 ９６％ꎬ
约是对照组的 ６􀆰 ８６倍(图 ２: Ｂ)ꎮ
２􀆰 ３　 １􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＧＡＢＡ 对拟南芥根的生长有显
著促进作用
为证实 ＧＡＢＡ对极性生长的细胞有促进作用ꎬ
我们进一步以拟南芥根为材料进行研究ꎮ 结果发
现ꎬ 在 ＭＳ培养基中添加 １􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＧＡＢＡ并培
养 ７ ｄ后ꎬ 与对照组相比ꎬ ＧＡＢＡ处理显著促进了
拟南芥根的生长ꎬ 其根长约 ５ ｍｍ(图 ３: Ａ、 Ｂ)ꎮ
拟南芥根的生长曲线显示(图 ３: Ｃ)ꎬ ＧＡＢＡ 对根
生长的促进作用在处理后第 ３ ｄ 开始显现ꎬ 至第
６ ~ ７ ｄ时促进作用达到显著差异水平(Ｐ < ０􀆰 ０５)ꎮ
２􀆰 ４　 ＧＡＢＡ能降低生长的拟南芥根中 ＤＮＡ ５ｍＣ
含量水平和增加 ５ｈｍＣ的比例
为验证 ＧＡＢＡ对 ５￣甲基胞嘧啶(５ｍＣ)的动态
调节作用ꎬ 我们提取拟南芥(生长第 ７ ｄ)根的基因
组 ＤＮＡꎬ 并进一步分析根中 ＤＮＡ ５ｍＣ 和 ５ｈｍＣ
的含量ꎮ 结果表明(图 ４: Ａ)ꎬ 对照组拟南芥根中
５ｍＣ含量为 １􀆰 ７３‰ꎬ 而 １􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＧＡＢＡ处理
显著降低了根中 ５ｍＣ 含量 (约为 ０􀆰 ５１‰) ( Ｐ <
０􀆰 ０５)ꎻ 在拟南芥根的生长过程中ꎬ 对照组和处理
组根中 ５ｈｍＣ含量分别为 ０􀆰 １２‰和 ０􀆰 ２０‰ꎮ 由图
４: Ｂ 可知ꎬ 对照组根中 ５ｈｍＣ 在 ５ｍＣ 中的百分
含量为 ６􀆰 ９８％ꎬ 而处理组根中 ５ｈｍＣ在 ５ｍＣ中的
百分含量高达 ３８􀆰 ５９％ꎬ 表明在拟南芥根生长过程
中ꎬ ＧＡＢＡ处理能够引起甲基化 ＤＮＡ中更大比例
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Ｅｒｒｏｒ ｂａｒｓ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ｓ.ｄ. ｆｒｏｍ ｔｈｒｅｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ. ∗ ｄｅｎｏｔｅｓ Ｐ < ０.０５ꎬ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ. Ｓａｍｅ ｂｅｌｏｗ.
图 ２　 ＧＡＢＡ处理对烟草花粉管中 ＤＮＡ ５ｍＣ和 ５ｈｍＣ含量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ γ￣ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ５ｍＣ ａｎｄ ５ｈｍＣ ｉｎ ｐｏｌｌｅｎ ｔｕｂｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ
４２５ 植 物 科 学 学 报 第 ３３卷　
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Ａ: 对照组ꎬ 未添加 ＧＡＢＡꎻ Ｂ: 处理组ꎬ 添加了 １􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＧＡＢＡꎻ Ｃ: 根长随时间的变化曲线ꎮ
Ａ: Ｃｏｎｔｒｏｌ ｇｒｏｕｐꎬ ｗｉｔｈｏｕｔ ＧＡＢＡ ａｄｄｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍꎻ Ｂ: Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｇｒｏｕｐꎬ １􀆰 ０ ｍｍｏｌ / Ｌ ＧＡＢＡ
ａｄｄｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ｍｅｄｉｕｍꎻ Ｃ: Ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｒｏｏｔ ｌｅｎｇｔｈ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｔｉｍｅ ｃｏｕｒｓｅ (ｄ) ｏｆ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ.
图 ３　 ＧＡＢＡ处理对拟南芥根生长的影响
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ γ￣ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ ｏｎ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｒｏｏｔｓ
0
0 2.
0 4.
0 6.
0 8.
1
1.2
1 4.
1 6.
1 8.
2
!"
Control
!"
Control
#$
. /1 0 mmol L GABA
#$
. /1 0 mmol L GABA
5hmC 5mC
0
5
10
15
20
25
30
35
40
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5h
m
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)
图 ４　 ＧＡＢＡ处理对拟南芥根中 ＤＮＡ ５ｍＣ和 ５ｈｍＣ含量的影响
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ γ￣ａｍｉｎｏｂｕｔｙｒｉｃ ａｃｉｄ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ５ｍＣ ａｎｄ ５ｈｍＣ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｒｏｏｔ ＤＮＡ
的 ５ｍＣ发生去甲基化ꎬ 这可能与 ＧＡＢＡ 对根生长
的促进作用涉及更多基因的表达有关ꎮ
３　 讨论
植物生长发育的多个阶段和事件在很大程度上
受控于 ＤＮＡ甲基化[１７ꎬ１８]ꎬ 这是由于与发育相关的
基因表达和 ＤＮＡ甲基化引起的染色质结构变化有
关ꎮ 本文首次研究了快速生长的花粉管和根中胞嘧
啶(Ｃ)的甲基化(５ｍＣ)和羟甲基化(５ｈｍＣ)及其动
态变化对 γ￣氨基丁酸(ＧＡＢＡ)信号的应答ꎮ 与极
性快速生长的基因表达相适应ꎬ 花粉管和根在生长
过程中其基因组 ＤＮＡ ５ｍＣ 发生了去甲基化的过
程ꎬ 而 ＧＡＢＡ处理显著增加了 ５ｍＣ去甲基化的比
率(图 ２ꎬ 图 ４)ꎮ 这一结果揭示了 ＧＡＢＡ作为外源
信号可以调节 ＤＮＡ 甲基化的动态变化ꎬ 也在一定
程度上合理解释了 ＧＡＢＡ 对花粉管和根生长的促
５２５　 第 ４期　 　 　 　 　 　 　 崔国鹏等: 极性生长的细胞中胞嘧啶甲基化的动态变化及其对 ＧＡＢＡ信号的响应
进作用可能涉及到 ＧＡＢＡ 对更多基因的表达调节
有关ꎬ 因为遗传物质 ＤＮＡ 中胞嘧啶(Ｃ)的去甲基
化是许多基因表达的关键ꎮ Ｓｌｏｔｋｉｎ等[１９ ]和 Ｂｉｒｎ￣
ｂａｕｍ等[ ２０]研究表明ꎬ 花粉管和根的极性生长受
到大量基因的表达和调节ꎮ 我们前期 ２￣Ｄ ＤＩＧＥ
( Ｔｗｏ￣Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ Ｇｅｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ￣
ｓｉｓ)的质谱分析数据也表明ꎬ 在烟草花粉管生长过
程中有 ２３４ 个蛋白的表达显著受到 ＧＡＢＡ 处理的
影响(１􀆰 ５倍差异表达水平) [２１]ꎻ 基因芯片的分析
数据显示ꎬ ＧＡＢＡ 能够显著促进拟南芥 ８９５ 个基
因的上调表达和 １１０４个基因的下调表达(２倍差异
表达水平) [２２]ꎬ 进一步研究将深入揭示这些基因的
表达与 ＧＡＢＡ引起的基因甲基化模式变化之间的
关系ꎮ
尽管植物和动物基因组的甲基化维持模式有很
大不同[１７]ꎬ 但近年来的研究也明确证实了植物细
胞中存在着 ＤＮＡ羟甲基化(５ｈｍＣ) [２３－２６]ꎬ 暗示了
羟甲基化在植物发育中也具有重要作用ꎬ 很有可能
植物中也存在着类似于动物细胞的氧化去甲基化途
径[１]ꎬ 但其作用机制尚需深入研究ꎮ 本实验不仅
证实了 ＤＮＡ羟甲基化在植物中的存在ꎬ 同时也证
明了极性生长的烟草花粉管和拟南芥根中 ＤＮＡ 甲
基化的动态变化能够响应外源性信号 ＧＡＢＡ 的刺
激ꎮ 本研究尽管尚未深入探讨花粉管和根生长过程
中具体的表观遗传事件以及染色质的状态变化ꎬ 但
目前的数据表明花粉管和根生长过程中整体 ＤＮＡ
甲基化的下降以及 ＧＡＢＡ 促进 ５ｍＣ 去甲基化(经
由 ５ｈｍＣ中间产物)的动态变化ꎬ 这可能与快速生
长的尖端细胞中大量基因的活跃表达有关ꎮ 进一步
深入研究基因表达和基因甲基化的对应关系ꎬ 将会
揭示和完善 ＧＡＢＡ参与的基因表达调节网络ꎮ
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ｌａｔｉｎｇ ｐｕｔａｔｉｖｅ Ｃａ２＋￣ｐｅｒｍｅａｂｌｅ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｈａｎ￣
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(责任编辑: 刘艳玲)
７２５　 第 ４期　 　 　 　 　 　 　 崔国鹏等: 极性生长的细胞中胞嘧啶甲基化的动态变化及其对 ＧＡＢＡ信号的响应