全 文 ：文章编号 :100028551 (2006) 052379204
产γ2氨基丁酸的乳酸菌株筛选及诱变
夏 江1 梅乐和1 黄 俊1 盛 清2 许 静3 吴 晖3
(11 浙江大学化学工程与生物工程学系 ,浙江 杭州 ,310027 ;21 浙江理工大学生命科学学院 ,浙江 杭州 ,310018 ;
31 中美华东制药有限公司 ,浙江 杭州 310011)
摘 要 :γ2氨基丁酸 (γ2aminobutyric acid , GABA)是中枢神经系统一种重要的抑制性神经递质。本研究从
鲜奶中分离得到 1 株高产 GABA 的乳酸菌株 hjxj201 ,经初步鉴定为短乳杆菌。实验结果表明 ,在含 5 %
的L2谷氨酸钠的 GYP 培养基中 ,此乳酸菌产 GABA 最大积累浓度为 7 gΠL。在此基础上 ,又先后使用了
紫外线和γ射线对出发菌株进行了诱变处理。以正突变率为标准确定诱变条件。30W 的紫外灯下 ,距
离 45cm 照射及照射时间 50 s 为紫外线诱变的较佳条件 ;60 Co 射线诱变的适宜剂量为 300 Gy。诱变后得
到 1 株突变菌株 hjxj208119 ,经连续传代 12 次 ,遗传性状稳定 ,平均 GABA 产量达到 17 gΠL ,较出发菌株
hjxj201 提高 14219 %。
关键词 :γ2氨基丁酸 ;诱变 ;60 Coγ射线 ;紫外线照射
SCREENING AND MUTAGENESIS OF Lactobacillus brevis FOR
BIOSYNTHESIS OFγ2AMINOBUTYRIC ACID
XIA Jiang1 MEI Le2He1 HUANGJun1 SHENG Qing2 XU Jing3 WU Hui3
(11 Department of Chemical and Biochemical Engineering , Zhejiang University , Hangzhou , Zhejiang 310027 ;
21 College of Life Science , Zhejiang Sci & Tech University , Hangzhou , Zhejiang 310018 ;
31 East2China Pharmaceutical Company , Hangzhou , Zhejiang 310011)
Abstract :γ2aminobutyric acid ( GABA) is a major inhibitory neurotransmitter in the central nervous system. In this study , a
GABA2producing strain , hjxj201 , was isolated from the milk samples and identified as Lactobacillus brevis . In the GYP
medium containing sodium glutamate , the highest GABA concentration accumulated by Lactobacillus brevis hjxj201 is 7 gΠL.
The strain was treated with UV and 60 Coγ2rays. Based on high positive mutation rate , the final mutagenesis conditions were
UV light 30W , irradiation distance 45cm , irradiation time 50s , and 60 Coγ2rays irradiation of 500 Gy. The mutant strain ,hjxj2
08119 ,was bred by GABA resistance selection. Cultured for 12 generations continually , the GABA2producing capacity of hjxj2
08119 maintained stably. The fermentation results indicate that compared with the origin strain hjxj201 , the average yield of
GABA by hjij208119 is 17 gΠL , which is 14219 % of the origin strain.
Key words :γ2aminobutyric acid ; mutagenesis ; 60 Coγ2irradiation ; UV irradiation
收稿日期 :2005212219
基金项目 :国家自然科学基金 (30570411) 、浙江省科技攻关项目、教育部和浙江省回国人员基金资助项目
作者简介 :夏江 (19802) ,男 ,浙江金华人 ,硕士 ,从事生物化工方面研究 ,Email : woshixiajiang974 @1631com。梅乐和为通讯作者 ,Email : meilh @che.
zju. edu. cn
γ2氨基丁酸 (γ2amino butyric acid , GABA ,也称氨酪
酸)是一种重要的功能性非蛋白质氨基酸 ,作为中枢神
经系统重要的抑制性神经递质 ,能通过突触后膜超极
化、减少离子内流和降低细胞代谢等机制 ,使得神经元
处于保护抑制状态。大量的研究已表明 , GABA 具有
增进脑活力和长期记忆、安神抗抑郁、调节激素分泌、
改善脂质代谢、降血压、治疗癫痫和改善更年期综合症
等重要的生理功能[1～5 ] ,以 GABA 为主要成分的功能
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性食品和以 GABA 为中间体的药物 ,也相继被开发并
得到了广泛的应用 , 例如 , 日本茶饮料 Gabaron 和
GABA 食品添加剂 ,美国辉瑞公司以 GABA 为药物中
间体用于治疗失眠、癫痫的药物等。
目前 ,GABA 的合成制备方法主要有 3 种 :化学合
成、植物富集和微生物发酵。相比而言 ,化学合成安全
性较差 ,植物富集的 GABA 含量很低 ,而微生物发酵合
成 GABA 就显得具有开发前景。在微生物发酵法中 ,
安全性好的乳酸菌生产 GABA 具有很多优点。乳酸菌
可以利用体内的谷氨酸脱羧酶 (glutamate decarboxylase ,
GAD) ,将L2谷氨酸钠 (L2MSG)经α2脱羧后产生 GABA。
生物法合成 GABA 的关键之一就是筛选出具有高谷氨
酸脱羧酶活力的优良菌株。目前 ,国内报道的 GABA
最高产量仅为 311 gΠL ,与日本相关的研究和生产相比
有不少差距。本研究拟从传统食品牛奶中分离出食品
安全级、高效合成 GABA 的菌株 ,并在此基础上 ,通过
紫外线和γ2射线诱变以期获得高产 GABA 的菌株。
1 材料与方法
111 材料
11111 主要试剂 γ2氨基丁酸为 Acros organics 公司
产品 ;丹磺酰氯 (DNS2Cl) 为 Flukachemie 公司产品 ;其
他试剂为国产分析纯级试剂。
11112 培养基组成及培养条件 选择性培养基 :胰酪
胨 10gΠL ,酵母 5gΠL ,葡萄糖 20gΠL , 柠檬酸二铵 2 gΠL ,
吐温280 1mlΠL ,CH3 COONa·3H2O 25gΠL , KH2 PO4 6 gΠL ,
MgSO4 ·7H2O 0158gΠL ,MnSO4 ·4H2O 0115gΠL , FeSO4 ·
7H2O 0103 gΠL ,亚胺环己酮 0101gΠL ,CaCO3 15gΠL ,琼
脂 15gΠL ,pH616～710。温度 30 ℃,培养时间 2d。
GYP 种子培养基[4 ] :葡萄糖 10 gΠL ,酵母 10 gΠL ,蛋
白胨 5 gΠL ,无水乙酸钠 2 gΠL ,MgSO4 ·7H2O 0102 gΠL ,
MnSO4·4H2O 01001 gΠL ,NaCl 01001 gΠL , FeSO4 ·7H2O
01001 gΠL ,pH 618 gΠL。温度 30 ℃,培养时间 1d。固体
培养基为 GYP 培养基中添加琼脂 15 gΠL。
GYP 发酵培养基 :向 GYP 种子培养基中添加一定
量的外源前体 L2MSG作为底物。pH 618 ,温度 30 ℃,
静置培养时间 3d。
梯度平板的制备 :先将普通固体培养基倒入平板 ,
倾斜 15°左右放置 ,待凝固后倒入含产物 GABA 的固体
培养基 ,放平冷凝后形成梯度平板。
112 方法
11211 菌株的分离筛选 取未经巴氏消毒的生牛奶 ,
稀释至不同浓度 ,分别吸取 012 ml 不同浓度的生牛奶
涂布于选择性平板培养基上 ,肉眼挑出生长并有透明
圈的单菌落 ,转接于斜面培养基保藏。将初筛得到的
菌株转接于 GYP 种子培养基中 ,30 ℃下静置培养 1 d ,
然后以 2 %的接种量接入到含 L2MSG(10 gΠL ) 的 GYP
发酵培养基中 ,30 ℃下静置培养 3d。取发酵液进行检
测分析。
11212 分析方法 GABA 定性分析采用纸层析法。将
样品经稀释过滤后点样 5μL ,垂直展开 ,展开剂为 V
(正丁醇)∶V(冰乙酸)∶V(水) = 3∶2∶1 ,其中含 4 gΠL 的
茚三酮。展开结束后 ,滤纸在 90 ℃下烘干显色 20 min ,
比较显色强度。
GABA 定量分析 :采用高效液相色谱法测定[6 ] 。
将离心 (8000 rΠmin ,10 min)后的发酵上清液样品用 012
molΠL (pH 为 918) 的 NaHCO3 稀释 100 倍 , 然后取
012ml ,加入等量的 (4 gΠL) DNS2Cl 丙酮溶液 ,置于 30 ℃
下避光衍生化反应 ,反应中 DNS2Cl 与氨基酸的一级
胺、二级胺、巯基、咪唑基和酚羟基缩合 ,生成 DNS2氨
基酸衍生物 ,再进行相关测定。液相色谱仪 (Agilent
1100)装有 Hypersil ODS C18 柱 (416mm ×250mm) 和紫
外检测器。色谱条件为流动相 A :甲醇 ;流动相 B :四
氢呋喃∶甲醇∶0105molΠL 醋酸钠 = 5∶75∶420 ,VΠVΠV ,
(pH 612) ,经超声脱气后使用 ;流速 110mlΠmin ,在 254
nm条件下采用紫外检测 ,以外标法定量分析。线性梯
度洗脱时 ,各段 B 液的比例为 :026min ,80 % ;6220min ,
80 %～50 % ;20227min 维持 0 % ;27230 min ,返回 80 %。
11213 诱变选育方法 活化后的菌体用无菌生理盐
水 (0185 % 的 NaCl 溶液)稀释 ,紫外线和γ射线诱变前
分别稀释制成细胞密度为 108 个Πml 的菌悬液。
紫外线诱变在 30W 的紫外灯下进行 ,距离照射菌
悬液 45cm ,通过改变照射时间来获得不同的诱变剂
量。60 Co 射线诱变于浙江大学原子核农业科学研究所
进行。
诱变处理后的菌悬液稀释涂布于含代谢产物
GABA 的梯度平板上 ,30 ℃下培养 2d。肉眼观察 ,挑出
在梯度平板上层培养基的较厚处能生长的菌落 ,斜面
保藏 ,再转接于 GYP 种子培养基中 ,30 ℃下静置培养
30h ,然后以 10 %的接种量接入到含 L2MSG(50 gΠL) 的
GYP发酵培养基中 ,30 ℃下静置培养 3d ,取发酵液作
进一步检测分析。
2 结果与讨论
211 菌株的分离和筛选
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利用短乳杆菌选择性培养基从牛奶中共检出 300
余个生长快的单菌落 ,进行摇瓶实验复筛后得到 1 株
高产 GABA 菌株 ,记为 hjxj201 ,已在中国微生物菌种保
藏管理委员会保藏 ,编号为 CGMCC NO. 1306 ,用作进
一步实验用菌。
212 菌株初步鉴定
菌株 hjxj201 在短乳杆菌选择性培养基中 ,发酵时
产乳酸而形成透明圈 ,菌落形态为圆形 ,边缘光滑 ,白
色不透明。镜检观察为杆状 ,大多成对出现 ,少数成链
状 ,不运动 ,无孢子 ,革兰氏染色阳性 ,兼性厌氧。在
5 %NaCl 中能生长。根据伯氏细菌鉴定手册初步鉴定
为短乳杆菌[7 ] 。
213 出发菌株产 GABA 能力
试验结果表明 ,在含 1 %的 L2MSG的 GYP 发酵培
养基中 ,乳酸菌株 hjxj201 最大可积累生成 GABA 近 4gΠ
L。当 GYP 发酵培养基中的外源前体L2MSG的添加量
在 715 %以内时 ,对发酵菌体生物量的生成影响不大
(数据略) ,GABA 的积累情况如图 1 所示。在含 5 %L2
MSG的 GYP 发酵培养基中 ,培养 70h 的 GABA 产量最
高 ,约为 7gΠL。
图 1 不同浓度 L2MSG对 hjxj201 生产 GABA 的影响
Fig. 1 Effect of L2MSGof different concentration
on GABA production of hjxj201
214 诱变选育
21411 最佳诱变剂量的选择 如图 2、3 所示 ,通过观
察紫外线和60 Coγ射线的诱变剂量与菌体致死率之间
的关系 ,按照诱变剂量选择的一般原则 ,选取菌体致死
率大约在 60 %～95 %之间的诱变剂量来观察其正突
变率。梯度平板中生长单菌落 ,经摇瓶发酵与出发菌
株 hjxj201 相比较 ,产量提高的为正突变株 ,最后统计
计算得各诱变剂量下的正突变率 ,把正突变率最高的
剂量作为最佳诱变剂量。从图 2、3 可以得出 ,紫外照
射时间为 50s ,60 Coγ射线照射剂量为 300Gy。
图 2 UV 和60 Coγ辐射对 hjxj201 致死率、
正突变率的影响
Fig. 2 Effects of UV and 60 Coγ2irradiation on the
lethal rate and positive mutant rate of hjxj201
21412 诱变结果 以短乳酸杆菌 hjxj201 为出发菌株 ,
首先对其进行 5 轮紫外线诱变 ,再进行 3 轮γ射线诱
变 ,以含不同浓度 GABA 梯度平板进行初筛 ,初始的 30
gΠL 随诱变的进行 ,最终在 80 gΠL 的 GABA 梯度平板中
筛选出突变株 ,再进行摇瓶复筛。图 4 为各轮诱变所
得的高产菌株 ,在含 L2MSG (50 gΠL) 的 GYP 发酵培养
基下的发酵产物的滤纸层析图。其中 hjxj201 为出发
菌株 , hjxj20205、hjxj20304、hjxj20403、hjxj20502、hjxj20778
和 hjxj208119 分别是第 1、2、3、4、6 和 7 轮诱变后得到
的高产菌株 ;纸层析图中从左至右 ,代表 GABA 的黑圈
不断增大 ,这表明产物 GABA 积累不断增加。经过 8
轮诱变 ,最终得到 1 株高产突变株 hjxj208119 , GABA 产
量从原来的 7 gΠL 提高到了 17 gΠL。
215 hjxj208119 株遗传稳定性的测定
将出发菌株 hjxj201 以及抗反馈突变株 hjxj208119
进行传代遗传稳定性比较 ,共转接 12 代 ,测定结果如
表 1。
由表 1 可知 ,突变株 hjxj208119 的 GABA 产量稳
定 ,未出现回复突变情况。
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表 1 GABA 产生菌的遗传稳定性
Table 1 Genetic stability of GABA2producing stains
传代次数
generation times
2 4 6 8 10 12
GABA 产量平均值
average yield of GABA (gΠL)
出发菌株 original strain hjxj201 611 615 712 714 715 619 6193
突变菌株 mutant strain hjxj208119 1814 1718 1617 1519 1712 1615 17108
图 4 各轮高产突变株发酵液的纸层析图谱
Fig. 4 Paper chromatography scheme of products in the
cultures of the tested mutants
1 :L2MSG;2 : GABA ;3 :hjxj201 ;4 :hjxj20205 ;5 :hjxj20304 ;
6 :hjxj20403 ;7 :hjxj20502 ;8 :hjxj20778 ;9 :hjxj208119
3 结论
从新鲜牛奶样品中分离筛选出 1 株乳酸菌 hjxj2
01。该菌株具有合成 GABA 的能力。在此基础上 ,又
先后用紫外线和γ射线对该出发菌株进行诱变处理 ,
发现紫外线诱变的适宜条件为 30 W 的紫外灯下 ,距离
45cm照射 ,照射时间 50s ;60 Coγ射线诱变的较佳诱变
剂量为 300Gy ;通过多轮诱变和筛选 ,得到了 1 株突变
菌株 hjxj208119 ,经过 12 次传代 ,其 GABA 产量稳定。
在含 5 % L2MSG的 GYP 发酵液中 ,能转化生成 17gΠL
左右的 GABA , 比出发菌株 hjxj201 的产量提高了
14219 %。并且 ,此突变菌能在含 80gΠL GABA 的平板
中生长 ,对产物 GABA 不敏感 ,在目前的补料发酵研究
中发现 ,此突变株的 GABA 最大积累可达到 100gΠL 以
上 ,由此说明本研究使用的紫外线和γ射线是有效的
诱变方法 ,它能使乳酸菌株产 GABA 能力得到一定的
提高。
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