全 文 ：热带亚热带植物学报 2006，l4(3)：251-255
Journal ofTropical and Subtropical Botany
广东野百合 DNA提取和 RAPD条件的优化
黄永芳， 杨懋勋， 柳 军， 周锦平
(华南农业大学林学院，广州 510642)
摘要：以野百合(Lili“m bro n )新鲜叶片、硅胶干燥叶片及鳞片为材料，研究了DNA的提取方法，并对影响随机扩增
多态 DNA rRAPD)反应的各因素进行了优化。建立了野百合 RAPD的优化反应体系及程序，即在 20 ILl反应体系中，
含 20 ng模板 DNA，2．0 mmol／LMg2+,0．2 mmol／L dNTPs、1．5 U DNA聚合酶、0．3~mol／L随机引物 S1519；扩增程
序为：94~C预变性 5 min，然后94"C 30 S，38~C 50 S，72*C l min，35个循环，最后 72*C延伸 10 min，4~C保存。
关键词：野百合；DNA提取；RAPD
中图分类号：Q523 文献标识码 ：A 文章 编号：1005—3395(2OO6)O3一O25l-05
DNA Extraction and Optimization of RAPD Reaction
System for Lilium brownii(Liliaceae)
HUANG Yong．fang， YANG Mao．xun， LIU Jun， ZHOU J in—ping
(Colege of Forestry，South China agricultural University，Guangzhou 510642，China)
Abstract：DNA of Lilium brownii was extracted from the fresh leaves，silica gel dried leaves and scales．The
optimized reaction system and programme of RAPD for Lilium brownii are as folows．The reactions were
performed in a volume of 20 lxl containing 20 ng of DNA，2．0 mmol／L M ，0．2 mmol／L dNTPs，1．5 U Taq DNA
polymerase，0．3 i~mol／L primer(S 1 5 1 9)．Thermal cycling was programmed by 1 cycle for 5 min at 94℃，folowed
by 35 cycles for 30 sec at 94℃，50 sec at 38~C，and 1 min at 72~C and finally，by 1 cycle for 10 min at 72℃，
storing at4"C．
Key words：Lilium browni；DNA extraction；Random amplifed polymorphic DNA(aAPD)
百合有 “球根花卉之王”的美称，为百合科
(Liliaceae)百合属 (Lilium)植物，其用途广泛，具
有药用、食用、观赏价值。我国是百合属植物自然分
布的中心，但由于种种原因，百合育种研究工作较
为落后，目前栽培的绝大多数品种引自国外，由于
引种途径各异，许多品种缺乏背景资料，难以进行
分类鉴定研究，造成品种名称混乱、种系不清等问
题，严重地影响我国百合育种研究及商品种球的生
产l】。加强对我国百合资源尤其是野生资源的研究、
开发和应用，利用我国丰富的百合资源培育出具有
国际竞争力的新品种已刻不容缓。利用 RAPD技术
收稿 日期：2005—11-07 接受日期：2006-03-22
基金项目：广东省教育厅自然科学研究项目(z02008)资助
对我国百合属植物种质资源进行分析，建立百合属
植物的分子鉴别、分类体系，弄清各天然居群的遗
传关系，对我国百合属植物的研究与开发有很大的
促进作用【2]。运用 RAPD技术对百合的遗传多样性
分析已有研究[3-51，但对野百合居群进行 RAPD分析
尚未见报道。
广东省是百合属植物在我国分布的南缘，据文
献记载广东省内野百合只分布于惠阳、乳源、连州、
乐昌等地【6]，而我们在深圳梧桐山、信宜大雾岭等地
也发现有野百合分布。本研究用在广东省内采集到
的野百合样品，进行 DNA提取方法及 RAPD条件
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热带亚热带植物学报 第 l4卷
的优化，为进一步开展野百合的遗传多样性分析，
了解广东省野百合的居群 内与居群间的遗传变异
状况，为广东省百合属植物的系统研究及杂交育种
工作提供科学参考。
1材料和方法
1．1材 料
试验材料为从广东乳源大桥镇采集的野百合
(Lilium browni F．E．Brown ex Mielez)。采新鲜无
病虫害嫩叶，或将嫩叶放入封 口袋中，加入 1：20
(W ^的变性硅胶快速干燥后带回实验室内超低温
冰箱中保存，并采集鳞茎 (或鳞片)进行盆栽。标本
存放于华南农业大学林学院。
1．2试剂和仪器
主要试剂 Tat／DNA聚合酶、PCR缓冲液、
MgCl2为华美生物工程公司产品；脱氧核苷三磷酸
(心汀PS)、随机引物为上海生工生物工程有限公司
产品；琼脂糖 (西班牙产)，购 自宝泰克生物工程有
限公司 ；十六烷 基三 甲基溴 化铵 (cetyl triethyl
ammonium bromide。CTAB)、乙二胺四乙酸二钠
(ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA)、NaCI、
无水乙醇、硼酸 (H3BO )、氯仿、异戊醇 、醋酸钠
(NaAc)等试剂为国产分析纯；三羟甲基氨基甲烷
(Tris-hydroxymethyl aminomethane，Tris)的纯 度
>99．5％，聚 乙烯吡 咯烷酮 (polyvinyl pyrolidone，
PVP)的纯度 >95％，p．巯基乙醇的纯度 >199．0％；
分子量标准 (Marker)：100 bp DNA Ladder Plus为
晶美生物工程有限公司产品；RNA酶 A购 自北京
拜尔迪生物公司；goldview DNA染料购自北京赛百
盛基因技术有限公司。
主要仪器 Centrifuge 5810R型冷冻离心机
为德 国 Eppendorf公司产 品；PCR仪 ：PTC．100TM
Peltier Thermal Cycler为美国MJ ResearchTM公司产
品；DYY．1l型电泳仪购自北京市六一仪器厂；凝胶
成像与分析系统：捷达 801专业数码凝胶成像与分
析系统 3．3．1为江苏省捷达软件工程有限公司产
品。
在液氮中迅速研磨成细粉末状后加入 600 l 80"(2
预热的2xCTAB提取缓冲液 (2％CTAB；1．4 mol／L
NaCl；20 mmol／L EDTA(pH 8．0)；100 mmoFL Tris-
HCI(pH 8．0)；2％PVP。用前加入 2％(V厂、，)的B．巯
基乙醇)，56℃水浴保温 30 min，期间每隔几分钟摇
动一次；②加入 600 l氯仿：异戊醇 (24：1)，振荡
混匀 10 min，室温下 6 000xg，离心15 min：③取上清
液，加入 1／10体积的 10％ CTAB及 2／3体积氯仿：
异戊醇 (24：1)，振荡混匀 10 rain，室温下 6 000xg，
离心 10 min；④取上清液，加入 1／1000体积的 RNA
酶 A，使其终浓度 为l0 g TIl～。放 置 37~C水浴
30 min以上：⑤加入 1／10体积的3 mol／L NaAc及 2
倍体积的冷无水酒精，轻轻混匀，将离心管置于 4℃
冰箱中沉淀 30 min以土；⑥将成团的悬浮物用广口
无菌吸管头吸出，转至新的离心管中，去掉水相；⑦
用 70％酒精洗沉淀 1—2次，将离心管倒置在吸水纸
上，置于通风橱内干燥沉淀；⑧加入适量的 lxTE
(Tris．EDTA)溶解沉淀，置于一20℃冰箱中保存备
用。
(2)硅胶干燥叶片：取 0．3 g硅胶干燥的叶片，
用 2xCTAB提取缓冲液进行 DNA提取，各试剂用
量及提取方法同 (1)。
(3)鳞片：取 0．8 g经蒸馏水冲洗并晾干后的
野生百合鳞片，加入 1 ml4xCTAB提取液 (提取液
中 PVP的浓度增至 4％，用前加入 4％ (V厂、，)的
B．巯基乙醇；)，在冰浴下研磨成匀浆后转入 1．5 ml
离心管中，再加入 0．5 ml 4xCTAB提取液充分摇
匀，60℃温浴 30 min，期间每隔几分钟摇动一次，
6 000xg，4"C下离心 15 min，之后的步骤与方法 (1)
基本相同，不同在于用冰乙醇沉淀 DNA之前，往第
二次氯仿：异戊醇 (24：1)处理后的上清液中加入
1／2体积的 5 mol／L NaCI，4"C放置 30 min。
1．4 DNA质量和浓度的电泳检测
分别取 2 l DNA溶液用 0．8％琼脂糖凝胶，加
入 5 l(100 m1) 凝胶 的 goldview荧光染料 ，以
4 V cm 的电压进行电泳分析，至指示剂移动到凝
胶前沿停止电泳。在捷达凝胶分析系统成像及分
析。
1．3 DNA提取
根据 RAPD扩增的实验要求和现有实验条件， 1．5 RAPD反应条件的优化
设计了3种样品DNA提取处理方法： 以新铁炮百合 (Liliumformolongi)的 RAPD反
(1)新鲜幼嫩叶片：①取 0．8 g新鲜幼嫩叶片， 应体系 (在 20 反应体系中，含 50 ng~ DNA，
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1．6 RAPI}扩增产物的检测
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2．1 DNA提取
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2．2 RAI，D反应体 系的优化
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第 3期 黄永芳等：广东野百合 DNA提取和 RAPD条件的优化 255
较低的退火温度下(小于 37~C)，PCR非特异扩增产
物过多，条带清晰度不好；退火温度为 39℃，40℃
时，部分样品没有扩增产物；37℃，38℃为较适宜的
退火温度 ，而退火温度为 38℃的扩增稳定性 比
37℃更好，最终选定退火温度为 38℃。
2．3．2循环次数
当PCR循环次数为30次时，DNA不能得到充
分的扩增，扩增带少而模糊；而循环次数为 35次时
带型清晰、稳定。最终选定 PCR循环次数为35次。
运用优化好的体系及程序 ，即在 20 1反应
体系 中 ，含 20 ng模 板 DNA，2．0 mmol／L Mg2十、
0．2 mmol／L dNTPs、1．5 U Taq DNA 聚 合 酶 、
0-3[~mol／L随机引物 s1519；扩增程序为：94℃预变
性 5 min，然后 94℃ 30 S，38℃ 50 S，72℃ 1 min，35
个循环，最后 72℃延伸 10 min．4℃保存。对野生百
合乳源居群样本进行扩增，其扩增后的凝胶电泳图
谱 见图 2。
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