全 文 ：收稿日期： 2011–11–21　　　　接受日期： 2012–02–14
基金项目： 国家自然科学基金项目(31000313); 海南省自然科学基金项目(309052)；中央级公益性科研院所业务费专项 (ITBB110201)资助
作者简介： 邱琼(1986~ )，女，在读硕士，研究方向为植物分子学与植物生理学。E-mail: qiuyao198612@163.com
* 通讯作者 Corresponding author. E-mail: zzl_catas@hotmail.com
热带亚热带植物学报　2012， 20(5)： 469~474
Journal of Tropical and Subtropical Botany
NAC 类 转 录 因 子(NAM, ATAF and CUC
transcription factor)是 近 十 多 年 来 发 现 的 植 物
特有的转录调控因子，目前已从矮牵牛(Petunia
hybrida)、拟 南 芥(Arabidopsis thaliana)、小 麦(Triti-
cum aestivum)、水 稻(Oryza sativa)、大 豆(Glycine
max)等植物基因组中相继分离出来。NAC 类转录
因子是一个大家族，仅在拟南芥中就已报道了 110
个成员 , 水稻中也有 140 个[1]。NAC 类转录因子
的 N 端高度保守，含有 NAM 保守结构域，是 DNA
结合和核定位信号部位；C 端为结构多变区，也是
转录激活区域[2–3]。NAC 结构保守域含有 5 个亚区
域，其中 A、C、D 在不同的物种中都是高度保守的，
B、E 区则是多变的。由此推测，亚区域 A、C、D
在 NAC 蛋白功能的发挥中起较重要的作用，这已
在矮牵牛中得到证实 [4]。NAC 类转录因子在植物
的生命活动中发挥重要的作用，包括参与侧根的产
巴西橡胶树HbNAC1基因的克隆和表达分析
邱琼1,2, 朱家红2, 张治礼2,3*
(1. 海南大学农学院，海口 571101； 2. 中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海口 571101； 3. 海南省农业科学院，海口 571000)
摘要： 根据 EST 序列信息，利用 RACE 技术从巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)中克隆了 1 个 NAC 类转录因子基因 HbNAC1，
其 cDNA 全长为 1419 bp，含有完整的开放阅读框，编码 309 个氨基酸。推导的氨基酸序列含有 1 个 NAM 结构域，具有典型
的 NAC 类蛋白的结构特征，与毛果杨(Populus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus communis)、水稻(Oryza sativa)和拟南芥(Arabidopsis
thaliana)中的相应氨基酸序列的同源性分别达 79%、80%、57% 和 60%。聚类分析表明，HbNAC1 属于 NAC 家族Ⅱ亚族。
半定量 RT-PCR 分析表明，该基因在胶乳中的表达较丰富，经乙烯利刺激后其在胶乳中的表达量明显增加。
关键词： 巴西橡胶树； NAC 类转录因子； 乙烯利； 基因表达
doi: 10.3969/j.issn.1005–3395.2012.05.007
Cloning and Expression Analysis of HbNAC1 in Hevea brasiliensi
QIU Qiong1,2, ZHU Jia-hong2, ZHANG Zhi-li2,3*
(1. College of Agriculture, Hainan University, Haikou 57110, China; 2. Institute of Tropical Biotechnology and Bioscience, Chinese Academy of
Tropical Agricultural Sciences, Haikou 571101, China; 3. Hainan Academy of Agricultural Sciences, Haikou 571000, China)
Abstract: Based on EST sequences from an ethephon-induced latex SSH cDNA library of Hevea brasiliensis,
a full-length cDNA, named as HbNAC1, was cloned from H. brasiliensis by RACE-PCR, encoding a NAC
transcription factor. The full-length of HbNAC1 cDNA was 1419 bp with an open reading frame (ORF) of
930 bp, and encoding 309 amino acids. The deduced HbNAC1 with NAM domains had the typical characteristics
of NAC family, and homologous to NACs in Populus trichocarpa, Ricinus communis, Oryza sativa and
Arabidopsis thaliana of 79%, 80%, 57% and 60%, respectively. Phylogenetic analysis showed that HbNAC1 was
classified into the Ⅱ subfamily of NAC family. Semi-quantitative RT-PCR analysis indicated that the expression
of HbNAC1 was rich in latex, and significantly enhanced by ethephon stimulation.
Key words: Hevea brasiliensis; NAC transcription factor; Ethephon; Gene expression
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生和发育[5]、顶端分生组织的形成[6]、花器官分生组
织的发育[7]及叶片衰老[8]等；在抵抗非生物和生物
胁迫中，NAC 基因也发挥着重要的作用[9–12]。
巴 西 橡 胶 树(Hevea brasiliensis)为 大 戟 科
(Euphorbiaceae)三叶橡胶属多年生乔木，原产于南
美洲，生长在热带雨林中，一般定植 7 年后开始割
胶，开采可达 30 年。乙烯利能够刺激橡胶树显著
增产，但关于乙烯利在橡胶树增产过程中的信号转
导、促进胶乳分泌的分子机制等目前仍不清楚[13]。
为深入探讨乙烯利刺激橡胶树增产的分子机制，
我 们 研 究 组 采 用 SSH (Suppression Subtractive
Hybridization)技术构建了乙烯利诱导表达的胶乳
cDNA 文库，通过斑点杂交和测序，获得了 1 个与
NAC 类转录因子家族基因同源性较高、乙烯利诱
导高度表达的 EST——HbEST 30。以此为基础，本
研究对该基因的全长 cDNA 序列进行了克隆，并对
其结构特征和表达特征进行了分析，为探讨该基因
在胶乳再生过程中的作用研究提供科学基础。
1 材料和方法
1.1 材料和试剂
选取种植在中国热带农业科学院实验场的巴
西橡胶树(Hevea brasiliensis)无性系 RRIM600 (7 年
树龄未开割树)，分别在乙烯利处理 0、3、6、12
和 24 h 后采集胶乳并迅速冷冻于液氮中，–80℃
下保存。材料处理参考 Hao 等[14]的方法进行，胶
乳总 RNA 的提取参照张治礼等[15]的方法，叶片、
根、树皮和花总 RNA 的提取参照 TranZol 试剂盒
说明书，叶片 DNA 提取参照傅荣昭等[16]的方法。
TranZol、pEASY-T1 easy Vector 试剂盒购自全式
金 公 司；SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit
购 自 CLONTECH 公 司；IPTG、X-Gal、dNTPs 购
于 Promega 公司；其它生化试剂和常规试剂均为超
纯或分析纯。
1.2 HbNAC1基因的克隆
根据 HbEST 30 全长 572 bp，设计 5′RACE 特异
性引物 GSP1：5′-CGCCATGGAAATGACATGGTG-
CAATAATA-3′ 和 3′RACE 特 异 性 引 物 GSP2：
5′-AAGGGCAAGCTTCAGAGAAGA-3′。参 照
CLOTECH 公 司 提 供 的 SMARTTM RACE cDNA
Amplification Kit 说明书扩增基因的 5′ 和 3′ 端片段，
分别连接到 PEASY-T1 载体上进行测序。根据测
序结果和 HbEST 30 序列，推导出 cDNA 全长序列；
根据推导出的序列，分别在 5′ 端起始密码子的上
游和 3′ 端终止密码子的下游设计特异引物 F1: 5′-
GGCGGATCCATGACATGGTGCAATAATAAC-3′
和 F2: 5′-GCTGTCGACTCTTCTCTGAAGCTTGC-
CCTT-3′，以胶乳 cDNA 为模板扩增目的片段，测序
后与拼接推导结果进行比较。利用网上数据库进
行 BLAST 分析，利用 DNAMAN 软件进行序列比对。
1.3 氨基酸序列分析和系统进化树构建
氨基酸序列分析、信号肽预测、蛋白特征分析
分别采用 http://www.expasy.org 提供的相关软件 ,
在 http://wwww.cbs.dtr.dk/services/signalP 和 http://
www.expasy.ch/cgi-bin/protparam 上 完 成。 不 同 物
种 NAC 类转录因子基因编码的氨基酸序列比对分
析、系统进化树分析采用 DNAMAN 软件完成。
1.4 HbNAC1基因的表达分析
施用乙烯利 0、3、6、12 和 24 h 后，分别采集胶
乳并提取总 RNA；分别提取叶片、根、树皮和花的总
RNA。经反转录后，分别以橡胶树 18S rRNA 为参
照基因进行半定量 RT-PCR 分析。用于半定量 RT-
PCR 分析的目的基因特异引物为 F1 和 F2；18S rRNA
引 物 为 P1: 5′-CAGTGGTCGTACAACTGGTAT-3′
和 P2: 5′-ATCCTCCAATCCAGACACTGT-3′。反应
程序为：94℃预变性 3 min，94℃变性 30 s，55℃
退火 30 s，72℃延伸 1 min，28 个循环后再延伸
7 min。反应结束后取 5 μL 反应液进行 1% 琼脂糖
凝胶电泳检测。
2 结果和分析
2.1 基因的克隆和特征分析
利 用 设 计 的 5′RACE 引 物(GSP1)和 3′RACE
引物(GSP2)对基因 5′ 端和 3′ 端进行扩增，分别获
得了 500 bp 和 300 bp 左右的两个片段。经回收、
克隆和测序 , 这两个片段分别为 542 bp 和 305 bp。
利用 DNAMAN 软件对这 2 个 cDNA 与 HbEST 30
序列进行拼接，获得了 1 个含有完整阅读框架的
cDNA 序列。利用设计的特异引物 F1/F2，以胶乳
cDNA 和叶片 DNA 为模板进行扩增，分别获得两
个大小基本一致的特异片段，测序表明这两个片段
均为 1419 bp，核苷酸序列与拼接结果一致。这表
明，我们获得了目标基因的全长 cDNA 和 DNA 序
第5期 471
列，且证实该基因不含有内含子。该基因 cDNA 全
长 1419 bp，包含一个 930 bp 的开放阅读框，5′ 端
44 bp 的非编码区，445 bp 的 3′ 端非编码区(图 1)，
命名为 HbNAC1。
通过 GenBank 检索发现，该序列编码的氨基
酸序列与毛果杨(Populus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus
communis)、水 稻 和 拟 南 芥 中 相 应 的 NAC 类 转
录因子的氨基酸序列的一致性高达 79%、80%、
57% 和 60% (图 2)。 通 过 检 索 NCBI 的 CDD 数
据 库 发 现，克 隆 基 因 编 码 的 蛋 白 含 有 1 个 核 定
位 序 列(Nuclear Localization Signal, NLS)(序 列 为
MTWCNNNSVDERATQLVT)和 1 个 NAC 家 族 转
录因子特有结构域——170 个氨基酸组成的 NAM
保守结构域(图 2)，因此鉴定其为 NAC 类转录因子
家族成员。
2.2 系统进化分析
Ooka 等[17]通过全基因组分析 , 在拟南芥中发
现了 105 个 NAC 转录因子 , 水稻中发现了 75 个
NAC 成员。通过比较 NAC 结构域的氨基酸序列
和 DNA 结合域保守氨基酸残基的特点，NAC 家
族转录因子可分为两个亚族：Ⅰ组与Ⅱ组。为了
分析 HbNAC1 与 NAC 家族相关转录因子之间的
进化关系，我们选取了拟南芥、毛果杨、蓖麻和水
稻 NAC 家族转录因子进行了同源进化比对。结果
表明，克隆基因编码的蛋白和 RCOM_11172140、
IRPOO3441、ANAC008 等同处于Ⅱ型分支上。利
用 BLAST 进行同源性比对表明，HbNAC1 蛋白与
图 1 HbNAC1 的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列
Fig. 1 Nucleotide sequence of HbNAC1 and deduced amino acid sequence
邱琼等：巴西橡胶树HbNAC1基因的克隆和表达分析
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植物 NAC 转录因子的 ONAC003 类具有最高的相
似性，其中亚结构 E 高度保守，这也符合 ONAC003
类亚组的特征，因此我们认为 HbNAC1 蛋白在进
化关系上属于 NAC 家族转录因子Ⅱ型亚族中的
ONAC003 亚组(图 3)。
2.3 HbNAC1的表达分析
分别提取巴西橡胶树胶乳、叶、树皮、根以及花
的总 RNA，经反转录后进行半定量 RT-PCR 分析。
结果表明，HbNAC1 在所有检测的胶乳和组织器
官中均有表达，但在根和树皮中的表达量相对较
低，胶乳中的表达量最高(图 4)。
分别提取乙烯利处理 0、3、6、12、24 h 后
的胶乳总 RNA，反转录后分别进行半定量 RT-PCR
分析。结果表明，乙烯利处理 12 h 后 HbNAC1 表
达量急剧上升，处理 24 h 后仍维持较高的表达水平
(图 5)。
图3 HbNAC1与不同植物的NAC转录因子的进化分析。ANAC008、
At4g28500、ANAC044、BAB20598、NAC006、AEC06578、
NP194652：拟南芥；RCOM_1172140: 蓖麻; IPR003441: 毛杨果;
AK102794、ONAC041、OsNAC4: 水稻。
Fig. 3 Phylogenetic analysis of HbNAC1 and NAC transcription
factors in other species. ANAC008, At4g28500, ANAC044, NAC006,
AEC06578, NP194652: Arabidopsis thaliana; RCOM_1172140:
Ricinus communis; IPR003441: Populus trichocarpa; AK102794,
ONAC041, OsNAC4: Oryza sativa.
图 2 HbNAC1 与其它 4 种植物 NAC 类转录因子的序列比对。NLS: 核定位信号序列；NAM: NAC 保守结构域。
Fig. 2 Sequence alignment of HbNAC1 and NAC transcription factor in other four plants. NLS: Nuclear localization signal sequences; NAM: NAC
conserved domain.
第5期 473
图 4 HbNAC1 在橡胶树中表达。LA: 胶乳；LE: 叶；B: 树皮；R: 根；F:
花。
Fig. 4 Expression of HbANC1 in Hevea brasiliensis. LA: Latex; LE:
Leaf; B: Bark; R: Root; F: Flower.
图 5 乙烯利刺激对胶乳中 HbNAC1 表达的影响
Fig. 5 Effects of ethephon on expression of HbNAC1 in latex
3 讨论
NAC 家族中某些基因的表达与乙烯信号传导
有关。He 等[18]证实拟南芥中 AtNAC2 基因处于乙
烯信号传导的下游，盐胁迫后 AtNAC2 基因被诱导
表达，但在超量表达乙烯受体基因 NTHK1 的拟南
芥中却受到抑制，并不受 ABA 中间体的影响。Oh
等[19]也证实，辣椒(Capsicum frutescens) CaNAC1 的
表达受乙烯的诱导。本研究结果表明，乙烯利处理
12 h 后，巴西橡胶树胶乳中 HbNAC1 表达量明显
增加，说明 HbNAC1 的表达也受到乙烯利的诱导。
NAC 转录因子在植物响应外界环境的多种抗逆信
号途径中发挥重要的作用。对于 HbNAC1 是否参
与乙烯利刺激橡胶树增产过程中的乙烯信号传导
和抗逆反应还需进一步的研究。
大 量 的 NAC 类 转 录 因 子 参 与 了 拟 南 芥 的
次 生 生 长 过 程，如 VND 家 族(Vascular-related
NAC Domain)[20]、NST 家 族(NAC Secondary Wall
Thickening Promoting Factor)及 XND1/ANAC104
(Xylem NAC Domain)[21] 等。Zhong[22]和 Mitsuda
等[23] 的 研 究 表 明，拟 南 芥 NAC 家 族 中 的 SND1
(Secondary wall-associated NAC Domain protein)在
调控拟南芥纤维次生壁生成中发挥关键性的作用，
NST1/NST3 是拟南芥木质部次生壁合成的关键
调制因子。比对结果表明，HbNAC1 与拟南芥中
SND1 的氨基酸序列有着很高的同源性，HbNAC1
是否参与了橡胶树乳管次生壁的形成也还需进一
步地研究。
Teruyuki 等[24]报 道 拟 南 芥 NAC 类 转 录 因 子
ANAC078 基因编码的蛋白在正常情况下处于与
膜结合的休眠状态，受到强光、高温刺激后释放，
可以上调类黄酮合成相关基因的表达；超量表达
ANACO78，一些类黄酮合成相关的基因被上调表
达。已有研究结果表明，许多转录因子参与了类
黄酮和花青素等次生代谢产物的合成，其中包括
MYB、MYC、bHLH、WRKY 和 NAC 等转录因子。
胶乳是橡胶树的重要次生代谢产物，NAC 类转录
因子 HbNAC1 与胶乳的生物合成关系还需进一步
地研究。
NAC 转录因子有许多重要的生物学功能，近
几年虽已取得较大的进展[5–12,25]，但由于 NAC 类转
录因子的多样性和复杂性，目前对大多数 NAC 类
转录因子的功能并不清楚，许多研究还主要停留在
基因克隆、序列分析、结构鉴定和表达分析等层面。
关于 HbNAC1，我们已经获得了过量表达的转基因
烟草(Nicotiana tabacum)株系，相关的表型观察与
分析、对代谢方面的影响等检测工作还在进行
之中。
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